全 文 ：书西北植物学报!
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!"#$+"%+#! &修改稿收到日期$
!"#$+"+" 基金项目$陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目"
!"#$23%##% #&陕西理工学院科研基金项目"博士启动基金#" 45637#%+## # 作者简介$蒋景龙"
#&*")
#!男!博士!讲师!硕士生导师!主要从事信号分子
8
!
9
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对植物生长发育及抗逆性的影响研究
:+;$. /<1 >. /1+ > =?1 > (## ! #,%-@?; 山黧豆根系对$
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诱导氧化胁迫的生理应答
蒋景龙!李
!
丽!徐
!
皓!赵
!
桦!昝丽霞
"陕西理工学院 生物科学与工程学院!陕西汉中
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#
摘
!
要$以水培 A 苗龄的山黧豆幼苗为材料!向水培溶液中施加不同浓度 8 ! 9 ! 处理山黧豆幼苗 !$B
!分析山黧
豆根系受氧化胁迫的程度与抗氧化系统的应答特征!以揭示山黧豆对氧化胁迫的耐受机制结果显示$" # #随外源 8 ! 9 ! 处理浓度的不断增加!山黧豆幼苗侧根的数目无显著变化!而其根的鲜重则显著降低" ! #同时!根系组织的 内源 8 ! 9 ! 染色范围和程度显著增高!但根尖区域始终保持较低水平的 8 ! 9 ! &相反! 9 ) ( ! 染色范围和程度明显减 少!根尖区域却始终保持较高水平的 9 ) ( ! " % #同期根系抗坏血酸" C4D #含量及过氧化氢酶" DCE #)过氧化物酶 " F97 #与抗坏血酸过氧化物酶" CFG #的活性均表现出了先升高后降低的趋势!而超氧化物歧化酶" 497 #一直表现 为持续上升的趋势研究表明!在外源 8 ! 9 ! 胁迫条件下!山黧豆根系 9 ) ( ! 的积累可能与其生长和活力呈正相关! 而根系 8 ! 9 ! 的积累则与其受氧化胁迫程度呈正相关&低浓度的 8 ! 9 ! 处理可以提高山黧豆抗氧化系统对体内活 性氧的清除能力 关键词$山黧豆&过氧化氢&氧化胁迫&过氧化氢酶&丙二醛
中图分类号$3&$(-&
文献标志码$C ( ) *#"+" , #-.+/0* 1 "2*0*"345.**0./""66" &7#!.6#809650**:2!;-0!< )$
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山黧豆"
!"#$% &(("#)*(5- #是一种全世界广 泛种植的豆科作物!具有很高的蛋白质含量和极强 的耐旱能力!因而成为一些干旱)贫困和人口众多地 区的主要饲料和食物&随着人类对粮食)蛋白质和新 型食物资源需求的日益增长!山黧豆的研究引起了 世界各国学者的重视*#+中国栽培的山黧豆约有 ,( 种!主要为普通山黧豆!分布在东北和西北地区! 为肥饲兼用作物*!+由于山黧豆在各种环境胁迫下 表现出极高的抗逆性!近年越来越多的研究者开始 把它作为一种抗逆性的模式作物来研究 生物胁迫和非生物胁迫"如盐碱)干旱)高温)低 温)重金属或高光强度等#都严重影响植物的生长和 发育!如造成植物体内代谢紊乱)膜系统损伤)光合 作用速率下降以及营养吸收失衡等!同时在植物组 织细胞中积累过量的活性氧" QP<@S/RP?M T> P1 ! X94 #等*%+ X94 是有氧代谢的副产物!由叶绿体) 线粒体的电子传递过程中产生!植物细胞内活性氧 的产生与清除在正常条件下处于动态平衡状态!然 而在逆境胁迫条件下植物体内的活性氧代谢平衡被 打破!从而造成氧化胁迫*$+植物细胞可以通过非
酶系统和抗氧化剂清除过多的
X94
来维持细胞代
谢的氧化还原平衡非酶系统主要是一些抗氧化物
质!如抗坏血酸"
C4D
#)还原型的谷胱甘肽"
648
#)
"
+
生育酚及一些小分子的蛋白&抗氧化酶清除系统
主要包括抗坏血酸过氧化物酶"
CFG
#)过氧化氢酶
"
DCE
#)超氧化物歧化酶"
497
#)谷胱甘肽过氧化
物酶"
6FG
#)过氧化物酶"
F97
#等*(+过氧化氢
"
8
!
9
!
#作为活性氧中的一种!在植物体内扮演着双
重角色!一是植物正常代谢中的有毒副产物!导致植
物的氧化胁迫&二是在各种胁迫条件下作为一种信
号分子发挥信号转导作用*,+
Z<1
等*+用外源
8
!
9
!
处理水培
#!A
苗龄的水稻
,B
!然后分析了水
稻的叶片生理生化反应!并采用蛋白质组学的方法
研究了水稻叶片对
8
!
9
!
处理引起的蛋白质水平变
化!结果发现了细胞防御)氧化还原)信号转导)蛋白
合成与降解)光合和呼吸以及糖类和能量代谢方面
的蛋白参与了水稻叶片对
8
!
9
!
的应答外源施加
8
!
9
!
处理植物时最先受到胁迫的是植物的根系!
包括
Z<1
等众多研究者在施加外源
8
!
9
!
处理后
却均没有以植物的根作为材料进行研究另外!
2/<1
>
等*+在比较山黧豆与豌豆的干旱抗性时发现
山黧豆比豌豆具有更强的抗氧化和渗透调节能力
因此!本研究以抗逆性极强的山黧豆作物作为实验
材料!使用不同浓度
8
!
9
!
处理作为探讨不同程度
氧化胁迫的模型!分析了山黧豆根系在不同氧化胁
迫程度下根系内
8
!
9
!
与
9
)
(
!
的组织化学定位以及
8
!
9
!
和
9
)
(
!
的含量变化!同时也检测了抗氧化系统
的
C0@
含量以及
497
)
DCE
)
F97
)
CFG
的活性变
化规律!为揭示山黧豆对氧化胁迫的耐受机制提供
理论依据
#
!
材料和方法
@-@
!
材料培养
山黧豆种子由兰州大学细胞活动与逆境适应教
育部重点实验室
%"!
课题组提供将山黧豆种子播
种在湿润的蛭石中萌发
$A !然后将萌发的幼苗转至 8?< > =<1A 营养液中培养!每天换 # 次营养液并持续 通入空气! %A 后用于胁迫处理培养室的温度为 !([ % #*[ "白天%夜晚#!空气相对湿度为 *"!光 照时间为 #,B % *B "白天%夜晚#!光照强度为 !(" # ;?= ( ; )! ( 0 )# @-% ! 胁迫处理 将水培的山黧豆幼苗分为 ! 组!一组向 8?< > + =<1A 营养液中分别加入 ( ) #" 和 !";;?= ( 5 )# 8 ! 9 ! 溶液作为处理组!诱导不同程度的氧化胁迫! 另一组仅含有正常的 8?< > =<1A 营养液培养作为对 照组" D] # 8 ! 9 ! 处理 !$B
后分别取对照组与处
理组的山黧豆根系作为实验材料!待侧根数目)根鲜
重)
8
!
9
!
和
9
)
(
!
染色指标测量后!其余每份均取
"-(
>
用锡箔纸包好保存在
)*"[
冰箱中以检测其他
生理指标
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!
$
%
&
%
和
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C
!
%
组织化学定位与染色
本试验分别采用二氨基苯胺"
%
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7CO
#和氮蓝四唑 "
1/SQ?Y=LPSPSQ!
IOE
#染色的方法检测不同氧化胁迫状态下山黧豆
根中内源
8
!
9
!
和
9
)
(
!
的组织分布变化
8
!
9
!
的
7CO
组织化学染色和
9
)
(
!
的
IOE
组织化学染色均
参照
2/等*&+的方法然后依据根系染色范围和
染色程度判断山黧豆根中内源
8
!
9
!
和
9
)
(
!
的组织
分布变化
@-D
!
生理指标测定
8
!
9
!
与
9
)
(
!
的含量测定均参照
2/<1
>
等*+的
方法&
^7C
与
C4D
含量测定分别参照
_`
等*#"+和
/^0BQ<
等*##+的方法&
497
)
DCE
)
F97
)
CFG
活性的检测均参照
2/<1
>
等*#!+的方法
@-E
!
数据处理
实验数据采用
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和
4F44#,-"
软
件进行制图和统计分析
,&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
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%$卷 !! 结果与分析 %A@ !$
%
&
%
引起的氧化胁迫对山黧豆根生长的影响
由表
#
可以看出!随着
8
!
9
!
处理浓度增加!山
黧豆根的鲜重有显著降低的趋势!
(
$!";;?= ( 5 )# 8 ! 9 ! 处理分别比对照显著降低了 *-*) !$-#&和
%!-$," , " "-"( #然而!随着氧化胁 迫程度的不断增强!山黧豆侧根的数目却没有发生 显著变化" , # "-"( #这些结果表明不同程度的氧 化胁迫抑制了根的代谢和生长!造成了根鲜重的显 著减少!但短时期内并没有直接影响侧根的数目 %A% ! 不同氧化胁迫状态下山黧豆根中$
%
&
%
和
&
C
!
%
的组织化学定位分析
7CO
能够与
8
!
9
!
反应生成红褐色物质!因此
红褐色物质的出现就表示
8
!
9
!
在组织内的存在
从图
#
!
C
$7 中可以看出!随着氧化胁迫程度的加 重!山黧豆根中 8 ! 9 ! 染色范围和染色程度均显著 增高!并呈现出 8 ! 9 ! 染色范围从根的顶部向根尖 部位逐渐扩散趋势其中!在对照组和 (;;?= ( 5 )# 8 ! 9 ! 处理组中山黧豆根部组织几乎没有被 7CO 染色!表明没有受到氧化胁迫或处于轻度氧化 胁迫状态下!根的组织内 8 ! 9 ! 的积累程度也较低 "图 # ! C ) O #&但当 8 ! 9 ! 处理浓度增加至 #" 和 !" ;;?= ( 5 )#时!根的组织内 8 ! 9 ! 的积累迅速增加 "图 # ! D ) 7 #!表明此时山黧豆遭受了严重的氧化胁 迫&然而随着氧化胁迫程度的加重!根尖区域却始终 保持较低水平的 8 ! 9 ! 同样! IOE 能够与组织细 胞中的 9 ) ( ! 反应生成深蓝色物质!从而被用来定位 组织中的 9 ) ( ! IOE 的染色结果表明!随着氧化胁 迫程度的加重!山黧豆根中 9 ) ( ! 染色范围和程度明 显地减少!并呈现出 9 ) ( ! 染色范围从根尖向根的上 部逐渐减少的趋势!同时根尖区域始终保持较高水 平的 9 ) ( ! "图 # ! :$
8
#因此!在氧化胁迫程度越来
越严重的情况下!山黧豆根中
8
!
9
!
和
9
)
(
!
的组织
分布却表现出了完全相反的变化趋势
%AB
!
不同氧化胁迫状态下山黧豆根中
$% & % " & C ! % 和 FG= 的积累水平 由表 ! 可以看出!随着氧化胁迫程度的不断增 强!山黧豆根中的 8 ! 9 ! 积累呈现出增加的趋势 与对照组相比! (;;?= ( 5 )# 8 ! 9 ! 处理诱导的氧 化胁迫状态下山黧豆根中的 8 ! 9 ! 积累显著提高了 #"-#!当 8 ! 9 ! 处理浓度达到 #";;?= ( 5 )#时 山黧豆根中的 8 ! 9 ! 积累达到了最高"提高约 %"#!但 !" 和 #";;?= ( 5 )# 8 ! 9 ! 处理组间没有 表现出显著性差异随着氧化胁迫程度的不断增 强!山黧豆根中的 ^7C 积累与 8 ! 9 ! 含量变化趋 势相同"表 ! #同时!山黧豆根中 9 ) ( ! 的积累趋势 却随着氧化胁迫程度的不断增强而逐渐降低!且处 理组均显著低于对照组!表现出与 ^7C 和 8 ! 9 ! 积累相反的趋势这些结果与上述 8 ! 9 ! 和 9 ) ( ! 的 组织化学定位结果基本一致 %-D ! 不同氧化胁迫状态下山黧豆根中抗氧化系统 分析 植物抗氧化系统中的抗氧化物质 CD4 和抗氧 表 @ ! 不同浓度$
%
&
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处理对山黧豆根生长发育的影响
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处理浓度
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测定指标
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侧根数目
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=根的鲜重
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#" %-%a$-< %-,a"-"!#@ !" %&-!(a$-(< %-%(a"-"$"A !! 注$同列不同字母表示不同处理组间在
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EBPA/NNPQP1S1?Q;<==PSSPQ0/1SBP0<;P@?=L;1/1A/@>
1/N/@<1S
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表
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C
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积累的影响
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处理浓度
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蒋景龙!等$山黧豆根系对 8 ! 9 ! 诱导氧化胁迫的生理应答 图 # ! 不同浓度 8 ! 9 ! 处理下山黧豆根中 8 ! 9 ! " C$
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#和
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化酶
DCE
)
F97
和
CFG
均直接或间接参与清除细
胞内产生的过多
8
!
9
!
!而
497
的主要功能则是清
除植物细胞内过量产生的
9
)
(
!
如表
%
所示!随着
8
!
9
!
胁迫处理浓度的升高!山黧豆根中的
CD4
含
量与
DCE
)
F97
和
CFG
的活性总体上均表现出先
升高后降低的趋势!并均在
8
!
9
!
增至
#";;?=
(
5
)#时达到最大值&而
497
活性却一直表现出了持
续升高的趋势与对照组相比!
(;;?=
(
5
)#
8
!
9
!
处理时!只有
DCE
表现出了显著的上升!而
CD4
含量)
F97
和
CFG
均没有显著性变化&当
8
!
9
!
处
理升高至
#"
和
!";;?=
(
5
)#时!
CD4
含量及
DCE
)
F97
)
CFG
和
497
活性均显著高于对照以
*&#
西
!
北
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植
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物
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报
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%$卷 上结果说明!在轻度的氧化胁迫条件下!山黧豆根仍 然具有较高的抗氧化胁迫能力&而当氧化胁迫较为 严重" 8 ! 9 ! 处理升高至 !";;?= ( 5 )# #时!所有的 抗氧化生理指标均表现出了下降趋势!这时的氧化 胁迫程度可能超出了抗氧化系统维持活性氧代谢平 衡的能力范围 % ! 讨 ! 论 严格调控植物细胞中 8 ! 9 ! 水平的相对稳定对 于防止细胞伤害)维持各种逆境条件下植物细胞中 的氧化还原平衡起着重要作用*#%+因此!氧化代谢 平衡是植物适应逆境胁迫的重要途径! 8 ! 9 ! 的代 谢也是植物对逆境胁迫的原初反应*#$+本试验建
立了以
8
!
9
!
作为氧化剂诱导植物根系氧化胁迫研
究的模型!分析了
8
!
9
!
处理浓度与山黧豆根系遭
受氧化胁迫程度之间的相关性以及山黧豆根系在不
同氧化胁迫状态下抗氧化系统的变化规律结果发
现!随
8
!
9
!
胁迫不断增强!山黧豆的根系生长受到
明显抑制!而侧根的数目却没有发生显著性的变化
据报道!豌豆在低氧胁迫
#"*B
时主根和侧根均腐
烂!而山黧豆侧根则生长良好由此可见!山黧豆在
不利环境中具有更强的适应性
8
!
9
!
和
9
)
(
!
染色与含量检测结果表明!随
8
!
9
!
处理浓度的不断增加!山黧豆根系中的内源
8
!
9
!
和
9
)
(
!
含量变化呈现出完全相反的趋势!即
8
!
9
!
的含量显著升高和
9
)
(
!
含量显著降低
9
)
(
!
主要由电子传递链上电子泄露所致!是导致自由基
连锁反应的启动者*#(+在根组织细胞中线粒体是
细胞内产生超氧阴离子自由基最多的地方!并且
9
)
(
!
的产生速率与线粒体的呼吸作用成正比关系!
也与线粒体的膜流动性呈正相关*#,+#+因此!在植
物遭受严重氧化胁迫情况下!根系组织的生长及细
胞的代谢受到明显抑制!产生的
9
)
(
!
减少李金亭
等*#*+用
"-"(
#
;?=
(
5
)#
8
!
9
!
溶液处理小麦时!发
现叶片中的
9
)
(
!
含量与对照组相比明显降低陈沁
等*#&+用
#";;?=
(
5
)#
8
!
9
!
处理大麦后!发现大
麦根系细胞中的线粒体膜的流动性明显下降!从而
降低根细胞的呼吸速率以上结果表明根的活力和
组织细胞内的呼吸代谢强弱与
9
)
(
!
产生的多少呈正
相关在
497
的催化下
9
)
(
!
可以转变为
8
!
9
!
!但
8
!
9
!
不仅仅通过
497
还原
9
)
(
!
来产生!还可以通
过其他的途径如抗坏血酸"
C4D
#)硫醇)硫氧还原蛋
白或者其他物质产生*!"+在氧化胁迫愈加严重的
情况下!多余的
9
)
(
!
转变成了
8
!
9
!
!故山黧豆根系
组织
8
!
9
!
含量逐渐升高!根系组织内源
8
!
9
!
染
色范围和程度也随之显著增高根尖是分生组织!
受氧化胁迫影响较小!能保持较低水平
8
!
9
!
&而与
其他组织相比!根尖组织的代谢活力较旺盛!仍保持
较高水平的
9
)
(
!
因此!山黧豆根系
8
!
9
!
含量与其
受氧化胁迫程度呈正相关!氧化胁迫越严重!
8
!
9
!
含量就越高&而其
9
)
(
!
含量则与根系组织的活力和
代谢呈正相关!氧化胁迫越严重!根生长就会受到抑
制!
9
)
(
!
含量就越低李俊容等*!#+用
8
!
9
!
溶液处
理拟南芥"包括野生型和突变体#诱导氧化胁迫!然
后用
7CO
染色法进行拟南芥叶片中
8
!
9
!
的定位!
结果发现内源
8
!
9
!
含量也显著升高丙二醛
"
^7C
#除了能够反映细胞膜的流动性和损害程度
外!也经常被用来判断植物遭受氧化胁迫的严重程
度*!!+本研究表明!随
8
!
9
!
处理浓度的不断增
加!山黧豆根系内的
^7C
含量也明显地提高!表明
山黧豆根系遭受了越来越严重的氧化胁迫
植物对不同程度氧化胁迫导致植物体内
8
!
9
!
含量的积累具有一定的控制能力!植物通过长期的
进化使它在外部环境的变化中能够进行迅速和灵活
的生理响应轻度的氧化胁迫可以通过加强植物的
防御生理响应)增强代谢系统的活动能力以及诱导
特定基因表达等来维持体内的代谢平衡*!%+!$+本 研究表明随 8 ! 9 ! 处理浓度的不断增加!抗坏血酸 " C4D #含量及过氧化氢酶" DCE #)过氧化物酶 " F97 #与抗坏血酸过氧化物酶" CFG #的活性均表 现出了先升高后降低的趋势!这表明轻度的氧化胁 迫提高了山黧豆的 X94 清除能力!增强了抗氧化酶 的活性!积累了更多的抗氧化物质但随 8 ! 9 ! 处 理浓度增至 !";;?= ( 5 )#时氧化胁迫已经较为严 重!超出了抗氧化系统自我调节的范围!抗氧化系统 活性又表现出了明显的下降趋势王琳等*!(+也认 为外源性添加高浓度的 8 ! 9 ! !对于植物来说是一 种胁迫!会破坏植物体内的正常代谢进而影响植物 的生长与发育!而低浓度的 8 ! 9 ! 预处理可以有效 提高作物对环境胁迫的耐受性!显著地提高了黑豆 根和叶片中 497 和 F97 的活性吴国荣等*!,+研 究证实适宜浓度 8 ! 9 ! 预处理盐泽螺旋藻诱导提高 了其 497 ) DCE 和 F97 的活性!有效地抑制了藻 细胞内 9 ) ( ! 的积累!这与本研究中 ($
#";;?=
(
5
)#
8
!
9
!
胁迫下山黧豆根系的表现结果一致
综上所述!山黧豆在遭受不同程度的氧化胁迫
过程中!山黧豆根系中的内源
8
!
9
!
和
9
)
(
!
含量变
&&#
&
期
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蒋景龙!等$山黧豆根系对
8
!
9
!
诱导氧化胁迫的生理应答
化呈现出完全相反的趋势根的活力和组织细胞内
的呼吸代谢强弱影响
9
)
(
!
的产生!而
8
!
9
!
的含量
则与其受氧化胁迫程度呈正相关同时!也进一步
证实了低浓度的
8
!
9
!
处理可以提高抗氧化系统对
X94
的清除能力!而高浓度的
8
!
9
!
会导致胁迫发
生!破坏植物体内的正常代谢!进而影响植物的正常
生长与发育
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