全 文 ：文章编号:1000-5404(2012)15-1527-06 论著
珠子参总皂苷通过促进 Nrf2 转位拮抗新生大鼠心肌细胞氧化应激损伤
贺海波1，石孟琼2，罗 涛3，陈良金2，周继刚3，张继红3，卢训丛2 (443002 湖北 宜昌，三峡大学:天然产物研究与利用
湖北省重点实验室1，医学院基础医学实验中心2，中医临床医学院内科住院部3)
［摘要］ 目的 观察珠子参总皂苷 H2O2所致氧化应激损伤保护效应并探讨其机制。方法 Wistar乳鼠心肌细胞原
代培养，用 H2O2建立氧化应激损伤模型，然后用珠子参总皂苷(100、200 μg /ml)孵育 24 h 后，观察细胞搏动频率，MTT 法
检测珠子参总皂苷对细胞活力的影响，流式细胞仪和 Hoechst33258 染色检测珠子参总皂苷对氧化应激诱导细胞凋亡及胞
内 ROS含量的影响，比色法测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量，同时检测培养液中超氧化物歧化酶
(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)含量，实时定量 PCR 技术检测珠子参
总皂苷对 SOD /GPX /CAT反应系统 SOD1、SOD2、SOD3、CAT和 GPX1 基因表达的影响，Western blot 检测珠子参总皂苷对
细胞质和细胞核 Nrf2 蛋白表达的影响。结果 H2O2明显影响细胞活力和诱导凋亡(IC50为 500 μmol /L) ，珠子参总皂苷
(100、200 μg /ml)处理能显著增加心肌细胞搏动频率和存活率(P ＜ 0． 01) ，抑制心肌细胞凋亡和改善细胞形态，降低细胞
内 ROS含量(P ＜ 0． 01) ;减轻 H2O2所致乳鼠心肌细胞培养液中 LDH、CK 释放量，同时能够升高 SOD、CAT 和 GSH-Px 活
性，降低 MDA含量(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ;上调 SOD /GPX /CAT 反应系统基因表达水平和促进 Nrf2 核移位，增加心肌细胞
核内 Nrf2 的表达水平(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)。结论 珠子参总皂苷抑制心肌细胞氧化应激损伤，与 Nrf2 抗氧化途径的激活
和清除 ROS有关。
［关键词］ 珠子参总皂苷;过氧化氢;心肌细胞;转录因子 Nrf2;氧化应激;保护机制
［中图法分类号］ R285． 5;R363． 13;R542． 2 ［文献标志码］ A
［通信作者］ 石孟琼，E-mail:shmq0212@ 126． com
Total saponin from Rhizoma Panacis majoris protects neonatal rat cardiomyocytes
against oxidative stress-induced injuries by improving Nrf2 translocation
He Haibo1，Shi Mengqiong2，Luo Tao3，Chen Liangjin2，Zhou Jigang3，Zhang Jihong3，Lu Xuncong2(1Hubei Key Labora-
tory of Natural Products Research and Development，2 Experimental Center of Basic Medicine，Medical College，3Department of Internal
Medicine，Clinical Hospital of Traditional Chinese Medicine，Three Gorges University，Yichang，Hubei Province，443002，China)
［Abstract］ Objective To determine the effect of total saponin from Rhizoma Panacis majoris on the
oxidative stress-induced injuries in neonatal rat cardiomyocytes． Methods Neonatal rat cardiomyocytes were
primarily isolated from 1- to 3-day-old Wistar rats and then treated with H2 O2 at the IC50 of 50% to induce
Oxidative stress-induced injury． The injuried cells were then treated with the total saponin (100 and
200 μg /ml)for 24 h． The beating rates of cardiomyocytes were observed by inverted microscopy，viability of
cells and oxidative stress-induced apoptosis measured by by MTT assay，cell apoptotic rate and ROS content
detected by flow cytomety，and apoptosis morphous of cells were observed by hoechst33258 through fluorescence
microscopy． The levels of superoxide dismutase (SOD) ，glutathione peroxidase (GSH-Px) ，hydrogen peroxi-
dase (CAT) ，malondialdehyde (MDA) ，lactate dehydrogenase (LDH) ，and creatine kinase (CK)in the
culture medium were also measured． Real-time polymerase chain reaction was applied to detect the mRNA
expression of SOD10-SOD3，CAT and GPX1 antioxidative genes，and expression of Nrf2 in the cell cytoplasm
and nucleus were detected by Western blotting． Results H2O2 at the concentration of 200 to 800 μmol /L
significantly inhibited the viability and apoptosis of cells (IC50 = 500 μmol /L)． Total saponin from Rhizoma
Panacis majoris (100 and 200 μg /ml)significantly increased the beating rates of cardiomyocytes and cell
viability (P ＜ 0． 01) ，reduced the apoptosis rate，improved apoptosis morphous，decreased intra-cellular ROS
contents (P ＜ 0． 01) ，improved the activities of SOD，GSH-Px and CAT，and decreased the levels of LDH，CK
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DOI:10.16016/j.1000-5404.2012.15.001
and MDA (P ＜ 0． 05，P ＜ 0. 01)． Moreover，the mRNA expression of SOD1-SOD3，CAT and GPX1 in the
cardiomyocytes was decreased remarkably in the model group，while they were up-regulated in total saponin-
treatment groups (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)． The protein expression of Nrf2 in the nucleus were significantly
increased compared with model group (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)after treatment with the total saponin． Conclusion
Total saponin from Rhizoma Panacis majoris effectively inhibits oxidative stress-induced injuries of cardio-
myocytes by activating anti-oxidative pathway of Nrf2 and removing ROS．
［Key words］ total saponin from Rhizoma Panacis majoris;H2 O2;cardiomyocytes;Nrf2;oxidative
stress;protection mechanism
Corresponding author:Shi Mengqiong，E-mail:shmq0212@ 126． com
缺血性心肌损伤是由于冠状动脉受损或受阻引起
心脏供血、供氧不足而导致的心脏损伤，它不但可引起
急性心功能不全、心肌梗死，而且有可能慢性化演变成
扩张型心肌病，最终导致充血性心力衰竭。在缺血性
心肌病的发生和发展中，氧化应激扮演着重要的角
色［1］。近年来研究发现 NF-E2 相关因子 2(nuclear
factor-erythroid 2-related facor 2，Nrf2)是细胞抗击氧化
应激的中枢调节者，它通过上调Ⅱ相抗氧化酶和蛋白
的表达而发挥对氧化应激的保护作用［2］。珠子参具
补肺养阴，祛瘀止痛，止血之功，主要用于气阴两虚、烦
热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节痹痛、咯血、吐血、衄
血、崩漏、外伤出血等症［3］。研究［4］表明，珠子参总皂
苷体外可抑制 HL-60 细胞增殖和诱导其分化作用;在
体对心肌缺血再灌损伤具有较好的保护作用［5］。我
们在前期研究［6］中发现珠子参总皂苷对小鼠局灶性
脑缺血损伤有明显保护作用，并初步证实了抗氧化损
伤可能是其作用机制之一，但有关珠子参总皂苷抗氧
化损伤的分子机制尚不清楚。本实验拟在此基础上，
以新生大鼠心肌细胞为研究对象，建立 H2O2致氧化应
激损伤模型，探讨珠子参总皂苷对心肌细胞氧化应激
损伤的影响及其作用机制，旨在为其用于缺血性心脏
病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
实验动物为出生 1 ～ 3 d 的 Sprague Dawley大鼠，SPF级，雌
雄不拘，由三峡大学实验动物中心提供，合格证:SCXK(鄂)
2011-0012。珠子参总皂苷由三峡大学天然产物研究与利用湖
北省重点实验室提供，纯度为 96． 5%，批号:20110724;双氧水
(H2O2，北京化工) ;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico) ;
四甲基偶氮唑盐(MTT)、2-7-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-
DA，Sigma) ;Hoechst33258(凯基生物) ;Annexin V /FITC(晶美
生物) ;乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超
氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化
氢酶(CAT)测定试剂盒(南京建成) ;SOD1、SOD2、SOD3、谷胱
甘肽过氧化物酶 1(GPX1)、CAT 以及 GAPDH(上海生工合成，
引物序列见表 1) ;Trizol和 DEPC(上海生工) ;Prime ScriptTM RT
reagent Kit、Taq DNA 聚合酶 (大连宝生物) ;Nrf2 抗体 (Bio-
world公司) ;β-actin抗体 (北京博奥森) ;羊抗兔二抗 (北京中
杉金桥) ;蛋白抽提试剂盒、ECL 发光试剂盒、蛋白含量测定试
剂盒 (碧云天) ;其他试剂均为市售分析纯。
表 1 实时定量 PCR引物序列
基因名称 引物序列 基因片段长度 (bp)
SOD1 上游:5-CAGGGCGTCATTCACTTC-3
下游:5-CCAAGTCATCTTGTTTCTCG-3
205
SOD2 上游:5-GGACGCCGCAGAGCAGAC-3
下游:5-GCCCCCGCCTTGAACTT-3
360
SOD3 上游:5-GAACCTCAGCCATGGTGG-3
下游:5-GCTTAAGTGGTCTTGCAC-3
185
GPX1 上游:5-TTGTTACTGAATGGCGGCGATGTT-3
下游:5-GCGGGGGTGCTTGTTTATGG-3
357
CAT 上游:5-CGTATCGAGAGCAAGGAAGC-3
下游:5-CAGAGCATGATTAGGCAAACT-3
319
GAPDH 上游:5-GCTGGGGCTCACCTGAAGG-3
下游:5-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3
343
1． 2 方法
1． 2． 1 新生大鼠心肌细胞的培养 取 1 ～ 3 d的Wistar大鼠
乳鼠，在无菌条件下，取出心脏剪刀破碎至 1 mm × 1 mm ×
1 mm 大小，加入约心脏 10 倍体积用胰酶和胶原酶的混合酶分
次消化，然后加入 15%胎牛血清终止消化，1 000 r /min 离心
5 min，弃上清，用含 15%血清的 DMEM 培养液重悬，接种于培
养瓶中，在 37 ℃，CO2孵箱中培养 1． 5 h，用差速贴壁法去除成
纤维细胞后，用含 15%胎牛血清的 DMEM 培养液稀释至所需
的细胞密度，接种到 96 孔培养板(细胞密度 5 × 104 /ml，)或 6
孔培养板(细胞密度 3 × 105 /ml)中，于 37 ℃，CO2孵箱中培养。
待细胞融合贴满瓶底，且有节律同步搏动时，然后进行分组和
给药实验。
1． 2． 2 珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞的实验 为了考
查珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活性是否存在潜在的影
响，我们先进行珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活力的潜在
影响测试。取在 96 孔板中培养的原代心肌细胞，贴壁后，分别
加入不同浓度(0、25、50、100、250、500、1 000 μg /ml)珠子参总
皂苷，孵育 24 h，测定细胞活力。具体方法:孵育完毕后，向各
孔细胞中加入 20 μl MTT(5 g /L) ，继续培养 4 h，弃去培养液，
加入 150 μl DMSO溶液，振荡 10 min，然后用酶标仪测定波长
570 nm的光密度值 D(570) ，按下式求得心肌细胞的存活率:存
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活率 =［各组细胞 D(570)/正常组细胞 D(570) ］× 100%。
1． 2． 3 H2O2 对新生大鼠心肌细胞氧化损伤浓度的确定
取在 96 孔板中培养的原代心肌细胞，加入不同浓度 H2 O2(0、
200、400、600、800 μmol /L) ，空白对照组只加入培养基，作用
2 h，然后测定心肌细胞活力，检测方法同 1． 2． 2。H2 O2的 IC50
值为细胞活力为 50%时 H2O2的浓度，以下进行实验时 H2O2致
氧化应激损伤模型按照此浓度进行。
1． 2． 4 珠子参总皂苷对 H2O2 致氧化损伤的实验
1． 2． 4． 1 实验分组 接种于 96 或 6 孔培养板中的心肌细
胞采用完全随机设计分组法分为正常组、模型组、珠子参总皂
苷低和高剂量组;模型组和珠子参总皂苷治疗组先用 1． 2． 3 实
验确定的 H2O2浓度作用 2 h，更换培养液后，珠子参总皂苷低、
高剂量组分别加入 100、200 μg /ml珠子参总皂苷，孵育 24 h，然
后进行相应的实验。
1． 2． 4． 2 珠子参总皂苷对 H2O2 所致心肌细胞损伤细胞形态
和搏动频率的影响 将上述接种在 6 孔培养板中的各组心
肌细胞经过相应处理后，于显微镜下观察心肌细胞的形态及自
发搏动性。并计数各组心肌细胞搏动的频率和节律。
1． 2． 4． 3 心肌细胞存活率 接种于 96 孔培养板中的各组
心肌细胞经过相应处理后，进行细胞活力测定，检测方法同
1. 2. 2。
1． 2． 4． 4 生化指标的测定 按照试剂盒说明书，测定心肌
细胞培养液中 LDH、CK和 MDA、GSH-Px、CAT、SOD的水平。
1． 2． 4． 5 DCFH-DA染色法检测细胞内 ROS量 各组心肌细
胞经过相应处理后，用 0． 02% EDTA消化细胞，用无血清培养基
重悬，终浓度 10 μmol /L的 DCFH-DA 37 ℃孵育 1 h，用 PBS清洗
2遍，每个样品收集 1 ×104细胞进行流式细胞仪检测。
1． 2． 4． 6 Hoechst33258 检测凋亡细胞形态 将处理过的细
胞用 0． 125%胰蛋白酶消化后收集，用 37 ℃的 PBS 冲洗 24 孔
板 2 次，加入 1 ml的 4%多聚甲醛于 4 ℃固定 10 min，自然晾
干，每孔加入终浓度为 10 mg /L 的 Hoechst33258 染液 100 μl，
室温避光染色 10 min，水冲净晾干，激发光波长 450 nm，发射光
波长 490 nm。荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。
1． 2． 4． 7 流式细胞仪检测细胞凋亡 各组心肌细胞经过相应
处理后，用 0． 02% EDTA 消化细胞，制备细胞悬液，1 000 r /min
离心 7 min，弃上清液，PBS 洗涤，收集细胞;用 Annexin V-FITC
试剂盒中 binding buffer悬浮细胞，调节细胞浓度为 1 × 106 /ml，
取 100 μl上述细胞，分别加入 PI 和 Annexin V-FITC，混匀后室
温避光 15 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。
1． 2． 4． 8 实时定量 PCR 检测 用 Trizol 试剂提取心肌细胞
总 RNA，将提取的 RNA反转录为 cDNA;在反应管中加入 SYBR
Premix Ex TaqTMⅡ (2 ×)12． 5 μl，PCR正义引物 1 μl，PCR 反
义引物 1 μl，DNA 模板 2 μl，灭菌蒸馏水 8． 5 μl，最终反应体系
为 25 μl。放入实时定量 PCR 扩增仪中按 95 ℃预变性 30 s、
95 ℃ 变性 5 s、退火 30 s、72 ℃延伸 20 s条件扩增 40 次。利用
PCR仪绘出扩增曲线，进行结果分析。
1． 2． 4． 9 Western blot 检测 Nrf2 蛋白水平 按照细胞质-核
蛋白提取试剂盒说明，提取心肌细胞质蛋白和核蛋白，进行蛋
白定量后，加样品缓冲液煮沸 5 min，各取 20 μl加样;10%聚丙
烯酰胺凝胶，在 120 V、28 mA 条件下电泳 1． 5 h;100 mA 条件
下 PVDF膜转膜 3 h;5%脱脂牛奶封闭，滴加 Nrf2 一抗(1∶ 50) ，
4 ℃过夜;用含 0． 1% Tween 20 的 TBS 冲洗 5 min × 3 次，再加
二抗(1∶ 500)室温下孵育 2 h，用 0． 1% TBST 冲洗 15 min × 3
次，ECL发光检测，X 线片显影，扫描图像，测得各条带的灰度
值，以 β-actin为内对照标准化后，比较其表达量的变化。
1． 3 统计学分析
每项实验至少重复 3 次，所有实验结果的数据以 珋x ± s 表
示，所有数据分析在 SPSS 13． 0 统计软件上进行单因素方差分
析及 LSD-t检验。
2 结果
2． 1 珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活性的影响
通过用 MTT法进行珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活
性分析，我们发现在珠子参总皂苷在 25 ～ 1 000 μg /ml 浓度范
围内孵育 24 h，对新生大鼠心肌细胞没有明显的细胞毒性，相
反，珠子参总皂苷还可以提高心肌细胞细胞活力近 40%，与空
白组(珠子参总皂苷 0 μg /ml)比较具有显著性差异(P ＜ 0． 05，
P ＜ 0． 01，图 1)。
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
细
胞
活
力
0 25 50 100 250 500 1 000
珠子参总皂苷浓度（μg/ml）
a a
b
b b
a:P ＜ 0． 05，b:P ＜ 0． 01，与空白组(珠子参总皂苷 0 μg /ml)比较
图 1 不同浓度珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活性的影响
2． 2 H2O2对新生大鼠心肌细胞活性的影响
H2O2(200 μmol /L)处理细胞 2 h后，细胞大部分存活，活力
为 94． 12%，随着H2O2剂量的升高(400 μmol /L和 600 μmol /L) ，
细胞活力显著下降，分别为 70． 48%和 43． 63%，至处理浓度
800 μmol /L 时，细胞大部分死亡，细胞活力仅为 21． 17%。H2O2
的半数致死浓度(IC50值)约为 500 μmol /L。
2． 3 珠子参总皂苷对 H2O2所致心肌细胞损伤细胞形
态和搏动频率的影响
新生大鼠心肌细胞在经过 H2O2损伤后，模型组心肌细胞
质空泡形成，细胞伪足收缩或消失，折光率下降，异形心肌细胞
数目增加并有大量细胞脱落、悬浮、溶解坏死;用珠子参总皂苷
处理后可见少量的心肌细胞伪足回缩，细胞脱落、悬浮和溶解
坏死现象，但损伤程度较模型组显著减轻，且死亡细胞明显减少
(图 2) ;通过进行细胞搏动频率分析，我们发现正常组心肌细胞
搏动频率为(96． 4 ±3． 5)/min，用 H2O2损伤后，模型组心肌细胞
的搏动频率降至(24． 3 ±6． 2)/min，与正常组比较具有显著性差
异(P ＜0． 01) ;用珠子参总皂苷(100、200 μg /ml)处理后细胞搏
动频率分别恢复为(69． 4 ±4． 9)、(75． 7 ± 5． 9)次 /min，与模型组
比较具有显著性差异(P ＜ 0． 01)。
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A B
C D
100 μl 100 μl
100 μl 100 μl
A:正常组;B:模型组;C:珠子参总皂苷低剂量组;D:珠子参总皂苷
高剂量组
图 2 显微镜观察珠子参总皂苷对 H2O2所致各组新生大鼠心肌细胞
损伤细胞形态的变化
2． 4 珠子参总皂苷对 H2O2所致新生大鼠心肌细胞损
伤细胞活性的影响
模型组心肌细胞经 H2O2损伤后细胞活性明显下降(0． 43 ±
0. 06) ，与正常组(0． 88 ± 0． 09)比较有显著性差异(P ＜ 0. 01) ;
用珠子参总皂苷(100、200 μg /ml)处理后，受 H2O2损伤的心肌
细胞活性变为(0． 66 ± 0． 05)和(0． 70 ± 0． 07) ，分别提高了
49. 7%和 59． 1%，与模型组比较具有显著性差异(P ＜ 0． 01)。
2． 5 珠子参总皂苷对 H2O2所致新生大鼠心肌细胞氧
化应激损伤的影响
与正常对照组相比，模型组心肌细胞培养液中 MDA 含量
显著升高，LDH 和 CK 活性明显增强(P ＜ 0． 01) ，而 GSH-Px、
CAT和 SOD活性明显降低(P ＜ 0． 01) ，实验结果显示心肌细胞
在用 H2O致氧化应激后，对心肌细胞造成了损伤;用珠子参总
皂苷(100、200 μg /ml)处理后可使培养液中 MDA含量和 LDH、
CK活性显著降低，GSH-Px、CAT和 SOD活性明显升高，与模型
组比较具有显著性差异(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)。其中以珠子参
总皂苷高剂量更为显著(表 2)。
表 2 珠子参总皂苷对 H2O2所致各组新生大鼠心肌细胞氧化应激
损伤的影响(μmol /L，珋x ± s)
组别 LDH CK MDA GSH-Px CAT SOD
正常组 31．68 ±4．78 11．57 ±3．18 10．85 ±2．76 75．11 ±5．42 19．88 ±1．54 98．51 ±3．49
模型组 54．99 ±5．01a 39．19 ±4．55a 26．91 ±3．17a 49．34 ±4．54a 9．27 ±2．53a 68．83 ±4．07a
珠子参总皂苷组
低剂量 43．93 ±4．66b 30．52 ±2．17b 17．26 ±1．83c 59．26 ±3．41b 14．58 ±2．18b 78．44 ±4．51b
高剂量 40．53 ±3．04c 23．34 ±3．44c 15．82 ±2．66c 63．10 ±3．01c 16．10 ±3．35b 82．71 ±3．37c
a:P ＜ 0． 01，与正常组比较;b:P ＜ 0． 05，c:P ＜ 0． 01，与模型组比较
2． 6 珠子参总皂苷对 H2O2所致新生大鼠心肌细胞氧
化应激损伤细胞内 ROS的影响
新生大鼠心肌细胞经 H2O2处理后，模型组细胞内的 ROS
急剧增加［荧光强度为(58． 83 ± 4． 07) ］，与正常组［荧光强度
为(13． 97 ± 3． 31) ］比较，具有显著性差异(P ＜ 0． 01) ;用珠子
参总皂苷(100、200 μg /ml)处理后，荧光强度分别降为(32． 79 ±
2． 62)和(29． 63 ± 2． 88) ，与模型组比较具有显著性差异
(P ＜ 0． 01)。
2． 7 珠子参总皂苷对 H2O2所致新生大鼠心肌细胞氧
化应激损伤细胞凋亡形态的影响
各组心肌细胞经过相应处理，经 Hoechst33258 染色之后，
于荧光显微镜下观察，正常组细胞核为染色均匀，形状规则的
椭圆形核;模型组细胞核呈现凋亡细胞典型的核固缩浓染，染
色质边缘化，并可见 DNA 在核小体间断裂，形成凋亡体;用珠
子参总皂苷(100、200 μg /ml)处理后凋亡细胞数量少于模型
组，大部分细胞染色质呈弥漫均匀低强度荧光，核固缩细胞数
目显著减少，染色质边聚和核碎片减少，大多数细胞核形态趋
于正常(图 3)。
A B
C D
100 μl 100 μl
100 μl 100 μl
A:正常组;B:模型组;C:珠子参总皂苷低剂量组;D:珠子参总皂苷
高剂量组
图 3 荧光显微镜观察珠子参总皂苷对 H2O2所致各组新生大鼠心肌
细胞氧化应激损伤凋亡细胞形态变化 (↑:凋亡体)
2． 8 珠子参总皂苷对 H2O2所致新生大鼠心肌细胞凋
亡的影响
正常组心肌细胞凋亡率小于 5%，说明正常组心肌细胞也
有少量细胞发生凋亡。模型组细胞凋亡率(35． 49 ± 4. 18)%，
明显高于正常组(P ＜ 0． 01) ;珠子参总皂苷(100、200 μg /ml)处
理后细胞凋亡率分别为(27． 39 ± 3． 49)%和(19. 47 ± 4． 68)%，
与模型组比较具有显著性差异(P ＜ 0． 01)。
2． 9 珠子参总皂苷对 H2O2所致心肌细胞氧化应激损
伤心肌细胞 SOD、GPX1 和 CAT基因表达的影响
与正常组相比，模型组心肌细胞中 SOD1、SOD2、SOD3、
GPX1 和 CAT mRNA表达明显下降(P ＜ 0． 01) ;珠子参总皂苷
(100、200 μg /ml)处理后可使 H2O2所致心肌细胞氧化应激损
伤心肌细胞中 SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 和 CAT mRNA 水平改
善，与模型组比较具有显著性差异(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ，而且
其改善作用随剂量的增加而增强(图 4，表 3)。
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1 2 3 4 5 6 M
←500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
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1:SOD1;2:SOD2;3:SOD3;4:GPX1;5:CAT;6:GAPDH;M:标准
图4 珠子参总皂苷100、200 μg /ml处理后 SOD、GPX1、CAT的电泳结果
表 3 珠子参总皂苷对 H2O2所致各组新生大鼠心肌细胞氧化应激损伤
心肌细胞 SOD、GPX1 和 CAT基因表达的影响(μmol /L，珋x ± s)
组别 SOD1 SOD2 SOD3 GPX1 CAT
正常组 1． 18 ±0． 07 1． 40 ±0． 07 1． 27 ±0． 06 0． 96 ±0． 07 1． 39 ±0． 05
模型组 0． 79 ±0． 07a 0． 97 ±0． 06a 0． 87 ±0． 03a 0． 68 ±0． 06a 1． 03 ±0． 05a
珠子参总皂苷组
低剂量 0． 94 ±0． 06b 1． 17 ±0． 05c 0． 98 ±0． 06b 0． 86 ±0． 05c 1． 16 ±0． 06b
高剂量 1． 03 ±0． 06c 1． 24 ±0． 07c 1． 11 ±0． 08c 0． 89 ±0． 04c 1． 22 ±0． 05c
a:P ＜ 0． 01，与正常组比较;b:P ＜ 0． 05，c:P ＜ 0． 01，与模型组比较
2． 10 珠子参总皂苷对 H2O2所致心肌细胞氧化应激
损伤心肌细胞 Nrf2 蛋白表达的影响
由图 5 可知，实验各组心肌细胞质中 Nrf2 蛋白表达水平无
明显差别(P ＞ 0． 05)。在细胞核中可见正常组细胞核中 Nrf2
表达较少，模型组胞核中 Nrf2 表达较正常组有所增加，但没有
统计学差异(P ＞ 0． 05) ;珠子参总皂苷(100、200 μg /ml)处理后
可使细胞核中 Nrf2 蛋白表达水平升高，与模型组比较具有显著
性差异(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ，其中以珠子参总皂苷高剂量更为
显著。
1 2 3 4
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Nr
f2
/β
蛳a
ct
in
蛋
白
表
达
细胞质 Nrf2
细胞核 Nrf2
1 2 3 4
细胞核Nrf2（57×103）→
细胞质Nrf2（57×103）→
β蛳actin（42×103）→ 髿
鬀
组别
a
b
c
A:Western blot检测结果;B:半定量分析结果
1:正常组;2:模型组;3:珠子参总皂苷低剂量组;4:珠子参总皂苷
高剂量组
a:P ＜ 0． 01，与正常组比较;b:P ＜ 0． 05，c:P ＜ 0． 01，与模型组比较
图 5 珠子参总皂苷对 H2O2所致各组新生大鼠心肌细胞氧化
应激损伤心肌细胞 Nrf2 蛋白表达的影响
3 讨论
当前心血管疾病已成为除脑血管疾病及恶性肿瘤
以外的人类三大死亡原因之一，积极开展对缺血性心
肌损伤的防治及深入研究，一直以来是医学领域关注
的重点。而细胞水平进行心肌保护研究已成为近年来
的热点，其最大优点在于排除了在体心脏研究中神经
因素和体液因素的影响［7］。因此，本实验选取了体外
培养的新生大鼠心肌细胞作为观察对象，研究珠子参
总皂苷处理对 H2O2所致心肌细胞氧化应激损伤的保
护作用。
珠子参具有较广泛的药理作用，对消化系统、中枢
神经系统、心脑血管系统、免疫系统等具有广泛的药理
作用［8］。我们前期研究［6］发现珠子参总皂苷对心脑
缺血性损伤具有较好的保护作用，并初步证实了抗氧
化损伤可能是其作用机制之一。本实验将在此基础上
进一步证实其对心肌缺血性损伤的保护作用及抗氧化
的作用机制。本实验结果表明，珠子参总皂苷对H2O2
所致心肌细胞氧化应激损伤具有显著地改善作用，能
有效提高氧化应激损伤的心肌细胞活性，恢复细胞搏
动频率;在受损的心肌细胞形态学分析中，我们发现珠
子参总皂苷能显著改善心肌细胞折光率，减少质空泡
形成，抑制细胞脱落、悬浮、溶解坏死的发生，显示出了
对 H2O2所致心肌细胞氧化应激损伤较好的保护作用。
近年来，随着对活性氧族(reactive oxygen species，
ROS:O －2·、H2 O2、OH·、NO 及 ONOO
－等)研究的深
入，证实了 ROS 的大量堆积及脂质过氧化是导致心肌
细胞氧化应激损伤的重要机制之一。研究［9］表明，在
正常情况下，细胞内氧自由基的产生和清除是平衡的，
但是在氧化应激情况下，大量产生 ROS 可破坏线粒体
膜和细胞膜的完整性，使心肌细胞膜的通透性增加，导
致细胞内酶 LDH、CK等酶的大量释放。因此，ROS 损
伤被认为是引起心肌细胞氧化损伤的主要机制。我们
在进行心肌细胞培养液的生化分析和细胞内 ROS 含
量检测中，发现模型组心肌细胞心肌酶和氧化还原系
统受到明显破坏，提示 H2 O2诱发了心肌细胞氧化损
伤，实验结果与文献［10］报道一致。
通常情况下，内源性抗氧化物酶(如 SOD、CAT 和
GSH-Px等)是防止氧化应激产生的心肌损伤的第一
道防线，这些内源性的抗氧化物酶通过清除过量的
ROS使机体处于平衡状态［11］。而产生这一生物体抗
氧化应激的防御机制主要是通过抗氧化反应元件(an-
tioxidant response element，ARE)。ARE 是许多抗氧化
基因上游中的顺式作用增强元件。近年研究证实
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第 34 卷第 15 期
2012 年 8 月 15 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
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Nrf2 通过介导 ARE参与调节编码抗氧化蛋白，被称为
机体内一个重要的保护性转录分子。在正常情况下，
Nrf2 与 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白 1(Keap1)耦联，
并与肌动蛋白细胞骨架结合锚定于质;当受到 ROS 或
其他亲核剂信号攻击后，Nrf2 与 Keap1 解耦联后被激
活转位进入细胞核中，与 Maf蛋白结合成异二聚体，异
二聚体与基因中的 ARE 结合后激活了 Nrf2-ARE信号
通路以及其下游的抗氧化蛋白，发挥细胞保护作
用［12］。本研究中，我们检测了心肌细胞质内和核 Nrf2
蛋白表达情况，结果表明珠子参总皂苷能够诱导 Nrf2
由质转入核内，从而促进了相关抗氧化基因的转录。
在机体内源性抗氧化体系中，SOD /GPX /CAT 反
应系统是其中最主要的一组抗氧化酶体系，它们分工
合作共同抵御机体在受到外源或内生的氧化应激损
伤。其中 3 种亚型 SOD(SOD1 ～ SOD3)负责将活性氧
转换成 H2O2，然后 GPX和 CAT将 H2O2解离成水
［13］。
研究表明，上调 SOD基因的表达将增强机体清除氧自
由基的能力，或缺失 CAT、GPX1 将会导致严重的氧化
损伤［12］。本实验通过心肌细胞培养液中 SOD、MDA、
GSH-Px、CAT水平及细胞内 ROS含量和 SOD1、SOD2、
SOD3、CAT、GPX1 基因表达进行了分析，发现 H2O2致
心肌细胞氧化应激损伤心肌细胞时，模型组细胞培养
液中 SOD、GSH-Px、CAT 水平和胞内 SOD1、SOD2、
SOD3、CAT 和 GPX1 基因表达显著下降，ROS 含量显
著升高，而珠子参总皂苷能够明显逆转上述变化，实验
结果提示珠子参总皂苷可能通过促进 SOD /GPX /CAT
反应系统基因的表达，从而增强脑细胞对O －2·、H2O2的
转化能力，从而拮抗 H2O2致心肌细胞氧化应激损伤。
为了进一步证实珠子参总皂苷对 H2O2致心肌细
胞氧化应激损伤的保护作用，我们还分别检测了培养
液中 LDH、CK 水平和细胞凋亡分析。LDH、CK 是心
肌细胞胞质中特异性酶。由于心肌缺血损伤使心肌细
胞膜通透性增加，心肌细胞内的一些重要酶如 LDH、
CK等大量的外漏，因此测定 LDH、CK 外漏的程度可
间接反映心肌细胞的受损程度;而凋亡的检测则更直
接反映了心肌细胞当前的状况［14］。本实验结果显示:
与模型组比较，珠子参总皂苷处理后可使心肌细胞培
养液中 LDH、CK水平明显下降，使心肌细胞凋亡数量
明显减少，同时可使细胞形态恢复或趋于正常。这说
明珠子参总皂苷处理具有抗心肌细胞氧化应激损伤的
保护作用。
综上所述，我们的研究表明珠子参总皂苷能够通
过诱导 Nrf2 核移位，来促进抗氧化基因的转录，促进
抗氧化酶体系的表达增强，进而抑制 H2O2致心肌细胞
氧化应激损伤中 ROS 增加，起到抗 H2O2诱导心肌细
胞损伤作用。
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(收稿:2012-01-18;修回:2012-03-17)
(编辑 张 维)
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