全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#&+#!+#-
&修改稿收到日期$
!"#$+"#+%"
基金项目$新疆维吾尔自治区自然科学基金"
!"#&!##2"!$
#
作者简介$刘
!
娜"
#**")
#!女!在读博士研究生!主要从事棉花分子育种研究
3+45/6
$
&#$&*#-"
!77
,894
"
通信作者$倪志勇!博士!副教授!主要从事植物逆境分子生物学研究
3+45/
$
1/:;/
<
91
=!
#!,894
棉花
102$%
基因的克隆与原核表达
刘
!
娜!曲延英!陈全家!倪志勇"
"新疆农业大学 农学院%新疆农业大学农业生物技术重点实验室!乌鲁木齐
(%""$!
#
摘
!
要$以抗旱性较强的棉花品种(
>>#$&%
)为材料!采用
?@+AB?
技术克隆了
#
个棉花
!"#-"
基因!命名为
$%!"#-"
研究结果表明$
%!"#-"
基因开放阅读框长
#**-C
D
!编码
&(
个氨基酸!
E;FGA-"
蛋白相对分子量
为
-",*&HI
!等电点为
&,(%
氨基酸序列比对和系统进化树分析发现!
E;FGA-"
与欧洲大叶杨
FGA-"
的亲缘关
系最近!氨基酸序列一致性达到
*,&J
为进一步分析基因的功能!构建原核表达载体
D
E3K+&@+#+E;FGA-"
!并
在大肠杆菌中异源表达
GIG+A2E3
分析表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致!重组蛋白在
%-L
!
",!4496
%
M
NA@E
诱导
!;
时表达量最大研究为进一步研究棉花
!"#-"
基因功能奠定基础
关键词$棉花&热激蛋白
-"
&基因克隆&原核表达
中图分类号$
O-($
&
O-(
文献标志码$
2
&"(#(
)
*(!+,"-*,
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"/#012
3
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+,"/4#($%:4(4#(3&44
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"
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D
U1WU5[/1
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D
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U189[/1
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D
WU+
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D
9/1X9V&,(%,F94969
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5156
<
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D
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69
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U+
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0/0V9S1[U[X;5XE;FGA-"0;5WU[*,&J54/1958/[/[U1X/X
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*
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2
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51[E;FGA-"
D
W9XU/1/08690UX9AXFGA-",21U]
D
WU00/91YU8X9W
D
E3K+&@+#+E;FGA-"\50
8910XWS8XU[,@;U1
!
X;UWU894C/151X
D
6504/[\50XW510V9W4U[/1X931%4.+1%+21&0+,@;UGIG+A2E3WU0S6X0
[/0
D
65
<
U[X;5XX;UU]
D
WU00U[
D
W9XU/1\508910/0XU1X\/X;X;U51X/8/
D
5XU[0/:U,@;UU]
D
WU00U[
D
W9XU/1
7
S51X/+
X
<
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%
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W9Y/[U5VS1[54U1+
X56891[/X/910S
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9WX/1
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WU0U5W8;91VS18X/919V$%!"#-"
=
U1U,
?4
.
@",!5
$
89XX91
&
;U5X0;98H
D
W9XU/1-"
&
=
U1U8691/1
=
&
D
W9H5W
<
9X/8U]
D
WU00/91
!!
干旱是世界上危害最严重的一种自然灾害!是
一个长期存在的世界性难题目前世界上有三分之
一以上的土地处于干旱和半干旱地带!其他地区在
植物生长季节也常发生不同程度的干旱*#+!干旱影
响植物各个阶段的生长发育和生理代谢过程棉花
是关系国计民生的重要物资!是仅次于粮食作物的
第二大农作物!其产值占中国经济作物的
$"J
以
上!在国民经济发展中具有重要地位*!+干旱严重
影响棉花的产量和品质!已成为中国棉花生产发展
的重要限制因素因此提高棉花的抗旱能力已经成
为现代棉花研究工作中急需解决的关键问题之一
热激蛋白"
FGA0
!
;U5X0;98H
D
W9XU/10
#是细胞
受到不利环境刺激时被激活并表达增强的一类蛋
白*%+&+该类蛋白根据分子量的大小主要分为
&
类$
F0
D
*"
家族"
(%
"
*"HI
#,
F0
D
-"
家族"

"
-(
HI
#,
F0
D
"
家族及小
F0
D
家族其中
FGA-"
是
FGA
家族中最重要,研究最深入的一种!是重要的
分子伴侣*$+(+!它能防止蛋白变性!并辅助蛋白质重
折叠为正常构象!或者将受到不可恢复伤害的蛋白
通过蛋白水解途径排除到细胞外!从而有利于生物
体抵抗胁迫压力*+
FGA-"
对植物抵抗干旱,高
温,寒冷,氧化等胁迫乃至对植物的生长发育均起到
十分重要的作用*#"+#%+!是育种工作中不可多得的优
良基因本研究前期采用蛋白质组双向电泳技术和
生物信息学方法!对抗旱性较强的 棉 花 品 种
(
>>#$&%
)进行研究!获得了
##%
个在干旱胁迫下差
异表达的蛋白质谱和生物信息学分析发现蛋白质
点
#%#!
为棉花
FGA-"
蛋白!这说明棉花
FGA-"
蛋
白可能在干旱胁迫应答中具有功能*#&+
本研究根据获得的
FGA-"
蛋白的氨基酸序列
设计引物!以棉花品种(
>>#$&%
)为材料!克隆棉花
!"#-"
基因!对其进行序列分析!同时构建了基因
的原核表达载体并在大肠杆菌中原核表达!为进一
步研究棉花
FGA-"
蛋白的功能奠定基础
#
!
材料和方法
A,A
!
研究材料
棉花品种(
>>#$&%
)由新疆农业大学农学院作
物遗传育种实验室提供在实验室已有的
"
份抗
旱材料中!进行抗旱性筛选!发现(
>>#$&%
)抗旱性
较强该品种不但具有抗旱性较好的特点,而且籽
大!适用于水培条件下研究棉花的抗旱性
A,B
!
试验方法
A!
CD=
提取及
0ED=
第一链合成
!
利用
A6S0
植物总
?Q2
提取试剂盒"天根试剂公司#提取棉花
叶片总
?Q2
按照
@;UW49
反转录试剂盒"
@;UW+
49
试剂公司#说明书操作步骤!以获得的棉花叶片
总
?Q2
为模板!合成
8IQ2
第一条链
A!
39102$%
基因的扩增
!
根据前期质谱分析
获得的棉花
!"#-"
基因的氨基酸序列设计特异性
引物
E;FGA-"+^
"
$_+2E2E@E2@EEBBEE222+
2EE2E+%_
#和
E;FGA-"+?
"
$_+2EB@E@@222+
B2@BEEB2222@2B@2@B@+%_
#!以 棉 花 叶 片
8IQ2
第一链为模板!扩增基因扩增体系$
#"`
缓
冲液"含
a
=
!b
#
$
#
M
!
!,$4496
%
M[Q@A&
#
M
!
#"
#
496
%
M
引物各
!
#
M
!
8IQ2#
#
M
!
52
6
酶"
$P
%
#
M
#
",$
#
M
!
[[F
!
c%$,$
#
M
反应程序$预变性
*&L
&4/1
!变性
*&L%"0
!退火
"L%"0
!延伸
-!L
#4/1%"0
!
%$
个循环!再延伸
-!L#"4/1
!结束反
应经
#J
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物!采用普
通
IQ2
产物纯化试剂盒"天根试剂公司#纯化
AB?
产物!通过
@+2
克隆法连接到
D
aI#*+@
"
@5H5W5
试
剂公司#!转化大肠杆菌
IF$
$
感受态细胞"宝信试
剂公司#!涂布于含有氨苄青霉素"
$"4
=
%
4M
#的
MZ
固体培养基上!
%-L
过夜培养后!挑取白色单菌落!
经含有氨苄青霉素的液体培养基震荡培养
#!;
后!
菌液
AB?
检测是否有插入片段!将阳性克隆送往北
京鼎国昌盛生物技术有限公司测序
A,B,F
!
生物信息学分析
!
通过检索
EU1Z51H
和利
用
IQ2a2Q
等软件进行同源性和多重序列比较
分析用
a3E&,"
软件构建系统进化树!利用
IQ2GX5W
的
D
W9XU51
软件预测二级结构!利用在线软
件"
;XX
D
$%%
\\\,8C0,[XS,[H
%
0UWY/8U0
%
@aFaa
%#分
析棉花热激蛋白
-"
基因编码的氨基酸序列的跨膜
结构
A!
39102$%
基因原核表达载体的构建
!
根据
原核表达载体
D
E3K+&@+#
的多克隆位点!设计带有
酶切位点引物
-"+!(+^
"
$_+@@2EE2@BB2@EEB+
BEE2222EE2E22E+%_
#和
-"+!(+?
"
$_+@22E+
BEEBBEB@@2E@BE2B@@B@@B@2@B@@2EE+
@+%_
#!并以
D
aI#*+@+E;FGA-"
质粒为模板!按上
述体系和程序进行
AB?
扩增!经
#J
琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物利用
7&/
%
和
82-F
%
"
@;UW49
试剂公司#分别双酶切
AB?
纯化产物与空质粒
D
E3K+&@+#
!酶切产物纯化后!用
@
&
IQ2
连接酶
!!L
定向连接
!"4/1
!将连接产物转化大肠杆菌
IF$
$
!通过菌液
AB?
初步筛选阳性重组子!阳性克
隆送上海美季测序公司测序
A!
39102$%
基因的原核表达
!
使用热激法将
重组质粒转化大肠杆菌
?90UXX5
"
I3%
#感受态细胞
"北京全式金#!涂布于含有氨苄青霉素"
$"4
=
%
4M
#
的
MZ
固体培养基上!
%-L
过夜培养后挑取单菌落!
经含有氨苄青霉素的液体培养基震荡培养
#!;
后!
通过菌液
AB?
筛选阳性克隆
将重组菌株接种于
!4M
含
$"4
=
%
M
氨苄青霉
素的
MZ
液体培养基中!
%-L
,
!""W
%
4/1
过夜培
养然后按
#d$"
比例转接到
#"4M
新鲜
MZ
液体
培养基中"含
$"4
=
%
M
氨苄青霉素#!
!!$W
%
4/1
培
*(
&
期
!!!!!!!!!!!!!!
刘
!
娜!等$棉花
!"#-"
基因的克隆与原核表达
养
%;
"
cI
""
#
",
#!加入
NA@E
至终浓度分别为
"
,
",!
,
",$
,
#,"
,
#,$
和
!,"4496
%
M
!
%-L
诱导
&;
后
收集菌液以
",$ 4496
%
MNA@E
诱导
&;
的
D
E3K+&@+#
空载体作为对照
("""W
%
4/1
!离心
#"4/1
!弃上清!菌体样品加入
%"
#
M!`
上样缓冲
液和
$"
#
M[[F
!
c
!混匀!在
#""L
的沸水中煮沸
#"4/1
!冰上冷却后!取
#"
#
M
进行
GIG+A2E3
"
$J
浓缩胶!
#!J
分离胶#电泳检测电泳后经考马斯亮
兰染色,拍照!分析蛋白表达结果!确定最适
NA@E
诱导浓度
按上述方法!以终浓度为
#4496
%
MNA@E
进行
重组菌株表达蛋白的诱导表达!以相同条件的
D
E3K+&@+#
转化菌为对照
%-L
培养
"
,
!
,
&
和
;
后分别收集菌液!进行
GIG+A2E3
"
$J
浓缩胶!
#!J
分离胶#电泳检测!分析蛋白表达结果!确定最
适培养时间
!
!
结果与分析
B!
39102$%
基因克隆与序列分析
以棉花叶片
8IQ2
为模板!利用引物
E;F+
GA-"+^
和
E;FGA-"+?
!通过
AB?
扩增获得一条大
约
!HC
左右的特异条带"图
#
#通过
@+2
克隆将
扩增产物克隆到
D
aI#*+@
载体上!获得重组质粒
D
aI#*+@+FGA-"
!测序结果表明该基因
c?^
为
#**-C
D
!
$_
末端长为
#-"C
D
!
%_
末端长
!"!C
D
编码含
&(
个氨基酸残基蛋白&利用
IQ2a2Q
软件预测的
蛋白质的理论分子量为
-",*&HI
!等电点为
&,(%

同源性比对分析表明!棉花
FGA-"
具有
%
个典
型的
FGA-"
签 名 基 序 序 列 "
NIME@@RG
,
N^+
IMEEE@^ IeGMM
,
eeMeEEG@?NA>eOO
#!其
在氨基酸序列中所处的位置基本上相同!
B+
端特征
基序均为
33eI
!所得氨基酸序列在
QBZN
中进行
Z650X
分析表明!第
*
个氨基酸到第
#(
个氨基酸为
该序列的结构域"图
&
#
E;FGA-"
编码的氨基酸
序列与已报道其他植物的
FGA-"
序列都具有高度
的同源性!其中与欧洲大叶杨
FGA-"
的氨基酸水平
一致性达到
*,&J
!表明
FGA-"
进化的保守性
将棉花
FGA-"
的氨基酸序列与其他已报道植
物的
FGA-"
进行多序列比对!利用
BMPG@2Mf
和
a3E2&,"
软件构建系统进化树"图
!
#从图
%
可以看出!棉花"
$&
)*
+,-%+.,/,-
#
FGA-"
与欧
洲大叶杨"
#&
*
,0,/.+1%&12.
*
2
#
FGA-"
为同一分
支!说明棉花与欧洲大叶杨在进化上亲缘关系较近
利用
IQ2GX5W
软件的
D
W9XU51
程序对棉花
FGA-"
氨基酸序列进行二级结构预测"图
%
#结果
表明!该蛋白的二级结构由
$
+
螺旋,
&
+
折叠,转角和
无规则卷曲组成利用在线软件
;XX
D
$%%
\\\,8C0,
[XS,[H
%
0UWY/8U0
%
@aFaa
%对棉花
FGA-"
蛋白的
跨膜区进行预测!表明棉花
FGA-"
蛋白无跨膜区!
预测结果如下"图
$
#
图
#
!
?@+AB?
产物电泳图
#,?@+AB?
产物&
a,IM!"""
/^
=
,#
!
36U8XW9
D
;9WU0/09V?@+AB?
D
W9[S8X0
#,?@+AB?
D
W9[S8X0
&
a,IQ245WHUW
图
!
!
系统进化树
/^
=
,!
!
2156
<
0/091
D
;
<
69
=
U1UX/8XWUU
图
%
!
E;FGA-"
二级结构预测
标尺表示蛋白序列区段
/^
=
,%
!
GU891[5W
<
0XWS8XSWU
D
WU[/8X49[U69VE;FGA-"
?S6UW/1[/85XU0X;UWU0/9109V
D
W9XU/1
"*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
&
!
棉花与其他植物的
FGA-"
的氨基酸序列比对结果
划线部分为
E;FGA-"
结构域!阴影部分表示同源氨基酸残基,签名序列和胞质
FGA-"B+
末端特征基序标出&
B0FGA-",
黄瓜"
KA
-
""&#&!-&*,#
#&
g8FGA-",
桐油树"
>IA&&*(#,#
#&
a[FGA-",
苹果"
KA
-
""(%-"-#",#
#&
a1FGA-",
川桑"
3KZ$(#!(,#
#&
QXFGA-",
烟草"
22?#-"(",#
#&
cCFGA-",
短花稻"
KA
-
""%#!(,#
#&
cGFGA-",
水稻"
QA
-
""#"($&",#
#&
AXFGA-",
欧洲大叶杨
"
KA
-
""!%####,#
#&
@8FGA-",
可可"
KA
-
""-""*%!,#
#&
eYFGA-",
葡萄"
KA
-
""!!(&""(,#
#&
E;FGA-",
棉花"
2Bg##-&!
#
/^
=
,&
!
B94
D
5W/0919V[U[S8U[54/1958/[0U
7
SU18U09VFGA-"9V89XX91VW949X;UW0
D
U8/U0
@;U0XWS8XSW56[945/19VE;FGA-"/0S1[UW6/1U[51[X;U/[U1X/85654/1958/[WU0/[SU0\UWU/1[/85XU[\/X;C658H0;5[U
&
FGA-"0/
=
15XSWU49X/V051[8
<
X9096/8FGA-"+0
D
U8/V/849X/V5WUS1[UW6/1U[
&
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"
KA
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#&
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#&
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D
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"
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-
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"
2Bg##-&!
#
#*
&
期
!!!!!!!!!!!!!!
刘
!
娜!等$棉花
!"#-"
基因的克隆与原核表达
B!
39102$%
基因原核表达载体构建与表达分析
对重组质粒
D
E3K+&@+#+E;FGA-"
进行菌液
AB?
检测!电泳结果见图

!在
#**-C
D
位置处有
#
条目的条带与预期结果一致!同时!该重组载体插入
IQ2
片段的测序结果与棉花
!"#-"
基因序列完
全相同!表明棉花
!"#-"
基因的原核表达载体构
图
$
!
@aFaa
工具预测结果图
/^
=
,$
!
AWU[/8X/919VX;U@aFaaX996
图

!D
E3K+&@+#+E;FGA-"
菌液
AB?
/^
=
,
!D
E3K+&@+#+E;FGA-"YU8X9WC58XUW/566/
7
S/[AB?
a,IM!"""
&
#,E;FGA-"
图
-
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NA@E
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FGA-"
蛋白表达的影响
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空载体未诱导&
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D
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空载体经
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诱导
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&
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D
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未诱导&
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和
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诱导
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下!分别对含重
组质粒
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!对
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电
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-
#显示!在
$
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NA@E
诱导下!均能诱导出融合蛋白!且所表达蛋白与预期
蛋白大小一致!而
D
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空载体则没有融合蛋
白表达!表明
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%
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蛋白诱导效果
在
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下!用
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"
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FGA-"
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和
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!
,
&
和
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!均能诱导出融合蛋白!
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!;
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大值而经
",$4496
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诱导
&;
的
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&@+#
空载体则没有融合蛋白表达"图
(
#
%
!
讨
!
论
FGA-"
是研究最多,在生物体内分布最广,进
化上最保守的一类热激蛋白!在植物受到高温,干
旱,低温,高盐等非生物胁迫时可迅速并短时表达!
以减少植物细胞受到的伤害长期以来一直受到人
们重视而在各种非生物胁迫中!干旱对棉花产量
的影响占首位!可以导致棉花细胞脱水,膜系统和酶
系统遭到破坏,细胞功能丧失等*#$+因此!运用基
!*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
因工程手段发掘和克隆抗旱基因!分离出与棉花抗
旱品质紧密相关的基因显得至关重要!对于今后培
育抗旱棉花新品系具有重大意义
本研究则根据前期采用蛋白质组双向电泳技术
和生物信息学方法!对抗旱性较强的棉花品种
(
>>#$&%
)进行研究!获得了
##%
个在干旱胁迫下差
异表达的蛋白发现蛋白质点
#%#!
为棉花
FGA-"
蛋白!推测该蛋白可能在干旱胁迫应答中具有功能
因此以获得的差异蛋白
FGA-"
的氨基酸序列为基
础!利用
?@+AB?
技术成功克隆出棉花
!"#-"
基
因!系统进化树分析!发现棉花
FGA-"
与已报道其
他植物的
FGA-"
均有较高的同源性!其中与欧洲大
叶杨
FGA-"
具有的氨基酸水平一致性最高!蛋白亲
缘关系最近棉花
FGA-"
氨基酸序列存在真核细
胞
FGA-"
家族的三个特征标签以及真核细胞特征
基序!含有四肽重复序列
EEaA
和
2@A
结合位点
的特征性基序
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"
#%+!#
#具有细胞质定
位的
FGA-"B+
末端特征基序
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外源基因在大肠杆菌中能否高效表达受很多因
素的影响!如大肠杆菌菌株,诱导剂浓度,温度和诱
导时间等*#+有报道指出!
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"
#4496
%
M
范围内
的
NA@E
均适于重组蛋白诱导表达*#-+!而低浓度的
NA@E
可以减少化学物质对细胞的损伤*#(+在预实
验基础上本实验将
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浓度确定为
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%
M
!
在
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下诱导
!;
时重组蛋白表达量就已达到最
大值!实验结果证明该浓度诱导棉花
FGA-"
重组蛋
白表达是可行的并为下一步纯化
E;FGA-"
蛋白
以及研究其功能提供实验基础
$%!"#-"
基因在
大肠杆菌中表达的实验结果!为以后进一步将
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基因应用到棉花抗旱的实际育种工作中提供了有利
的理论基础
参考文献!
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