全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(３): ２８８￣２９６(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０６￣１９ꎻ 修回日期: ２０１５￣０２￣０８
基金项目: 公益性行业(质检)科研专项(２０１１１００３５)ꎻ国家 ９７３课题(２０１１ＣＢ９３２８００)ꎻ质检总局课题(２０１３ＩＫ２６７)
通讯作者: 邓丛良ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物病毒检测技术研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｄｅｎｇｃｌ＠ｂｊｃｉｑ.ｇｏｖ.ｃｎ
许志春ꎬ副教授ꎬ主要从事教学和昆虫病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈｃｈｘｕ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 连海燕ꎬ女ꎬ浙江绍兴人ꎬ硕士ꎬ主要从事纳米磁珠提取类病毒研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗｕｔｏｎｇｙｅ８７＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０３.００８
啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ提取方法及检测技术的研究
连海燕１ꎬ 李建光２ꎬ 赵晓丽２ꎬ 吕玉峰２ꎬ 孙 宁３ꎬ 邓丛良２∗ꎬ 许志春１∗
( １北京林业大学ꎬ北京 １０００８３ꎻ ２北京出入境检验检疫局ꎬ北京 １０１３１２ꎻ ３东南大学生物科学与医学工程学院ꎬ南京 ２１００９６)
摘要:本研究采用纳米磁珠提取法(Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓꎬＭＮＰ)、改良的 ＬｉＣｌ沉淀法、ＣＴＡＢ法、ＴＲＩｚｏｌ法和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ
Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ５种方法提取感染啤酒花潜隐类病毒(Ｈｏｐ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｏｉｄꎬＨＬＶｄ)的啤酒花叶片总 ＲＮＡꎬ结果显示 ＬｉＣｌ 沉淀法、
ＣＴＡＢ法和 ＭＮＰ法提取的 ＲＮＡ的质量较好ꎬ而 ＭＮＰ法具有提取时间短、操作简便ꎬ环境友好和批量提取的优势ꎬ适用于
啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ的快速提取ꎮ 体外转录制备 ＨＬＶｄ ＲＮＡ标准品ꎬ利用实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 绘制标准曲线ꎬ并对
其特异性、灵敏度进行评估ꎮ 应用纳米磁珠提取啤酒花总 ＲＮＡꎬ结合实时荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ技术ꎬ建立了 ＨＬＶｄ的快速、高效的
ＭＮＰ￣ＲＴ￣ｑＰＣＲ定量检测方法ꎮ
关键词:类病毒ꎻ 提取方法ꎻ 实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＭＮＰ￣ＲＴ￣ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ ｏｆ Ｈｏｐ
ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｏｉｄ 　 ＬＩＡＮ Ｈａｉ￣ｙａｎ１ꎬ ＬＩ ｊｉａｎ￣ｇｕａｎｇ２ꎬ ＺＨＡＯ Ｘｉａｏ￣ｌｉ２ꎬ ＬÜ Ｙｕ￣ｆｅｎｇ２ꎬ ＳＵＮ Ｎｉｎｇ３ꎬ ＤＥＮＧ
Ｃｏｎｇ￣ｌｉａｎｇ２ꎬ ＸＵ Ｚｈｉ￣ｃｈｕｎ１ 　 ( １Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１３１２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓꎬ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９６ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｈｏｐ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｈｏｐ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｏｉｄ (ＨＬＶｄ) ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ (ＭＮＰ)ꎬ ＬｉＣｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎꎬ ＣＴＡＢꎬ ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ. Ｔｈｅ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＭＮＰꎬ ＬｉＣｌ ａｎｄ ＣＴＡＢ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ. Ａｎｄ ｔｈｅ ＭＮＰ
ｍｅｔｈｏｄ ｈａｄ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅꎬ ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎꎬ ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｂａｔｃｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ.
Ｔｈｅ ＭＮＰ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＶｄ ＲＮＡ. Ｔｈｅ ＲＮＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ＨＬＶｄ ｗａｓ
ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ｐｌｏｔｔｅｄ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＨＬＶｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ. Ａ ｒａｐｉｄꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＮＰ￣ＲＴ￣ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＶｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｖｉｒｉｏｄꎻ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄꎻ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０３￣０２８８￣０９
　 　 类病毒是一类在寄主植物体内进行自我复制
的共价闭合环状单链 ＲＮＡ分子ꎬ由 ２４６~ ３９９ 个核
苷酸组成ꎬ不编码任何蛋白质ꎬ是目前已知的最小
的植物病原物[１]ꎮ 类病毒侵染多种经济作物的症
状虽然与病毒病的症状基本相同ꎬ但类病毒侵染力
强、潜伏期长ꎬ且很难通过茎尖培养等方式脱除类
病毒ꎬ从而给相关经济作物造成严重的经济影响ꎬ
如椰子死亡类病毒 (Ｃｏｃｏｎｕｔ ｃａｄａｎｇ￣ｃａｄａｎｇ ｖｉｒ￣
ｏｉｄꎬ ＣＣＣＶｄ)ꎬ使马来西亚椰子生产近乎绝产ꎻ马
铃薯纺锤块茎类病毒(Ｐｏｔａｔｏ ｓｐｉｎｄｌｅ ｔｕｂｅｒ ｖｉｒｏｉｄꎬ
　
　 ３期 连海燕ꎬ等:啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ提取方法及检测技术的研究
ＰＳＴＶｄ)ꎬ造成马铃薯 ７０％以上的减产ꎻ柑桔裂皮
类病毒(Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄꎬ ＣＥＶｄ)、鳄梨日斑
类病毒(Ａｖｏｃａｄｏ ｓｕｎｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｏｉｄꎬ ＡＳＢＶｄ)等对果
树生产带来严重危害[２]ꎮ 繁育材料一旦被类病毒
侵染ꎬ就会终身带毒ꎬ给防治工作带来很大的困难ꎬ
所以很多类病毒也是我国的检疫对象ꎮ 建立快速、
有效的类病毒检测方法对于类病毒病害的防控和
检验检疫工作尤为重要ꎮ 由于类病毒是单链共价
闭合环状 ＲＮＡꎬ既无外壳蛋白包裹ꎬ又无编码蛋白
的功能ꎬ因此不能使用血清学方法进行检测ꎮ 目前
检测类病毒的常用方法主要有生物学检测、聚丙烯
凝胶电泳检测、分子杂交、ＲＴ￣ＰＣＲ 和 ＲＴ￣ｑＰＣＲ
等[３]ꎮ 高质量的类病毒 ＲＮＡ 是分子生物学检测
的基本前提ꎬ是构建 ｃＤＮＡ 文库、分子杂交、基因
克隆、ＲＴ￣ＰＣＲ 等操作的基础[４]ꎮ 选择一种简便、
高效的提取方法是十分重要的ꎮ 对于植物类病毒
核酸的提取ꎬ常用的方法主要有 ＬｉＣｌ 法[５]、ＰＥＸ
法[６]、ＴＰＳ 法[７]、ＣＴＡＢ 法[８]、ＴＲＩｚｏｌ 法[９]、ＣＦ￣纤
维素柱[１０]和试剂盒[１４]等ꎬ每种提取方法都有优缺
点ꎬ需要根据实际样品材料选择合适的方法ꎮ
　 　 啤酒花潜隐类病毒(Ｈｏｐ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｏｉｄꎬＨＬＶｄ)
隶属于马铃薯纺锤块状类病毒科(Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅ)ꎬ
椰子死亡类病毒属(Ｃｏｃａｄｖｉｒｉｏｄ) [１１]ꎬ基因组为单
链环状 ＲＮＡꎬ全长为 ２５６ ｂｐꎮ 当啤酒花受 ＨＬＶｄ
侵染后ꎬ一般不产生明显的症状ꎬ主要是一些次生
代谢产物成分发生改变ꎬ从而影响啤酒花品质ꎬ降
低啤酒花产量ꎬ给生产带来一定损失[１２]ꎮ ＨＬＶｄ
的寄主范围窄ꎬ主要侵染啤酒花、葎草和异株荨麻ꎬ
其病毒滴度在寄主不同组织部位中存在差异ꎬ一般
以球果中含量最高ꎬ然后依次是叶片、种子、花粉ꎮ
啤酒花潜隐类病毒可以通过机械方式在田间传播ꎬ
也可以通过带病毒苗木或无性繁殖材料的调运进
行远距离传播ꎬ目前为止尚未发现该类病毒存在昆
虫媒介[１２ꎬ１３]ꎮ
　 　 啤酒花潜隐类病毒已列入我国进境植物检疫
性有害生物名录ꎬ寻求简单、准确、快速、灵敏的检
测方法必不可少ꎬＧｕｏ 等[１４]建立了啤酒花潜隐类
病毒的实时荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测方法ꎬ该方法重点
在于实时荧光反应体系的优化ꎬ缩短了该病毒的检
测时间ꎮ 该研究采用 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 进行
植物总 ＲＮＡ 提取ꎬ具有成本高、核酸提取质量低
的问题ꎮ 而本研究着重于以简便、快速的方法提取
高质量 ＲＮＡꎬ以携带 ＨＬＶｄ的啤酒花为试验材料ꎬ
首次采用ＭＮＰ方法提取 ＨＬＶｄ ＲＮＡꎬ并与 ＬｉＣｌ沉
淀法、ＣＴＡＢ法、ＴＲＩｚｏｌ法和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
５种提取方法进行比较ꎮ 通过琼脂糖凝胶电泳、分
光光度计和建立 ＨＬＶｄ 标准曲线分析不同方法提
取的 ＲＮＡ质量ꎬ确定 ＭＮＰ 法具有提取时间短、操
作简便和环境友好的优势ꎻ构建了相较于质粒
ＤＮＡ而言ꎬ定量更为准确的单链 ＲＮＡꎬ同时结合
实时荧光 ＰＣＲ 技术ꎬ建立了快速、灵敏、特异的实
时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ检测 ＨＬＶｄ方法ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 感染啤酒花潜隐类病毒(Ｈｏｐ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｏｉｄꎬ
ＨＬＶｄ)、啤酒花矮化类病毒(Ｈｏｐ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｏｉｄꎬ ＨＳ￣
Ｖｄ)的啤酒花ꎬ葡萄黄斑类病毒 １(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ
ｓｐｅｃｋｌｅ ｖｉｒｏｉｄ １ꎬ ＧＹＳＶｄ１)、葡萄黄斑类病毒 ２(Ｇｒａ￣
ｐｅｖｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ ｓｐｅｃｋｌｅ ｖｉｒｏｉｄ ２ꎬ ＧＹＳＶｄ２)的葡萄叶
片ꎬ由本实验室提供ꎬ感染澳大利亚葡萄类病毒
(Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｏｉｄꎬ ＡＧＶｄ)的植物材料由
中国农科院植物保护研究所李世访研究员提供ꎮ
　 　 Ｔａｑ酶、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００、胶回收试剂盒、
普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 和实时荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ 所用试剂均购
自大连宝生物工程有限公司ꎻＴＲＩｚｏｌ 试剂购自 ｉｎ￣
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎻＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ购自 Ｑｉａｇｅｎ公
司ꎻ氯仿、异丙醇、异戊醇和无水乙醇购自国药集团
北京分公司ꎻ ＣＴＡＢ、ＰＶＰ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、亚精胺、
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ、β￣巯基乙醇和 ＬｉＣｌ 均购自上海生工ꎻ纳
米磁珠(ＭＮＰ)由国家纳米科学中心提供ꎮ
１.２　 引物与探针
　 　 根据 ＮＣＢＩ 核酸序列数据库中 ＨＬＶｄ 全长序
列(ＥＦ６１３１９２.１、ＥＦ６１３１８８.１、ＥＦ６１３１８５.１)设计引
物ꎬ由 ＴａＫａＲａ宝生物工程有限公司合成ꎬ其序列
如下ꎬ全长引物: ＨＬＶ￣ＦＰ: ５′￣ＡＴＡＣＡＡＣＴＣＴＴ￣
ＧＡＧＣＧＣＣＧＡ￣３′ 与 ＨＬＶ￣ＲＰ: ５′￣ＣＣＡＣＣＧＧＧ￣
ＴＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＴ￣３′ꎬ扩增体外转录模板的引物:
ＨＬＶ￣Ｆ: ５′￣ＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
ＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＧＧＴＧ￣３′ 与 ＨＬＶ￣Ｒ: ５′￣
ＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＴ￣３′ꎬ下划线部分为
Ｔ７启动子序列ꎬＧＡＴＣＡＣ 为保护碱基ꎮ 实时荧光
９８２
　
植物病理学报 ４５卷
特异性引物 ＨＬＶ￣Ｆ１: ５′￣ＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴ￣
ＧＣＴＴ￣３′ 与 ＨＬＶ￣Ｒ１: ５′￣ＣＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＡＡＧＡ
ＡＧＧＡ￣３′ꎬＴａｑＭａｎ 探针 ＨＬＶ￣Ｐ:５′￣ＦＡＭ￣ＣＴＴＣＴ￣
ＴＣＴＴＧＴＴＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＧＴＧ￣(ＢＨＱ１) ￣３′ꎮ
１.３　 核酸提取　
　 　 利用 ＭＮＰ法、改良的 ＬｉＣｌ 沉淀法、ＣＴＡＢ 法、
ＴＲＩｚｏｌ 和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ５种方法分别提取
感染 ＨＬＶｄ 的啤酒花叶片的总 ＲＮＡꎮ 取 ３００ ｍｇ
携带 ＨＬＶｄ的啤酒花叶片ꎬ加液氮充分研磨成粉末
后备用ꎮ
　 　 纳米磁珠法[１５]:取 ５０ ｍｇ 充分研磨的啤酒花
叶片ꎬ加入 １ ｍＬ 的研磨液(４ ｍｏｌ􀅰Ｌ￣１异硫酸氰
胍、０.５ ％十二烷基磺酸钠、０.１ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００、１０
ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＣｌ、２５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１柠檬酸钠 ｐＨ ７.０、
２ ％ ＰＶＰ)进行充分研磨ꎬ５ ０００ ｒｐｍ离心 ５ ｍｉｎꎻ取
１００ μＬ上清液于一洁净的 １.５ ｍＬ 离心管中ꎬ加入
１ ｍｇ ＭＮＰ 和 １ 倍体积的无水乙醇ꎬ上下颠倒混
匀ꎬ室温放置 ５ ｍｉｎꎻ磁分离后弃上清液ꎬ用 ２００ μＬ
７０ ％乙醇清洗 ３次ꎮ 加入 ３０ μＬ ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏꎬ
室温放置 ５ ｍｉｎ 后ꎬ磁分离ꎬ小心吸取上清液至新
的离心管中备用ꎮ
　 　 改良的 ＬｉＣｌ 沉淀法[５]:取 ５０ ｍｇ 充分研磨的啤
酒花叶片ꎬ加入预热的 ＣＴＡＢ 提取液(２ ％ＣＴＡＢ
(ｗ/ ｖ)、２ ％ＰＶＰ(ｗ/ ｖ)、２５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＥＤＴＡ、２.０ ｍｏｌ
􀅰Ｌ－１ ＮａＣｌ、 ０. ５ ｇ􀅰 Ｌ－１亚精胺、 １００ ｍｍｏｌ􀅰 Ｌ－１
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ、２ ％ β￣巯基乙醇(Ｖ/ Ｖ))ꎬ振荡混匀后水浴
１０ ｍｉｎꎬ加入等体积氯仿 /异戊醇(２４ ∶ １)ꎬ１ ２ ０００ ｒｍｐ
离心１０ ｍｉｎꎻ取上清加入１/ ４体积的１０ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＬｉＣｌ
溶液ꎬ４℃过夜ꎻ１ ２ ０００ｒｍｐ离心 ２０ ｍｉｎꎬ弃上清ꎻ加入
２ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１的 ＬｉＣｌ 溶液ꎬ１ ２ ０００ ｒｍｐ离心 １０ ｍｉｎꎬ弃
上清ꎬ用 ７５ ％乙醇洗沉淀ꎬ加 ３０ μＬ ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ
溶解 ＲＮＡꎬ－８０℃保存ꎮ
　 　 ＣＴＡＢ 法[８]:取 ５０ ｍｇ 充分研磨的啤酒花叶
片ꎬ加入预热的 ＣＴＡＢ提取液和 β￣巯基乙醇ꎬ振荡
混匀后水浴 １０ ｍｉｎꎬ加入 １ / ２ 体积氯仿 /异戊醇
(２４ ∶ １)ꎬ１ ２ ０００ ｒｍｐ离心 １０ ｍｉｎꎻ取上清ꎬ加入等
体积氯仿 /异戊醇(２４ ∶ １)ꎬ１ ２ ０００ ｒｍｐ 离心 １０
ｍｉｎꎻ取上层液体ꎬ加等体积异丙醇沉淀ꎬ１ ２ ０００
ｒｍｐ离心 １０ ｍｉｎꎻ弃上清ꎬ用 ７５ ％乙醇洗沉淀ꎬ加
３０ μＬ ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ溶解 ＲＮＡꎬ－８０℃保存ꎮ
　 　 取 ５０ ｍｇ 充分研磨的啤酒花叶片ꎬ用 ＴＲＩｚｏｌ
试剂和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ试剂盒进行提取ꎬ按
照试剂盒说明书进行 ＲＮＡ 提取ꎬ最后溶于 ３０ μＬ
ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ中ꎬ－８０℃保存ꎮ
　 　 取 ２ μＬ总 ＲＮＡ样品ꎬ用 １.２ ％普通琼脂糖凝
胶电泳进行电泳ꎬ电泳条件为 ７０ ｖꎬ２０ ｍｉｎꎮ 　
　 　 ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｎａｎｏ￣１０００微量紫外分光光度计测
定 ＲＮＡ浓度与纯度ꎮ
１.４　 ｃＤＮＡ合成
　 　 在 ２００ μＬ 反应管中依次加入 ＲＮＡ ５ μＬ 和
１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１下游引物 １ μＬꎬ７０℃预热 １０ ｍｉｎꎬ立
即置冰上 ２ ｍｉｎꎻ然后依次加入 ５×Ｍ￣ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ
２ μＬ、１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０.５ μＬ、４０ Ｕ􀅰
μＬ－１ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０.２５ μＬ、２００ Ｕ􀅰μＬ－１Ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ￣ＭＬＶ (ＲＮａｓｅ Ｈ ̄) ０. ２５ μＬꎬ补加
ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ 到 １０ μＬꎬ４２ ℃温育 １ ｈ 后ꎬ７０ ℃
加热 １５ ｍｉｎꎬ立即置冰上 ２ ｍｉｎꎮ
１.５　 普通 ＰＣＲ
　 　 普通 ＰＣＲ扩增体系为 ２５ μＬꎬｃＤＮＡ ２ μＬꎬ１０×
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２.５ μＬꎬ２.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２
μＬꎬ１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＨＬＶ￣Ｆ和 ＨＬＶ￣Ｒ各 １ μＬꎬ２５０ Ｕ
􀅰μＬ－１ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０.２ μＬꎬ补足 ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ
Ｈ２Ｏ至 ２５ μＬꎮ 扩增程序为:９４ ℃ ５ ｍｉｎꎻ９４ ℃ ３０
ｓꎬ５８ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ １ ｍｉｎꎬ４０ 个循环ꎻ７２ ℃ ５ ｍｉｎꎮ
ＰＣＲ产物经 １.５ ％的琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ凝胶成
像仪观察结果ꎬ纯化回收目的产物ꎮ
１.６　 实时荧光 ＰＣＲ
　 　 在 ＡＢＩ ７９００ 实时荧光定量 ＰＣＲ 仪上进行反
应ꎬ总体积为 ２５ μＬꎮ 体系如下:Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ (２
×) １２.５ μＬ、Ｒｏｘ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ (５０×) ０.５ μＬ、１０
μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ＨＬＶ￣Ｆ１ ０.５ μＬ、１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ＨＬＶ￣Ｒ１
０.５ μＬ、１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＨＬＶ￣Ｐ ０.３ μＬꎬＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ
Ｈ２Ｏ ９.７ μＬꎬｃＤＮＡ １ μＬꎮ 使用实时数据采集模
式ꎬ循环反应参数为 ９５℃ １ ｍｉｎꎻ ９５℃ ５ ｓꎬ５６℃ꎬ４０
ｓꎬ循环 ４０次ꎮ
１.７　 标准曲线
　 　 引物对 ＨＬＶ￣Ｆ 和 ＨＬＶ￣Ｒ 的普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩
增产物含有 Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶启动子序列ꎬ可直接用
于合成单链 ＲＮＡꎬ作为 ＨＬＶｄ 的标准品ꎮ 利用 Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｔ７ ｋｉｔꎬ室温配置 ２０ μＬ 反应体
０９２
　
　 ３期 连海燕ꎬ等:啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ提取方法及检测技术的研究
系:体外转录模板 ５ μＬꎬ１０ ×Ｔａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２
μＬꎬ５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮＴＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ 各 ２ μＬꎬ４０ Ｕ􀅰
μＬ－１ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０.５ μＬꎬ５０ Ｕ􀅰μＬ－１ Ｔ７ ＲＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２ μＬꎬＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ ２.５ μＬꎮ ４２ ℃孵
育 １ ｈꎮ 转录产物加 ５ Ｕ􀅰μＬ－１ ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ
２ μＬꎬ３７ ℃反应 １ ｈ 除去 ＤＮＡ 模板ꎬ向上述反应
液中加入水饱和酚 /氯仿 /异戊醇(２５ ∶ ２４ ∶ １)ꎬ混
匀后室温 １０ ０００ ｒｐｍ 离心 ５ ｍｉｎꎮ 转移上层水相
至新离心管中ꎬ加等量 ５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１醋酸钠(ｐＨ ５.５)
和 ４ 倍体积的无水乙醇ꎮ 室温静置 ５ ｍｉｎ 后ꎬ
１５ ０００ ｒｐｍ离心 ５ ｍｉｎꎮ 除去上清ꎬ 加 ５０ μＬ
ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ溶解沉淀ꎬ用 ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｎａｎｏ￣１０００
微量分光光度计测定浓度ꎮ 浓度可以换算为每微
升内的拷贝数(ｃｏｐｉｅｓ􀅰μＬ－１)ꎬ换算公式为 ｃｏｐｉｅｓ
􀅰μＬ－１ ＝(阿伏加德罗常数×浓度) / (１个碱基对的
平均分子质量×总长度)ꎮ 用 ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ 进行
１０倍梯度稀释ꎬ以梯度稀释的 １.０×１０９ ~ １.０×１０２
ｃｏｐｉｅｓ􀅰μＬ－１的 ＲＮＡ 标准品为模板ꎬ进行实时荧
光ＲＴ￣ＰＣＲ反应ꎮ
１.８　 ＲＴ－ｑＰＣＲ特异性
　 　 利用 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ 试剂盒提取携带
ＨＬＶｄ、ＨＳＶｄ、ＡＧＶｄ、ＧＹＳＶｄ１、ＧＹＳＶｄ￣２植物材料的
ＲＮＡꎬ进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲꎬ检测引物及探针的特异性ꎮ
１.９　 ＨＬＶｄ核酸提取效果及检测灵敏度分析
　 　 以在－８０℃保存的携带 ＨＬＶｄ的啤酒花叶片作为
材料ꎬ在液氮中研磨ꎬ进行冻干处理ꎬ作为总的样品材
料ꎻ采用ＭＮＰ法、改良的 ＬｉＣｌ沉淀法、ＣＴＡＢ法、ＴＲ￣
Ｉｚｏｌ法和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 法提取的 ＲＮＡ为模
板进行反转录ꎮ 用 ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ稀释合成的 ｃＤ￣
ＮＡꎬ稀释倍数依次为 １０ｎ(ｎ＝０、１、２、３、４、５)ꎬ进行实时
荧光 ＰＣＲ扩增ꎮ 以稀释的ＭＮＰ法、改良的ＬｉＣｌ沉淀
法和 ＣＴＡＢ法的 ｃＤＮＡ进行普通 ＰＣＲ扩增ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 标准曲线
　 　 以浓度为 １.０×１０９ ~ １.０×１０２ ｃｏｐｉｅｓ􀅰μＬ－１的
ｓｓＲＮＡ标准品作为模板ꎬ建立了标准曲线(图 １)ꎮ
以 Ｃｔ值为 ｙ 轴ꎬ拷贝数的对数值( ｌｏｇ ｃｏｐｉｅｓ)为 Ｘ
轴ꎬ得到标准曲线方程 ｙ＝－３.４１５ ６ ｘ＋４６.７６５ ０ꎬ相关
系数 Ｒ２ ＝０.９９７ ６ꎬ表明标准品的起始浓度与 Ｃｔ值呈
现良好的线性关系ꎬ可用于校准和定量分析 ＨＬＶｄꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｌｏｔｔｉｎｇ Ｃｔ
ｖａｌｕｅｓ ｖｓ. ａｃｔｕａｌ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｌｏｇ ｃｏｐｉｅｓ
Ｔｈｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ.
２.２　 核酸提取方法比较
　 　 由图 ２和图 ３可见ꎬＭＮＰ 法、ＬｉＣｌ 法和 ＣＴＡＢ
法提取的啤酒花叶片总 ＲＮＡ 可以清楚看到 ２８Ｓ、
１８Ｓ和 ５Ｓ ｒＲＮＡ三条条带ꎬ２８Ｓ ｒＲＮＡ 条带亮度约
为 １８Ｓ ｒＲＮＡ条带的两倍ꎬ且无明显的 ＤＮＡ污染ꎬ
但是 ＣＴＡＢ法得到的核酸点样孔附近有条带ꎬ说
明有蛋白质、多糖等杂质的污染ꎮ ＬｉＣｌ 法提取的
总 ＲＮＡ部分 ２８Ｓ ｒＲＮＡ 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 条带界限模
糊ꎬ有少许的弥散现象ꎮ 而 ＭＮＰ法提取的总 ＲＮＡ
条带完整、清晰、亮度高ꎬＲＮＡ 的纯度较高ꎮ 用
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ 提取得到的核酸没有 ２８Ｓ
ｒＲＮＡ和 １８Ｓ ｒＲＮＡ条带ꎬ只有一条暗淡的条带ꎬ不
能确定是否为 ５Ｓ ｒＲＮＡꎻＴＲＩｚｏｌ法提取的核酸经琼
脂糖凝胶电泳电泳显示无任何条带ꎬ表明 ＴＲＩｚｏｌ
试剂不适合于啤酒花叶片总 ＲＮＡ的提取ꎮ
Ｆｉｇ. ２ 　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＭＮＰ ａｎｄ
ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ
１￣４: ＭＮＰ ｍｅｔｈｏｄꎻ ５￣８: ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ.
１９２
　
植物病理学报 ４５卷
　 　 用微量紫外分光光度计检测不同方法提取的
ＲＮＡ样品ꎬ结果见表 １ꎮ 一般认为ꎬ纯度较好 ＲＮＡ
样品 ＯＤ２６０ / ２８０接近 ２.０ꎬ过低则表明有蛋白质或酚
类污染ꎻＯＤ２６０ / ２３０值应大于 ２ꎬ过低则表明有盐离子
污染[１６]ꎮ 从表 １中可看出ꎬＬｉＣｌ 沉淀法、ＣＴＡＢ 法
和 ＭＮＰ 法提取的 ＲＮＡ 的 ＯＤ２６０ / ２８０ 接近 ２. ０ꎬ
ＯＤ２６０ / ２３０均大于 ２.０ꎬ表明提取的 ＲＮＡ质量较高ꎬ与
琼脂糖凝胶电泳检测结果一致ꎮ
　 　 用实时荧光定量法对 ５ 种 ＲＮＡ 提取方法得
到的 ＲＮＡ进行检测ꎬ根据获得的 Ｃｔ值结合标准曲
线得到 ＨＬＶｄ的浓度(表 ２)ꎮ 由表 ２ 可看出ꎬＬｉＣｌ
沉淀法、ＣＴＡＢ 法和 ＭＮＰ 法提取的 ＲＮＡ 质量较
好ꎬＴＲＩｚｏｌ 法和试剂盒法提取的 ＲＮＡ 质量较差ꎬ
与琼脂糖凝胶电泳检测结果和微量紫外分光光度
计检测的结果一致ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ｂｙ ＣＴＡＢꎬ ＬｉＣｌ ａｎｄ ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ
１￣４: ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄꎻ ５￣８: ＬｉＣｌ ｍｅｔｈｏｄꎻ ９￣１２: ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ.
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｈｏｐ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ＬｉＣｌ ＣＴＡＢ ＭＮＰ ＴＲＩｚｏｌ ＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ
Ａ２６０ / Ａ２８０ ２.０５１ ２.０４９ １.９０２ １.０６２ １.２８０
Ａ２６０ / Ａ２３０ ２.３１５ ２.１８５ ２.１３５ ０.３３９ ０.０８４
Ｙｉｅｌｄ ｒａｔｅ / μｇ􀅰ｇ￣１ １０５.８４０ ９０.７２０ ８３.５２０ ２４.６００ ７.６８０
　
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＶｄ ｂｙ ＲＴ￣ｑＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｔ ｖａｌｕｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅａｎ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｔ ｖａｌｕｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅａｎ
ＬｉＣｌ
２１.３３ ２.８×１０７
２０.６４ ４.５×１０７
２２.０７ １.７×１０７
２１.８２ ２.０×１０７
２.８×１０７ ＣＴＡＢ
２２.１６ １.６×１０７
２１.７９ ２.０×１０７
２１.１４ ３.２×１０７
２２.５５ １.２×１０７
２.０×１０７
ＭＮＰ
２２.３２ １.４×１０７
２３.６３ ５.９×１０６
２３.７１ ５.６×１０６
２４.４５ ３.４×１０６
７.２×１０６ ＴＲＩｚｏｌ
３３.２１ ９.３×１０３
３３.０６ １.０×１０４
３３.７８ ６.３×１０３
３３.８７ ５.９×１０３
７.９×１０３
ＲＮｅａｓｙ
Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
３２.２３ １.８×１０３
３３.９２ ５.８×１０３
３４.８７ ３.０×１０３
３３.９４ ５.７×１０３
４.１×１０３
２９２
　
　 ３期 连海燕ꎬ等:啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ提取方法及检测技术的研究
２.３　 特异性检测
　 　 以提取的 ＨＬＶｄ、 ＨＳＶｄ、 ＡＧＶｄ、 ＧＹＳＶｄ１、
ＧＹＳＶｄ２的 ＲＮＡ为模板ꎬ进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲꎮ 结果显
示ꎬ只有 ＨＬＶｄ有特异性扩增曲线出现ꎬ而 ＨＳＶｄ、
ＡＧＶｄ、ＧＹＳＶｄ１、ＧＹＳＶｄ２ 无扩增曲线ꎬ表明实时
荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ 对 ＨＬＶｄ 检测有特异性反应(Ｃｔ 值
为 ２１.８６)ꎬ而对 ＨＳＶｄ、ＡＧＶｄ、ＧＹＳＶｄ１、ＧＹＳＶｄ２
没有反应(Ｃｔ值为 ４０)ꎬ说明该方法具有良好的特
异性(图 ４)ꎮ
２.４　 普通 ＲＴ￣ＰＣＲ检测 ＨＬＶｄ
　 　 分别以 ＭＮＰ 法、ＬｉＣｌ 法和 ＣＴＡＢ 法提取的
ＲＮＡ为模板进行反转录ꎬ反转录产物进行 １０ｎ(ｎ ＝
０、１、２、３、４、５)梯度稀释ꎬＰＣＲ 扩增后都得到了大
小为 ２５６ ｂｐ的特异条带ꎮ 从图 ５ 和图 ６ 可以看出
ＬｉＣｌ法得到的 ＨＬＶｄ 浓度相对较高ꎬ能够检测到
１００ ~１０３梯度的 ＨＬＶｄꎬＭＮＰ 法和 ＣＴＡＢ 法提取的
ＲＮＡ浓度稍低ꎬ检测到 １００ ~１０２梯度的 ＨＬＶｄꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＶｄ
Ｆｉｇ. ５　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｏｕｔｉｎｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＨＬＶｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＭＮＰ ｍｅｔｈｏｄ
Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ １￣６: ＲＮＡ ｏｆ ＨＬＶｄ ａｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ １００ꎬ１０１ꎬ１０２ꎬ１０３ꎬ１０４ａｎｄ １０５ .
Ｆｉｇ. ６　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｏｕｔｉｎｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＨＬＶｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＴＡＢ ａｎｄ ＬｉＣｌ ｍｅｔｈｏｄ
Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ １￣６: ＲＮＡ ｏｆ ＨＬＶｄ ａｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ １００ꎬ１０１ꎬ１０２ꎬ１０３ꎬ１０４ａｎｄ １０５ .
３９２
　
植物病理学报 ４５卷
２.５　 实时荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ
　 　 分别以 ＭＮＰ 法、改良的 ＬｉＣｌ 沉淀法、ＣＴＡＢ
法、ＴＲＩｚｏｌ 法和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 法提取的
ＲＮＡ为模板进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ梯度扩增ꎬ稀释倍数为
１０ｎ(ｎ ＝ ０、１、２、３、４、５)ꎮ 结果显示ꎬ图 ７￣Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ的△Ｒｎ曲线都有增长ꎬ表明五种提取方法均
获取啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡꎮ 从图 ７￣Ａ、Ｂ、Ｃ 可
知ꎬＬｉＣｌ沉淀法、ＣＴＡＢ 法和 ＭＮＰ 法提取的 ＲＮＡ
用 ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测效果较好ꎬ有明显的梯度图谱ꎮ
图 ７￣Ｄ、Ｅ显示ꎬＲＴ￣ｑＰＣＲ检测 ＴＲＩｚｏｌ法和 ＲＮｅａｓｙ
Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 提取的 ＲＮＡ 的灵敏度较差ꎬ图 ７￣Ｄ
的△Ｒｎ曲线都在 Ｃｔ 值 ３１ 附近ꎬ说明 ＴＲＩｚｏｌ 法提
取的 ＲＮＡ 浓度很低ꎮ 图 ７￣Ｅ 的△Ｒｎ 曲线说明
ＲＴ ￣ｑＰＣＲ能检测到１０４稀释倍数的ＲＮＡꎬ但是第
Ｆｉｇ. ７　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ￣ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＨＬＶｄ
Ａ: ＬｉＣｌ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｂ: ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｃ: ＭＮＰ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｄ: ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｅ: ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ.
４９２
　
　 ３期 连海燕ꎬ等:啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ提取方法及检测技术的研究
一个 Ｃｔ 值为 ２８ꎬ说明 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 提取
的 ＲＮＡ浓度相较于 ＬｉＣｌ沉淀法、ＣＴＡＢ法和ＭＮＰ
法提取的 ＲＮＡ 低ꎬ灵敏度较低ꎮ 总的来说ꎬＬｉＣｌ
沉淀法、ＣＴＡＢ法和ＭＮＰ法提取的 ＲＮＡ适合用于
ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测ꎬ检测结果比普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法灵
敏度高 １０２ ~１０３倍ꎮ
３　 讨论
　 　 目前ꎬ世界上已报道的侵染啤酒花的类病毒有
３ 种ꎬ即:啤酒花潜隐类病毒 (Ｈｏｐ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｏｉｄꎬ
ＨＬＶｄ)、啤酒花矮化类病毒(Ｈｏｐ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｏｉｄꎬＨＳ￣
Ｖｄ)和苹果皱果类病毒(Ａｐｐｌｅ ｆｒｕｉｔ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｏｉｄꎬ
ＡＦＣＶｄ) [１７]ꎬ其中啤酒花潜隐类病毒是发生最普
遍的一种侵染啤酒花的潜隐类病毒ꎮ ＨＬＶｄ 主要
通过无性繁殖材料、农事操作工具进行传播ꎻ也可
通过种子、花粉传播ꎬ但传毒率很低ꎻ至今尚无昆虫
介体传播的报道ꎮ 建立并完善 ＨＬＶｄ的检测体系ꎬ
将有助于苗木的生产、引种及种质交换ꎬ并有效预
防 ＨＬＶｄ的传播ꎮ
　 　 研究表明 ＲＴ￣ＰＣＲ技术是检测各种病毒、类病
毒的有效手段之一ꎬ而定量 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 具有更加快
速、灵敏、特异的优势ꎬ能够对模板进行准确定量ꎬ
且进行闭管操作ꎬ能有效避免人为操作污染ꎬ降低
假阳性出现的几率ꎮ 在本研究的实时荧光定量检
测中ꎬ以体外转录 ＲＮＡ 为标准品相比于以重组质
粒为标准品而言ꎬ结果更为可信ꎬ因为体外转录标
准品能够准确反映反应体系中反转录和 ＰＣＲ扩增
过程的效率ꎬ而重组质粒标准品ꎬ只能反映 ＰＣＲ 反
应体系的扩增效率ꎮ
　 　 提取高质量的 ＲＮＡ 是分子生物学研究的基
本手段ꎬ分离得到纯度高ꎬ完整性好的 ＲＮＡ 对许
多分子生物学技术都至关重要ꎬ如进行杂交分析、
构建 ｃＤＮＡ文库、ＲＴ￣ＰＣＲ、基因克隆等ꎮ 目前已经
有许多关于植物组织总 ＲＮＡ 提取的研究[１８ꎬ１９]ꎬ本
研究中比较了 ５ 种方法(ＬｉＣｌ 沉淀法、ＣＴＡＢ 法、
Ｔｒｉｚｏｌ法、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 和纳米磁珠)提取
啤酒花潜隐类病毒 ＲＮＡ 的效果ꎬ实验结果表明纳
米磁珠提取法 (ＭＮＰ)、改良的 ＬｉＣｌ 沉淀法和
ＣＴＡＢ法提取的啤酒花的总 ＲＮＡ 质量好ꎬ可以作
为 ｃＤＮＡ合成和基因克隆的模板ꎬ满足分子生物
学检测的后续研究ꎮ 而 ＴＲＩｚｏｌ 法和 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ
ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 提取的啤酒花的总 ＲＮＡ 质量偏低ꎬ不适
合于啤酒花类病毒 ＲＮＡ 的提取以及后续的研究ꎬ
有研究表明 ＴＲＩｚｏｌ 法亦不适合于葡萄上类病毒
ＲＮＡ 的提取[２０]ꎬ至于在其他作物上类病毒 ＲＮＡ
的提取效果有待于进一步研究ꎮ ＬｉＣｌ 法和 ＣＴＡＢ
法提取的总 ＲＮＡ质量高ꎬ但是需要使用大量的酚
和氯仿ꎬ对人体产生危害ꎬ产生的废液难以处理ꎻ且
操作步骤繁琐ꎬ实验耗时长ꎬ易造成交叉污染ꎬ其中
ＣＴＡＢ法耗时 ２ ｈꎬＬｉＣｌ 法需要 １２ ｈ 以上ꎮ 应用
ＭＮＰ法提取植物类病毒核酸ꎬ省去 ＲＮＡ抽提繁琐
步骤ꎬ能够有效减少植物中多酚ꎬ多糖等物质对
ＲＮＡ提取的干扰ꎬ降低 ＲＮＡ 酶对 ＲＮＡ 的降解作
用ꎬ所使用的试剂种类少ꎬ且都无污染ꎬ对人体无
害ꎬ实验操作简单、工作流程简短和高效稳定ꎬ提取
过程只需半小时ꎬ提取的类病毒核酸纯度和质量与
ＬｉＣｌ法和 ＣＴＡＢ 法提取得到的核酸质量相当ꎬ是
一种简便、经济、快速的方法ꎮ
　 　 普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 与实时荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ 灵敏度检
测比较结果表明ꎬ对于 ＬｉＣｌ 法提取的 ＲＮＡꎬＲＴ￣
ｑＰＣＲ比普通 ＰＣＲ的灵敏度高 １００ 倍ꎻ对于 ＣＴＡＢ
法和 ＭＮＰ 法提取的 ＲＮＡꎬＲＴ￣ｑＰＣＲ 比普通 ＰＣＲ
的灵敏度高 １ ０００ 倍ꎮ 本研究建立的检测 ＨＬＶｄ
的实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术与普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 法
相比ꎬ具有操作简便、快速、特异、灵敏等优点:
ＲＮＡ标准曲线的 Ｃｔ 值与其拷贝数呈良好的线性
关系ꎬ相关系数 Ｒ２为 ０.９９７ ６ꎬ说明该体系有较好的
检测效能ꎻ能特异性检测出 ＨＬＶｄꎬ而 ＨＳＶｄ、
ＡＧＶｄ、ＧＹＳＶｄ１、ＧＹＳＶｄ２ 不出现扩增ꎬ说明特异
性强ꎻ能够检测到稀释 １０５倍的样品 ＲＮＡꎬ比普通
ＲＴ￣ＰＣＲ方法灵敏度高 １００ ~ １ ０００ 倍ꎬ灵敏度更
高ꎮ 研究结果表明ꎬ利用提取时间短、操作简便和
环境友好的 ＭＮＰ 法提取类病毒并结合实时荧光
定量 ＲＴ￣ＰＣＲ技术能高效、快速检测啤酒花潜隐类
病毒ꎬ对啤酒花潜隐类病毒的检测有很好的应用价
值ꎮ 　
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ｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｌｉｃａ￣ｃｏａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉ￣
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责任编辑:曾晓葳
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