全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(５): ５２７￣５３５(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣１２￣１０ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣２２
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１２７２０８３)
通讯作者: 文才艺ꎬ教授ꎬ主要从事植物病害生物防治教学和科研工作ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｃｙｗｅｎ０８０＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍ
第一作者: 赵玉华ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病害生物防治的研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙｈｚｈａｏ１１０９＠ｓｏｈｕ.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.０１１
内生细菌 ＥＢＳ０５对烟草诱导抗性的信号转导途径研究
赵玉华ꎬ 周 蕊ꎬ 李俊州ꎬ 申顺善ꎬ 文才艺∗
(河南农业大学植物保护学院ꎬ郑州 ４５０００２)
摘要:樟树内生枯草芽胞杆菌 ＥＢＳ０５是一株对多种植物病原菌具有较强拮抗活性ꎬ并能诱导烟草系统抗性的生防菌株ꎮ 本
文以缺失 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ合成相关基因的突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔ为材料ꎬ研究了内生细菌 ＥＢＳ０５对烟草诱导系统抗性的激发子及其
信号转导途径ꎮ 结果表明ꎬ菌株 ＥＢＳ０５产生的 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ是诱导烟草对 ＴＭＶ 系统抗性的有效激发子ꎻＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处
理后ꎬＳＡ信号转导途径下游的关键调节基因 ＮＰＲ１首先被激活ꎬ并持续超量表达ꎬ进而触发 ＰＲ１ｂ和 ＰＲ１ａ基因持续超量表
达ꎬ表明 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导烟草对 ＴＭＶ的系统抗性是通过激活 ＳＡ信号转导途径实现的ꎮ 同时ꎬＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导处理后 ２４~
７２ ｈꎬＪＡ / ＥＴ信号转导途径调节基因 ＰＤＦ１.２被激活ꎬ且超量表达ꎬ表明在 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导烟草对 ＴＭＶ系统抗性的信号转
导过程中ꎬ可能存在 ＳＡ信号途径和 ＪＡ / ＥＴ信号途径的交叉协同作用ꎮ
关键词: 植物内生细菌ꎻ 系统诱导抗性ꎻ 信号转导ꎻ 烟草花叶病毒
Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎ ＥＢＳ０５ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ 　 ＺＨＡＯ Ｙｕ￣ｈｕａꎬ ＺＨＯＵ Ｒｕｉꎬ ＬＩ Ｊｕｎ￣ｚｈｏｕꎬ ＳＨＥＮ
Ｓｈｕｎ￣ｓｈａｎꎬ ＷＥＮ Ｃａｉ￣ｙｉ　 (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＢＳ０５ꎬ ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒꎬ ｈａｓ
ｓｔｒｏｎｇｌｙ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ (ＩＳＲ) ａｓ ｗｅｌｌ.
Ｔｈｅ ＩＳＲ ｅｌｉｃｉｔｏｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ
(ＲＴ￣ＰＣＲ) ａｎｄ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＥＢＳ０５Ｔ(ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ)
ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＥＢＳ０５ ｐｌａｙｅｄ ａ
ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ａｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｌｉｃｉｔｏｒ ｉｎ ＥＢＳ０５￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ. Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａ￣
ｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａꎬ ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ＮＰＲ１ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＳＡ￣ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｐａｔｈｗａｙ ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｏｎｓｔａｎｔｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ＰＲ１ｂ
ａｎｄ ＰＲ１ａꎬ ｉｎ ｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＩＳＲ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｄｅｐｅｎｄｅｄ ｏｎ ＳＡ￣ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｄｕｃ￣
ｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ｇｅｎｅ ＰＤＦ１.２ꎬ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｉｎ ＪＡ / ＥＴ￣ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙꎬ ｗａｓ
ｅｌｉｃｉｔｅｄ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ２４ ｈｏｕｒｓ ｔｏ ７２ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ. Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｒｏｓｓ￣ｔａｌｋ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＡ￣ ａｎｄ ＪＡ / ＥＴ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＩＳＲ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ ＥＢＳ０５ ｉｎ
ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐｌａｎｔ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａꎻ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎻ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎꎻ Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ
中图分类号: Ｓ４３２.１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０５２７￣０９
　 　 在植物内生细菌中ꎬ枯草芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ)是分离频率最高的菌群之一ꎮ 目前已从玉
米[１]、小麦[２]、辣椒[３]、番茄[４]、烟草[５]、甜瓜[６]、油
菜[７]等多种植物体内分离到内生枯草芽胞杆菌ꎬ
　
植物病理学报 ４４卷
其生物学作用ꎬ尤其是在植物病害生物防治方面的
应用潜力已引起国内外学者的广泛关注ꎮ 然而ꎬ已
报道的植物内生枯草芽胞杆菌ꎬ其生防作用主要是
针对植物真菌病害ꎬ有关植物内生枯草芽胞杆菌及
其代谢活性物质在植物病毒病害生物防治方面的
研究报道较少ꎮ
　 　 生防细菌的防病机理主要包括竞争、产生酶类
和抗菌活性物质、诱导植物系统抗性等几个方面ꎮ
近年来ꎬ人们对生防细菌的竞争、抗生及其对病原物
的直接作用等方面关注较多ꎬ而对生防细菌诱导植
物系统抗性的研究相对较少[８]ꎮ 在生防细菌诱导植
物系统抗性研究方面ꎬ最先取得进展的是以假单胞
菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ.)和沙雷氏菌(Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ.)为
代表的革兰氏阴性细菌对植物的诱导抗性机理研
究[９ꎬ１０]ꎮ 有关革兰氏阳性细菌对植物诱导抗性的研
究仅在少数种类如短小芽胞杆菌(Ｂ. ｐｕｍｉｌｕｓ)和解
淀粉芽胞杆菌 (Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)中有所报
道[１１ꎬ１２]ꎮ 自 Ｏｎｇｅｎａ (２００５ꎬ ２００７)等[１３~１５] 揭示了
Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ和 Ｂ. ｐｕｍｉｌｕｓ对大豆和烟草的诱导抗性机
理以来ꎬ有关芽胞杆菌的诱导抗性机理研究已逐渐
成为生防细菌防病机理研究的热点ꎬ其中以枯草芽
胞杆菌的诱导抗性机理研究最为广泛和深入ꎮ 研究
结果表明ꎬ不同种类的芽胞杆菌甚至同一种细菌的
不同菌株对不同植物诱导抗性的信号转导途径各不
相同[８]ꎮ 如 Ｂ. ｐｕｍｉｌｕｓ ＳＥ３４和 Ｔ４菌株诱导烟草对
野火病(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔａｂａｃｉ)的系统抗
性都是通过依赖 ＳＡ 信号途径实现的ꎻ但二者对拟
南芥的诱导抗性途径则不同ꎬＳＥ３４ 是通过依赖 ＪＡ
和 ＥＴ途径ꎬ而 Ｔ４则是通过 ＥＴ途径[１６]ꎮ
　 　 ＥＢＳ０５是从樟树植物组织中分离的一株内生
枯草芽胞杆菌ꎮ 该菌株具有较强的植物根际定殖
能力ꎬ对多种植物病原真菌和烟草花叶病毒具有稳
定的拮抗活性ꎬ其代谢活性物质具备耐酸碱、耐盐、
耐高温、抗生作用稳定等作为生防因子的优良特
性[１７]ꎮ 目前ꎬ已明确菌株 ＥＢＳ０５ 可产生脂肽类抗
菌活性物质 Ｌｅｕ７￣Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａꎬ并证明该活性物质
是 ＥＢＳ０５ 发挥生防作用的关键因子[１８]ꎮ 为了进
一步挖掘内生细菌 ＥＢＳ０５ 的生防潜力ꎬ本文对
ＥＢＳ０５诱导烟草抗烟草花叶病毒(Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ
ｖｉｒｕｓꎬＴＭＶ)的信号转导途径进行了研究ꎬ为进一
步明确其生防机制和新型抗病毒生物农药的研制
提供依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 试验材料
１.１.１　 供试寄主植物　 普通烟草品种 Ｋ３２６ꎮ
１.１.２　 供试病毒　 ＴＭＶ 普通株系于烟草 Ｋ３２６ 上
繁殖保存ꎮ
１.１.３　 供试菌株　 内生枯草芽胞杆菌 ＥＢＳ０５ 及其
突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔꎬ均由河南农业大学植物保护学
院植物病害生物防治研究室提供ꎮ
１.１. ４ 　 发酵培养基 　 可溶性淀粉 ３ ％、蛋白胨
２ ％、ＮａＣｌ ０.５ ％ꎮ
１.２　 试验方法
１.２.１　 ＥＢＳ０５发酵液及其活性物质的制备　 从斜面
培养基上挑取 １ 环 ＥＢＳ０５ 菌体ꎬ接种到发酵培养基
中ꎬ于 ３０°Ｃ、１８０ ｒ / ｍｉｎ 振荡培养 ２４ ｈ 后作为种子
液ꎮ 取种子液以 ３％的接种量接入新鲜发酵培养基
中ꎬ于 ３０°Ｃ、１８０ ｒ / ｍｉｎ 振荡培养 ３ ｄꎬ即得到菌体浓
度约为 １０８ ｃｆｕ / ｍＬ 的发酵液[１８]ꎮ 发酵液于 ４°Ｃ、
１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎꎬ上清液用６ ｍｏ１􀅰Ｌ－１ ＨＣｌ
调 ｐＨ 值至 ２.０ꎬ４°Ｃ下沉淀 １２ ｈꎬ１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心
２０ ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ收集沉淀ꎮ 将得到的沉淀用甲醇
提取 ３次后合并ꎬ冷冻干燥得到淡黄色粉末即为粗
提物ꎮ 粗提物样品经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０柱层析后ꎬ收
集活性洗脱液ꎬ再以氯仿 ∶ 甲醇 ∶ 水(６５ ∶ ２５ ∶ ４)洗
脱液进行硅胶柱层析ꎬ最后经制备型反相 Ｃ１８
ＨＰＬＣ分离制备ꎬ收集活性峰ꎬ收集液经冷冻干燥后
即得活性组分纯品(Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ)ꎮ
１.２.２ 　 突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔ的 Ｓｆｐ 和 ＳｒｆＡ 基因检
测[１９] 　 ＰＣＲ 扩增引物序列见表 １ꎮ Ｓｆｐ 基因的
ＰＣＲ反应体系 ２０ μＬꎬ包括 ２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
１０ μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ(１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１) 各 １ μＬ、模板 ｃＤ￣
ＮＡ １ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄｄＨ２ Ｏ ７ μＬꎮ 反应条件:
９５℃ ５ ｍｉｎꎬ３０ 个循环(９５℃ １ ｍｉｎ、４８℃ １ ｍｉｎ、
７２℃ １ ｍｉｎ)７２℃ ５ ｍｉｎꎬ４℃保存ꎮ ＳｒｆＡ 基因 ＰＣＲ
反应体系 ２０ μＬꎬ包括 ２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０
μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ(１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１)各 １ μＬ、模板 ＤＮＡ ２
μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄｄＨ２ Ｏ ６ μＬꎮ 反应条件: ９５℃
５ｍｉｎꎬ３０ 个循环 ( ９５℃ １ ｍｉｎ、 ５５℃ ３ ｍｉｎ、 ７２℃
３ ｍｉｎ)ꎬ７２℃ １５ ｍｉｎꎬ４℃保存ꎮ
１.２.３　 ＥＢＳ０５和 ＥＢＳ０５Ｔ对烟草促生作用的比较　 将
草炭土、蛭石、珍珠岩按质量比５ ∶ ２ ∶ １充分混匀后
８２５
　
　 ５期 赵玉华ꎬ等:内生细菌 ＥＢＳ０５对烟草诱导抗性的信号转导途径研究
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｓｆｐ ａｎｄ ＳｒｆＡ
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｓｆｐ ５′￣ＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡ￣３′
５′￣ＴＴＡＴＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＣＧＴＡＣＧ￣３′
ＳｒｆＡ ５′￣ＧＡＴＣＡＧＧＴＴＣＡＲＧＡＹＡＴＧＴＡＴＴＡ￣３′
　 ５′￣ＡＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＹＧＴＫＣＣ￣３′
　
分装营养钵(１８ ｃｍ × １８ ｃｍ)中ꎬ然后将温室培育
的烟苗移栽至营养钵ꎬ置于 ２６°Ｃ、相对湿度 ８５％的
恒温温室中培养ꎮ 培养 ７ ｄ后ꎬ选取长势一致的烟
苗ꎬ设置 ＥＢＳ０５Ｔ发酵液灌根及 ＥＢＳ０５ 发酵液灌根
２个处理ꎬ以灭菌培养基处理为对照ꎮ 每组处理 １５
株ꎬ发酵液用量为 ５０ ｍＬ /株ꎬ重复 ３次ꎮ ５０ ｄ后统
计各组处理的烟草植株叶片数、叶长、叶宽、株高、
叶片鲜重和干重的平均数ꎮ
１.２.４　 ＥＢＳ０５和 ＥＢＳ０５Ｔ对烟草普通花叶病防治效
果的比较　 选取长势一致的烟草植株ꎬ分别设置 ４
组处理:(１)ＥＢＳ０５Ｔ发酵液灌根处理后接种 ＴＭＶꎻ
(２)ＥＢＳ０５发酵液灌根处理后接种 ＴＭＶꎻ(３)灭菌
的液体培养基灌根处理后接种 ＴＭＶꎻ(４)清水灌根
处理后接种 ＴＭＶꎮ 每组处理 ２０ 株ꎬ发酵液和清水
用量均为 ５０ ｍＬ /株ꎬ选取烟草上部第 ３片叶摩擦接
种 ＴＭＶꎮ 处理 １４ ｄ后ꎬ调查发病情况ꎮ
　 　 烟草普通花叶病病害分级标准:０ 级ꎬ全株无
病ꎻ１级ꎬ心叶脉明或轻微花叶ꎬ或上部 １ / ３ 叶片花
叶ꎬ但不变形ꎬ植株无明显矮化ꎻ３ 级ꎬ１ / ３ ~ １ / ２ 叶
片花叶ꎬ或少数叶片变形ꎬ或主脉变黑ꎬ植株矮化为
正常株高的 ２ / ３以上ꎻ５ 级ꎬ１ / ２ ~ ２ / ３ 叶片花叶ꎬ或
变形或主侧脉坏死ꎬ或植株矮化为正常株高的 １ / ２
~２ / ３ꎻ７级ꎬ全株叶片花叶ꎬ严重变形或坏死ꎬ病株
矮化为正常株高的 １ / ３~１ / ２ꎮ
病情指数＝􀰑(各级病珠数
×各级级数)
调查总株数×７
×１００
防治效果＝(对照病情指数
－处理病情指数)
对照病情指数
×１００％
１.２.５　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检测[２０] 　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 扩
增引物序列见表 ２ꎬ试验所用试剂均购自 ＴａＫａＲａ
宝生物工程(大连)公司ꎮ 选取长势一致的烟草植
株ꎬ(１)用 ５０ ｍＬ 浓度为 １０ μｇ / ｍＬ 的 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ
溶液灌根处理 ７ ｄ后ꎬ于上部第 ３片叶采用汁液摩擦
接种 ＴＭＶ(Ｔ１)ꎻ(２)用 ５０ ｍＬ清水灌根处理 ７ ｄ后ꎬ
于上部第 ３片叶采用汁液摩擦接种 ＴＭＶ(Ｔ２)ꎻ(３)用
５０ ｍＬ清水灌根处理 ７ ｄ后ꎬ于上部第 ３片叶采用清
水摩擦接种处理(ＣＫ)ꎮ 接种处理后 １、１２、２４、７２ 和
１２０ ｈꎬ分别选取 ３株烟苗非接种 ＴＭＶ叶片的同一部
位ꎬ将采自 ３张叶片的样品混合后称重ꎬ于－８０°Ｃ冰
箱保存备用ꎮ 烟草叶片总 ＲＮＡ 提取和反转录 ＰＣＲ
分别参照试剂 ＲＮＡ ＴＲＩｚｏｌ® Ｒｅａｇｅｎｔ 和反转录试剂
盒 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ.
ＰＲ１ａ
５′￣ＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＡＣＡＧＣ￣３′
５′￣ＡＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧ￣３′
Ｘ１２７３７
ＰＲ１ｂ
５′￣ＧＡＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣ￣３′
５′￣ＣＴＣＣＡＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣ￣３′
Ｘ６６９４２
ＮＰＲ１
５′￣ＡＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧ￣３′
５′￣ＧＴＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＣ￣３′
ＡＦ４８０４８８
ＰＤＦ１.２
５′￣ＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＧ￣３′
５′￣ＡＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＣＧ￣３′
Ｘ９９４０３.１
β￣ａｃｔｉｎ
５′￣ＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＡＧ￣３′
５′￣ＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＧＧＧＴＴＧＡＧ￣３′
Ｕ６０４９５
９２５
　
植物病理学报 ４４卷
(Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)使用说明进行ꎮ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
检测参照荧光定量试剂盒 ＳＹＢＲ® Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭⅡ
(Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ)使用说明ꎬ稍加改进ꎮ 反应体系 １２
μＬꎬ包括 ＳＹＢＲ® Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ(２×) ６ μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ
(１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１)各 ０.５ μＬ、模板 ｃＤＮＡ(稀释 ５倍)１
μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ４ μＬꎮ 反应条件:９５°Ｃ ２ ｍｉｎꎬ４０个循环
(９５°Ｃ １０ ｓ、５６°Ｃ １５ ｓ、７２°Ｃ １５ ｓ)ꎬ设置溶解曲线ꎬ反
应结束后ꎬ查看结果ꎬ导出数据ꎬ基因的相对表达量利
用 ２－△△Ｃｔ方法分析基因转录的差异ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 诱导抗性激发子的验证
２.１.１　 ＥＢＳ０５Ｔ菌株 Ｓｆｐ 和 ＳｒｆＡ 基因的 ＰＣＲ 检测
结果　 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 是枯草芽胞杆菌通过非核糖体途
径合成的一类重要的抗菌肽活性化合物ꎬ其生物合
成由非核糖体肽链合成酶( ｎｏｎ￣ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓꎬ ＮＲＰｓ)完成ꎮ 其中ꎬＳｒｆＡ 基因是 ＮＲＰｓ
基因操纵子的重要编码基因之一ꎬ直接参与脂肽的
生物合成ꎮ Ｓｆｐ基因位于操纵子起始密码子的 ３０.５
ｋｂ处ꎬ具有编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶ꎬ并激活
ＮＲＰｓ的功能ꎮ 因此ꎬＳｆｐ 和 ＳｒｆＡ 基因在 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
的生物合成过程中都是不可缺少的ꎮ 目前ꎬ通过检
测 Ｓｆｐ和 ＳｒｆＡ基因来快速鉴定产脂肽类生物表面
活性素枯草芽胞杆菌已成为重要的筛选途
径[２１ꎬ２２]ꎮ 从试验结果(图 １)可以看出ꎬ原始菌株
ＥＢＳ０５的 ＰＣＲ扩增结果显示清晰的 Ｓｆｐ 和 ＳｒｆＡ 条
带ꎬ而突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔ的 ＰＣＲ 扩增结果为阴性ꎮ
表明ꎬ突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔ的 Ｓｆｐ和 ＳｒｆＡ基因缺失ꎬ不
能正常合成 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａꎮ
２.１.２　 ＥＢＳ０５ 和 ＥＢＳ０５Ｔ对烟草促生作用的比较
　
Ｆｉｇ. １　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｆｐ ａｎｄ ＳｒｆＡ ｇｅｎｅｓ
试验结果见表 ３ꎮ ＥＢＳ０５Ｔ发酵液处理后ꎬ烟草植株
的平均叶片数、叶长、叶宽、株高、叶片鲜重及干重
等生理指标均与对照一致ꎬ且显著低于原始菌株
ＥＢＳ０５发酵液处理ꎮ 表明 ＥＢＳ０５ 对烟草的促生作
用与其能否产生 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ密切相关ꎮ
２.１.３　 ＥＢＳ０５ 和 ＥＢＳ０５Ｔ对烟草普通花叶病防治
效果的比较　 试验结果见表 ４ꎮ 突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔ
发酵液对烟草花叶病的防治效果仅为 １９.０８％ꎬ显
著低于原始菌株 ＥＢＳ０５ 发酵液处理ꎮ 由此可见ꎬ
内生细菌 ＥＢＳ０５能否合成 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ是其防治烟
草普通花叶病的关键因素ꎮ
２.２　 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导处理后相关基因的表达差异
２.２.１　 ＮＰＲ１ 基因表达差异 　 试验结果如图 ２ 所
示ꎮ 从图中可以看出ꎬ经 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处理和
清水处理再接种 ＴＭＶ 后ꎬ烟草体内 ＮＰＲ１ 基因表
达量均呈先缓慢增加随后缓慢下降的变化趋势ꎮ
Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处理再接种 ＴＭＶ 后ꎬ烟草体内
ＮＰＲ１基因表达量从１２ ｈ起显著增加 ꎬ至７２ ｈ时
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒａｉｎ
ＥＢＳ０５ ａｎｄ ＥＢＳ０５Ｔ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ＥＢＳ０５ ＥＢＳ０５Ｔ ＣＫ
Ｌｅａｆ ｎｕｍｂｅｒ / ｌｅａｆ １５.８０± １.９２ ａ １１.４０±１.５２ ｂ １０.８０± ０.８４ ｂ
Ｌｅａｆ ｌｅｎｇｔｈ / ｍｍ １５８.６８±１１.６２ ａ ５９.５６±６.８９ ｂ ５３.９３±１０.１７ ｂ
Ｌｅａｆ ｗｉｄｔｈ / ｍｍ ７９.６３± ７.７９ ａ ３９.６８±３.１３ ｂ ３７.９８± ４.６９ ｂ
Ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔ / ｍｍ １５４.７９±１０.６７ ａ ６２.６１±６.１２ ｂ ６３.３１± ７.８７ ｂ
Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ / ｇ １４.５１± １.６３ ａ ２.８０±０.４６ ｂ ２.５８± ０.３９ ｂ
Ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ / ｇ １.３６± ０.０８ ａ ０.３６±０.２６ ｂ ０.３３± ０.２２ ｂ
　 Ｄａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｉｎｅ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ (Ｐ≤０.０５) .
０３５
　
　 ５期 赵玉华ꎬ等:内生细菌 ＥＢＳ０５对烟草诱导抗性的信号转导途径研究
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒａｉｎ ＥＢＳ０５ ａｎｄ ＥＢＳ０５Ｔ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ / ％
ＥＢＳ０５ １１.６５ ６７.３８ ａ
ＥＢＳ０５Ｔ ３２.１１ １９.０８ ｂ
Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ４８.７６ １.８５ ｃ
ＣＫ ５１.２５
　 Ｄａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ (Ｐ≤０.０５) .
达到最高值ꎬ约增加 ２.２倍ꎻ而清水处理再接种 ＴＭＶ
后ꎬ烟草体内 ＮＰＲ１基因表达量则从 ２４ ｈ 起逐渐增
加ꎬ至 ７２ ｈ 时达到最大值ꎬ约增加 １.４ 倍ꎮ 但是ꎬ
经 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导处理再接种 ＴＭＶ 后 １２ ~ １２０ ｈꎬ
ＮＰＲ１基因表达量均显著高于同期的其他处理ꎮ 从
诱导表达时间看ꎬＮＰＲ１ 基因较 ＰＲ１ａ 和 ＰＤＦ１.２ 基
因早ꎬ且表达量增加显著ꎮ 由此可见ꎬＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ处
理后ꎬ首先诱导烟草体内 ＮＰＲ１基因的表达ꎮ
２.２.２　 ＰＲ１ａ 基因表达差异 　 试验结果如图 ３ 所
示ꎮ 从图中可以看出ꎬ经 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处理再
接种 ＴＭＶ后ꎬ烟草体内 ＰＲ１ａ 基因表达量呈先增
加随后降低的变化趋势ꎮ 处理后 １~２４ ｈꎬＰＲ１ａ基
Ｆｉｇ. ２　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ (Ｐ≤０.０５)ꎻ Ｔ１: Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ＋ＴＭＶꎻ
Ｔ２: Ｗａｔｅｒ＋ＴＭＶꎻ ＣＫ: Ｗａｔｅｒ ＋ ｎｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
Ｆｉｇ. ３　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰＲ１ａ ｇｅｎｅ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ (Ｐ≤０.０５)ꎻ Ｔ１: Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ ＋ ＴＭＶꎻ
Ｔ２:Ｗａｔｅｒ ＋ ＴＭＶꎻＣＫ:Ｗａｔｅｒ ＋ ｎｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
１３５
　
植物病理学报 ４４卷
因表达量略有增加ꎬ但差异不显著ꎬ处理后 ７２ ｈꎬ表
达量急剧增加ꎬ并达到最大值ꎬ同比增加 １１７.５ 倍ꎬ
与未经诱导处理间存在极显著差异ꎮ 诱导处理再
接种 ＴＭＶ 后 １２０ ｈꎬＰＲ１ａ 基因表达量降低ꎬ但仍
显著高于未经诱导处理ꎻ清水处理再接种 ＴＭＶ
后ꎬ烟草体内 ＰＲ１ａ 基因的表达量很低ꎬ且均无显
著差异ꎬ表明 ＰＲ１ａ 基因的超量表达是 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ
诱导的结果ꎬ而与 ＴＭＶ 的侵染无关ꎮ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ
诱导处理后ꎬＰＲ１ａ 基因的诱导表达时间较 ＮＰＲ１
基因晚ꎬ但相对表达量显著增加的幅度更大ꎮ
２.２.３　 ＰＲ１ｂ 基因表达差异 　 试验结果如图 ４ 所
示ꎮ 从图中可以看出ꎬ经 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处理和
清水处理再接种 ＴＭＶ 后ꎬＰＲ１ｂ 基因表达量均呈
先增加后降低的变化趋势ꎮ 其中ꎬＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导
处理后ꎬＰＲ１ｂ 基因表达量显著增加ꎬ至 ７２ ｈ 达到
最大值ꎬ约增加 ２１倍ꎬ至 １２０ ｈ 时ꎬ表达量降低ꎬ但
显著高于其他处理ꎻ从表达时间来看ꎬＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ
诱导处理后ꎬＰＲ１ｂ 基因与 ＮＰＲ１ 基因诱导表达同
步ꎬ但相对表达量较 ＮＰＲ１ 基因高ꎮ ＴＭＶ 侵染虽
然在一定程度上诱导烟草体内 ＰＲ１ｂ 基因表达ꎬ但
是表达时间滞后ꎬ相对表达量低ꎬ与对照差异不大ꎮ
因此ꎬＰＲ１ｂ基因的超量表达主要是 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱
导的结果ꎮ
２.２.４　 ＰＤＦ１.２基因表达差异　 试验结果如图 ５所示ꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰＲ１ｂ ｇｅｎｅ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ (Ｐ≤０.０５)ꎻ Ｔ１: Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ ＋ ＴＭＶꎻ
Ｔ２: Ｗａｔｅｒ ＋ＴＭＶꎻ ＣＫ: Ｗａｔｅｒ ＋ ｎｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰＤＦ１.２ ｇｅｎｅ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ (Ｐ≤０.０５)ꎻ Ｔ１: Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ＋ＴＭＶꎻ
Ｔ２: Ｗａｔｅｒ ＋ ＴＭＶꎻ ＣＫ: Ｗａｔｅｒ ＋ ｎｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
２３５
　
　 ５期 赵玉华ꎬ等:内生细菌 ＥＢＳ０５对烟草诱导抗性的信号转导途径研究
从图中可以看出ꎬ经 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处理再接种
ＴＭＶ后ꎬＰＤＦ１.２基因表达量呈先增加随后迅速降
低的变化趋势ꎮ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导处理再接种 ＴＭＶ
后 １~１２ ｈꎬＰＤＦ１.２基因表达量与其他处理差异不
明显ꎬ接种 ＴＭＶ 后 ２４ ｈꎬ其表达量显著增加ꎬ至
７２ ｈ达到最大值ꎬ约增加 ５. ５ 倍ꎬ接种 ＴＭＶ 后
１２０ ｈ时ꎬ表达量迅速降低至诱导处理前的表达水
平ꎻ而清水处理再接种 ＴＭＶ 后ꎬ烟草体内 ＰＤＦ１.２
基因表达量极低ꎬ且无显著差异ꎮ 由此可见ꎬＴＭＶ
对寄主植物的侵染ꎬ不能激活烟草体内 ＰＤＦ１.２ 基
因的表达ꎻＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导处理后ꎬＰＤＦ１.２ 基因仅
在接种 ＴＭＶ后 ２４~７２ ｈ内表达量增加ꎬ但是其相
对表达量均明显低于 ＮＰＲ１、ＰＲ１ａ和 ＰＲ１ｂ基因ꎮ
３　 讨论
　 　 生防细菌对植物系统诱导抗性的诱导方式主
要包括两个方面ꎬ一是通过生防细菌的群体感应信
号分子ꎬ以细胞密度依赖方式调控生防细菌与寄主
植物间的互作ꎬ从而诱导植物的防卫反应[２３]ꎬ即生
防细菌本身是诱导因素ꎻ另一方面是以生防细菌产
生的挥发性物质(Ｖｏｌａｔｉｌｅｓ)或代谢活性物质为信
号分子介导植物产生各种防卫反应ꎬ即生防细菌代
谢过程中产生的小分子活性物质是其诱导植物抗
性的诱导因子[２４]ꎮ 这是生防细菌对寄主植物诱导
抗性机理方面的重大研究进展ꎬ同时ꎬ也为研究诱
导抗性机理带来了方法学上的挑战ꎬ因为传统的空
间隔离接种并不能完全排除其他作用方式对研究
结果的影响ꎬ因此ꎬ基于分子生物学技术的突变体
和分子标记已成为研究生防细菌诱导抗性机理的
理想材料ꎮ 一般来说ꎬ与野生型生防细菌相比ꎬ如
果丧失抗生素产生能力的突变菌株的抑菌和防病
能力显著降低或消失ꎬ恢复突变后ꎬ抑菌和防病能
力也恢复ꎬ则认为该细菌产生的抗生素对病害防治
起关键作用ꎮ 基于对芽胞杆菌产生 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 的功
能基因检测是评价其生防潜力的有效方法[２５ꎬ２６]ꎬ
本研究中ꎬ突变菌株 ＥＢＳ０５Ｔ的 Ｓｆｐ 和 ＳｒｆＡ 基因
ＰＣＲ扩增结果为阴性ꎬ通过 ＴＬＣ检测ꎬ其代谢产物
中不含有脂肽类抗生素ꎬ表明该突变菌株丧失了产
生 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 的能力ꎮ 空间隔离接种试验证明ꎬ
ＥＢＳ０５Ｔ对烟草植物既不表现促生作用ꎬ也无防治
效果ꎮ 由此可见ꎬ内生细菌 ＥＢＳ０５ 代谢活性物质
Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 是其生防作用的关键因子ꎬ该结果与
Ｒｏｍｅｒｏ等[２７]的报道一致ꎮ Ｏｎｇｅｎａ 等[１４ꎬ１５]研究结
果表明ꎬ枯草芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素 Ｓｕｒ￣
ｆａｃｔｉｎ 和 Ｆｅｎｇｙｃｉｎ 是诱导寄主植物产生防卫反应
的有效激发子(ｅｌｉｃｉｔｏｒ)ꎮ 鉴于产生抗生素或生物
活性物质是植物内生生防细菌发挥防病作用的重
要机制之一ꎬ 前期研究发现 ＥＢＳ０５ 的防病效果与
其定殖和产生活性物质的能力有密切关系[１８]ꎬ因
此ꎬ本研究通过突变体空间隔离接种和 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ
诱导处理试验ꎬ证实了 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 是内生细菌
ＥＢＳ０５诱导烟草对 ＴＭＶ系统抗性的有效激发子ꎮ
　 　 植物诱导抗性是激发子￣寄主植物￣病原物互
作ꎬ并触发一系列时序性的防卫反应ꎬ 其中涉及到
多种信号转导途径ꎮ 目前ꎬ研究较为深入的信号转
导途径包括 ＳＡ信号转导途径和 ＪＡ / ＥＴ 信号转导
途径ꎮ 不同诱导物甚至同一种诱导物对于不同寄
主植物￣病原物体系ꎬ其信号转导途径各不相
同[２８]ꎮ 因此ꎬ要阐明生防细菌对植物的诱导抗性
机理ꎬ必须系统研究生防细菌及其代谢活性物质对
寄主植物诱导抗性的信号转导途径和调控模式ꎮ
本研究中ꎬＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导处理后ꎬＮＰＲ１基因首先
被激活ꎬ并持续超量表达ꎬ进而触发 ＰＲ１ｂ 和 ＰＲ１ａ
基因的超量表达ꎬ其中ꎬ经诱导处理再接种 ＴＭＶ
后 ７２ ｈꎬＰＲ１ｂ 和 ＰＲ１ａ 基因表达量分别同比增加
２１倍和 １１７.５倍ꎮ ＮＰＲ１基因是 ＳＡ信号转导途径
的关键调节基因ꎬ同时也参与 ＳＡ 信号途径和
ＪＡ / ＥＴ信号途径间的调节和联系ꎬ该基因过量表达
可激活植物的多种防卫基因ꎬ提高寄主植物抗病
性[２９ꎬ３０]ꎮ 由此可以推测ꎬ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 对烟草抗
ＴＭＶ的诱导抗性是通过激活 ＳＡ 信号转导途径实
现的ꎮ 同时ꎬＳｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ 诱导处理后ꎬ除 ＳＡ 信号
途径相关的 ＮＰＲ１、ＰＲ１ａ 和 ＰＲ１ｂ 基因持续超量表
达外ꎬＰＤＦ１.２基因也在诱导处理后 ２４ ~ ７２ ｈ 期间
超量表达ꎬ最大表达量同比增加 ５. ５ 倍ꎬ表明在
Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ａ诱导烟草对 ＴＭＶ系统抗性的信号转导
过程中ꎬ可能存在 ＳＡ信号途径和 ＪＡ / ＥＴ信号途径
的交叉协同作用(Ｃｒｏｓｓ￣ｔａｌｋ)ꎮ
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ｍｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ[ Ｊ] .
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ｔｒｏｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏ￣
ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ６９(１):２９－３８.
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Ｍ４ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｐｌａｎｔ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｈｏｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆ￣
ｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
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ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｓ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓ ｏｆ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ[ Ｊ] . Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ￣
ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｇｙꎬ２００７ꎬ９(４):１０８４－１０９０.
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ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅ￣
ｒｉａ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｇａｉｎｓｔ ｔｗｏ ｐａｔｈｏｖａｒｓ ｏｆ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ [ Ｊ] . Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ ２００３ꎬ
１６０:４１３－４２０.
[１７] Ｗｅｎ Ｃ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｋ Ｘꎬ Ｗａｎｇ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ
ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＥＢＳ０５ ｉｎ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｉｔｓ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｗｈｅａｔ ｓｈａｒｐ ｅｙｅｓｐｏｔ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] .
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[１８] Ｗｅｎ Ｃ Ｙꎬ Ｙｉｎ Ｚ Ｇꎬ Ｗａｎｇ Ｋ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＢＳ０５ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ [ Ｊ ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ２０１１ꎬ２７(４):３４２－３４８.
[１９] Ｈｓｉｅｈ Ｆ Ｃꎬ Ｌｉ Ｍ Ｃꎬ Ｌｉｎ Ｔ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＣＲ[ Ｊ] .
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ４９(３):１８６－１９１.
[２０] Ｚｈａｎｇ Ｗꎬ Ｙａｎｇ Ｘ Ｆꎬ Ｑｉｕ Ｄ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｅａ Ｔ１￣ｉｎｄｕｃｅｄ
ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｏｌｌｏｗｓ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ
ａｃｉｄ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
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　 ５期 赵玉华ꎬ等:内生细菌 ＥＢＳ０５对烟草诱导抗性的信号转导途径研究
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[２１] Ｗａｎｇ Ｄ Ｗꎬ Ｚｈａｎｇ Ｊꎬ Ｊｉａｎｇ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ(生物
技术通报)ꎬ２０１１ꎬ(９):１４２－１４６.
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[２３] Ｃｏｍｐａｎｔ Ｓꎬ Ｄｕｆｆｙ Ｂꎬ Ｎｏｗａｋ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｓｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ
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ｄｉｓｅａｓｅｓ: Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓꎬ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ
ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ[Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
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ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ａｎｄ ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ
Ｄ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ.ꎬ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｔｏ ｆｕｎｇａｌ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃａｎｏｌａ ａｎｄ ｗｈｅａｔ[Ｊ] . Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
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[２６] Ｓｕｏ Ｙ Ｌꎬ Ｇｕｏ Ｒ Ｊꎬ Ｌｉ Ｓ Ｄ. Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
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Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ(植物细菌病害与植物病害生物
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[２７] Ｒｏｍｅｒｏ Ｄꎬ ｄｅ Ｖｉｃｅｎｔｅ Ａꎬ Ｒａｋｏｔｏａｌｙ Ｒ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ
Ｉｔｕｒｉｎ ａｎｄ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｋｅｙ
ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｔｏｗａｒｄ
Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｆｕｓｃａ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ２００７ꎬ２０(４):４３０－４４０.
[２８] Ｎｕｎｅｚ￣Ｐａｓｔｒａｎａ Ｒꎬ Ａｒｃｏｓ￣Ｏｒｔｅｇａ Ｇ Ｆꎬ Ｓｏｕｚａ￣Ｐｅｒｅｒａ Ｒ
Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｔｈｙｌｅｎｅꎬ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｒ ｍｅｔｈｙｌ
ｊａｓｍｏｎａｔｅꎬｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｈｙｔｏ￣
ｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ ｉｎ Ｈａｂａｎｅｒｏ ｐｅｐｐｅｒ [ Ｊ ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１３１(４):６６９－６８３.
[２９] Ｓｐｏｅｌ Ｓ Ｈꎬ Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ Ａꎬ Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ Ｓ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. ＮＰＲ１
ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｒｏｓｓ￣ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ￣ａｎｄ ｊａｓｍｏｎａｔｅ￣
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ２００３ꎬ１５(３):７６０－７７０.
[３０] Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｎｔ Ｓꎬ Ｖａｎ Ｗｅｅｓ Ｓ Ｃ Ｍꎬ Ｐｉｅｔｅｒｓｅ Ｃ Ｍ Ｊ.
Ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓ￣
ｔａｎｃｅ￣ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ [ Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ￣
ｔｒｙꎬ２００９ꎬ７０:１５８１－１５８８.
责任编辑:于金枝
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