全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&内蒙古自然科学基金"
!"#"23"&
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#&国家现代农业产业技术体系建设专
项"
4567*"*8*$
#&内蒙古农业大学科技创新团队项目"
9:;:!"#"*
#
作者简介$高彩婷"
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#!女!讲师!在读博士研究生!主要从事耕作制度与农业生态系统研究
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通信作者$刘景辉!教授!博士生导师!主要从事耕作制度与农业生态系统研究
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B>C?
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D
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#-%,BA=
燕麦盐胁迫响应基因的差异
表达与生理响应的关系
高彩婷#!!刘景辉#"!徐寿军!!张玉芹!!于华荣!
"
#
内蒙古农业大学 农学院!呼和浩特
"#""#)
&
!
内蒙古民族大学 农学院!内蒙古通辽
"!"""
#
摘
!
要$以耐盐燕麦品种
E5F*)
为材料!通过
G?C=/1>
测序与数字基因表达谱技术对
%""==A?
%
H9>4?
处理前后
的叶片
B:95
文库进行
695*7I
J
与
:K<
分析!同时测定
"
"
4L
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#""
(
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(
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(
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%
H9>4?
胁迫下
E5F*)
幼苗叶片的相对电导率(丙二醛含量和脯氨酸含量!探讨燕麦盐胁迫响应基因的差异表达与生理响应的关系结
果表明$"
#
#
695*7I
J
分析得到
M1/
N
I1I0-$"#
条!其基因表达呈现高度的不均一性和冗余性&若差异基因表达谱
鉴定分析以
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N!
6>O/A
#
!
且
P:6
值
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为选择标准!则发现上调和下调表达基因在胁迫
",$D
时分别有
%"-
和
-+
个!在胁迫
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时分别有
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和
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个!胁迫
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时分别有
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和
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个"
!
#
L代谢分析显示!有
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条
M1/
N
I1I0
比对到
L中的
#!
条代谢途径!包括与逆境胁迫相关的植物激素信号转导途径(
584
转
运蛋白途径(肌醇磷酸代谢途径(渗透调节途径等"
%
#在
%""==A?
%
H9>4?
处理下燕麦叶片的相对电导率(丙二
醛含量(脯氨酸含量等生理指标的变化与相关差异表达基因的变化趋势基本一致!说明基因差异表达量与生理反
应密切相关研究认为!在相同的栽培及胁迫处理条件下!可根据植物盐响应生理指标的变化判断耐盐基因的表
达情况
关键词$燕麦&盐胁迫&
G?C=/1>
测序&表达谱&生理响应
中图分类号$
Q)+$,&
&
Q&)
文献标志码$
5
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A10I
!!
土壤盐渍化是世界土壤的主要问题之一!据联
合国粮农组织统计!全球陆地的
-_
以上已经盐渍
化!不合理的耕作灌溉造成现有的可耕地不断次生
盐渍化种植耐盐植物!改良植物耐盐性是修复盐
渍土最经济有效的途径新一代高通量测序技术为
挖掘耐盐基因(研究植物对盐胁迫的响应机制(揭示
其耐盐机理提供了更简单(经济的方法!为改良植物
耐盐性(培育耐盐新品种提供理论依据
燕麦是禾本科"
KV>=/1I>I
#燕麦属"
!"#$%
#一
年生草本植物!具有耐旱(耐盐碱(耐瘠薄等特点!可
作为盐碱地改良的替代作物)#*国内对于燕麦耐盐
性的研究主要集中在栽培耕作措施 )!*%*和生理生化
指标)+*两方面!对燕麦耐盐分子机制的研究鲜见报
道植物耐盐分子机制的研究在其它植物上取得了
一定进展!找到了部分耐盐相关基因!如钾离子转运
蛋白(钠离子转运体(
T
`
*5;a>0I
(
9>
`
%
T
`逆向运
输蛋白以及脯氨酸合成途径的关键酶+++
"
#
*
吡咯
啉
*$*
羧酸合成酶"
a$47
#基因等)$**有研究发现!
拟南芥钾离子转运蛋白基因
!&()#
&
#
可以通过
与
*+*%
的作用抑制根部
9>
`的过度积累)*&水稻中
的
9>
`转运体
,*()#
&
#
和
,*()#
&
$
可通过
控制
9>
`的移动来调节水稻中
L
`
%
9>
`的比率!在
盐胁迫条件下维持根中高的
L
`浓度和低的
9>
`浓
度)#"*#!*&小麦
9>
`
%
T
`反转运蛋白基因
)%-.#
在幼苗经
+""==A?
%
H9>4?
处理
#D
后!其转录水
平有所提高)#%*盐胁迫等胁迫条件可诱导
/$01
基因表达!促进脯氨酸积累!调节细胞的渗透平
衡)#+*盐芥幼苗用
!""==A?
%
H9>4?
处理
!D
后!
其中
/$01
基因表达量是对照的
!
倍)#$*
不同植物或同一植物的不同品种耐盐性不同!
不同盐浓度处理下!基因表达量与表达时间不同!植
物所表现的生理生化反应也不同因此在没有燕麦
基因组信息的条件下!可利用高通量测序技术查找
燕麦盐胁迫响应基因!研究其差异表达情况!并通过
对盐胁迫下短期内燕麦的生理响应的研究探索二者
之间的关系本研究以筛选出的耐盐燕麦品种
E5F*)
为材料!用
G?C=/1>
测序!得到燕麦盐胁迫
的转录组及表达谱信息!比较分析燕麦盐胁迫处理
前后转录水平上的表达谱变化!为发现燕麦耐盐基
因(深入研究其耐盐机制奠定基础&同时!利用水培
法研究盐胁迫下
!+D
内燕麦的生理生化变化!旨在
为燕麦耐盐分子机理的研究提供生理参考依据!并
依据转录组与表达谱实验结果进一步探讨盐胁迫下
燕麦的生理响应与基因差异表达的关系
#
!
材料和方法
=,=
!
试验材料
选用加拿大综合性状好(耐盐性强的燕麦品种
E5F*)
为试验材料浸种催芽后!分
%
组于
!"b
光照下培养
!
周!一叶期水培!之后用
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N
?>13
营
养液培养
#+3
后!一组正常培养作对照&一组用
%""==A?
%
H9>4?
胁迫处理!分别取未处理"
4L
#和
处理后
",$
(
%
(
!+D
相同部位叶片!依次定为
5
(
8
(
4
(
:
样!混样提取总
695
!用于转录组测序!分样
用于表达谱分析&一组用
"
(
#""
(
!""
(
!$"
(
%""
==A?
%
H9>4?
处理
",$
(
%
(

(
!+D
!取相同部位叶片
作生理测试
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!
.@9
提取及测序文库的构建
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法提取叶片总
695
后)#-*!用带有
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N
A
"
3;
#的磁珠富集纯化
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!加入
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N
=I1O>*
O/A1@CZZIV
将
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打断成短片段!并以
=695
为模板!反转录合成
B:95
链!经
Q/>QC/Bca46
试
剂盒纯化(
<8
缓冲液洗脱后做末端修复(加
5
并连
接测序接头!用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择!
最后进行
a46
扩增!构建测序文库!用
G?C=/1>
T/7I
J
;W
!"""
进行测序)#&*
=,A
!
生理指标测定
用抽气法)#*测定叶片相对电导率!茚三酮比色
法)#*测叶片游离脯氨酸含量!硫代巴比妥酸法)#)*测
叶片丙二醛"
W:5
#含量
=,B
!
数据处理及生物信息学分析
使用
<\BI?
及
7a77
"
#,"
版#处理分析
%
个生
-%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
理指标数据!用
T/7I
J
BA1OVA?0AZO[>VI
分析测序数
据!参考
5C3/B
等)!"*的方法筛选差异表达基因!进
行表达谱"
:K<
#
)
!#
*分析
!
!
结果与分析
?,=
!
测序结果及质量分析
转录组测序得到
&&$!+#+
原始短读长序列!
去掉接头(低质量的序列得
-$+!++%-
条干净的短
读长序列!且
Q!"
达
)+,_
!不确定碱基比例为
"
!
K4
含量
$!,)$_
"表
#
#!拼接后得到平均长度为
-+$@
]
的
M1/
N
I1I0-$"#
条!说明转录组测序质
量较高!可以进行表达谱测序通过与
96
"
1A1VI*
3C13>1O1CB?IAO/3I0
#(
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L"
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#和
KF
"
N
I1IA1*
OA?A
NY
#等数据库进行比对注释!发现燕麦叶片转录
组中有大量响应盐胁迫(干旱胁迫(温度胁迫等逆境
胁迫的基因"表
!
#
表
=
!
测序数据量统计
;>@?I#
!
7I
J
CI1B/1
N
ACO
]
CO0C==>V
Y
原始数据
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过滤后数据
;AO>?B?I>1VI>30
总的净核苷酸
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"
1O
#
质量不低于
!"
的百分比
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]
IVBI1O>
N
I
不确定的碱基比例
9
]
IVBI1O>
N
I
碱基
K
和
4
的百分比
K`4
]
IVBI1O>
N
I
&&$!+#+ -$+!++%- $#))!+" )+,_ ",""_ $!,)$_
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9AOI
$
;AO>?B?I>11CB?IAO/3I0d;AO>?B?I>1VI>30#e6I>3#0/^I` ;AO>?B?I>1VI>30!e6I>3!0/^I,Q!"
]
IVBI1O>
N
I/13/B>OI0ODI
]
IVBI1O>
N
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J
CI1BI0[/OD0I
J
CI1B/1
N
IVVAVV>OI?A[IVOD>1#_,
表
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!
燕麦响应盐胁迫的相关基因
;>@?I!
!
KI1I0/1VI0
]
A10IOA0>?O0OVI00/1A>O
盐胁迫响应相关基因类型
KI1IO
Y]
I/1VI0
]
A10IOA0>?O0OVI00
盐胁迫响应相关基因
KI1I/1VI0
]
A10IOA0>?O0OVI00
M1/
N
I1I
数目
9C=@IVAZM1/
N
I1I
转录因子
;V>10BV/
]
O/A1Z>BOAV
954 ##
WU8 )#
5a! &#
T:*2Ga ++
f6LU #
伴侣蛋白
4D>
]
IVA1I
]
VAOI/1
4?
]
!+
31>R &+
逆向转运蛋白
51O/
]
AVOIV
钠%氢逆向转运蛋白
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D
Y
3VA
N
I1>1O/
]
AVOIV
"
9T<
#
#!
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T
`逆向转运蛋白
9>
`
%
T
`
>1O/
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AVOIV
"
9TS
#
+
阳离子%
T
`逆向转运蛋白
4>O/A1
%
T
`
>1O/
]
AVOIV
"
4TS!"
#
+
阳离子转运
4>O/A1OV>10
]
AVOIV
T
`
(钠离子载体
T
`
>1O/
]
AVOIV
&
0A3/C=/A1
%
]
VAOA1
"
4a5#Z>=/?
Y
OV>10
]
AVOIV
#
!+
高亲和性钾离子转运载体
TL; ##
钾离子转运体
L
`
OV>10
]
AVOIV
##
阳离子%
T
`反向载体
45S
#!
阳离子通道
4>O/A1BD>11I?
内向整流钾通道
G1[>V3?
Y
VIBO/Z
Y
/1
N]
AO>00/C=BD>11I?
"
5L;
#

电压
*
门控钾通道
EA?O>
N
I*
N
>OI3
]
AO>00/C=BD>11I? +
钙通道
4>?B/C=BD>11I?
渗透调节的关键酶
LI
Y
I1^
Y
=IAZA0=AO/B0
Y
1ODI0/0
"
#
*
吡咯啉
*$*
羧酸脱氢酶
:I?O>*#*
]Y
VVA?/1I*$*B>V@AY
?>OI3ID
Y
3VA
N
I1>0I
##
吡咯啉
*$*
羧酸还原酶
a
Y
VVA?/1I*$*B>V@AY
?>OIVI3CBO>0I )
海藻糖
*-*
磷酸合酶
;VID>?A0I*-*
]
DA0
]
D>OI0
Y
1OD>0I #)
甘露醇脱氢酶
W>11/OA?3ID
Y
3VA
N
I1>0I !#
抗氧化物酶活性
51O/A\/3>1OI1^
Y
=I>BO/X/O
Y
过氧化物酶
aIVA\/VI3A\/1 #%
硫氧还蛋白
;D/AVI3A\/1 -#
蛋白质二硫键异构酶
aVAOI/13/0C?Z/3I*/0A=IV>0I #&
谷胱甘肽过氧化物酶
K?CO>OD/A1I
]
IVA\/3>0I #%
过氧化氢酶
4>O>?>0I %
铜%锌
*
超氧化物歧化酶
4C
%
21*7F: +
锰
*
超氧化物歧化酶
W1*7F: !
铁
*
超氧化物歧化酶
PI*7F: !
抗坏血酸过氧化物酶
50BAV@>OI
]
IVA\/3>0I #!
谷胱甘肽还原酶
K?CO>OD/A1IVI3CBO>0I %
血红素加氧酶
TI=IAYN
I1>0I %
&%#
&
期
!!!!!!!!!!!
高彩婷!等$燕麦盐胁迫响应基因的差异表达与生理响应的关系
!!
续表
!
!
4A1O/1CI3;>@?I!
盐胁迫响应相关基因类型
KI1IO
Y]
I/1VI0
]
A10IOA0>?O0OVI00
盐胁迫响应相关基因
KI1I/1VI0
]
A10IOA0>?O0OVI00
M1/
N
I1I
数目
9C=@IVAZM1/
N
I1I
其它响应胁迫的基因
FODIV
N
I1I0VI?>OI3OA0OVI00VI0
]
A10I
P*@A%
P8: #%"
T
`
*5;a
酶
T
`
*5;a>0I
%+
胚胎发育晚期丰富蛋白
H>OII=@V
Y
A
N
I1I0/0>@C13>1O
]
VAOI/1
"
H<5
#
+)
低温诱导蛋白
HA[OI=
]
IV>OCVI*/13CBI3
]
VAOI/1 $
类黄酮合成
P?>XA1A/3@/A0
Y
1ODI0/0 !
4!T!
锌指蛋白
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N
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IV
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表达量和种类分布
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N
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5
(
8
(
4
(
:
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4?I>1;>
N
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+
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(
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(
$!,$_
(
$!,#!_
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是因为燕麦基因组与参考基因组的序列差异较大
所致
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!
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表
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5
(
8
(
4
(
:
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+
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#""
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(
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(
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(
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(
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(
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(
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(
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的不均一性和部分冗余性!少数基因呈现高丰度表
达!而多数基因表达水平很低"表
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#
图
#
!
燕麦
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测序饱和度分析
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燕麦盐胁迫响应基因的差异表达分析
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因!其中可被检测的"含有
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位点#有效参考基
因
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个!占参考基因总数的
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"图
!
#
以
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#
!
!且
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为差异表达基因的选
择标准!结果如图
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迫
",$D
时分别有
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#
$
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图
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倍以上的占
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盐胁迫基因差异表达水平变化主要集中在
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内!表现出高度的不均一性
对差异表达基因功能进行注释!发现有
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#!这些基因可能是燕麦
特有的与盐胁迫相关的基因!其作用机理需要进一
步研究
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!
盐胁迫下燕麦叶片的生理变化特征
如图
+
所示!在
#""==A?
%
H9>4?
胁迫下!燕
麦叶片的相对电导率和丙二醛含量随胁迫时间持续
上升!但与对照相比的增长幅度不大&在
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(
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(
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%
H9>4?
胁迫
!+D
内!燕麦叶片的相对电
导率(丙二醛含量(脯氨酸含量总体上呈现出先上
升!后下降!随后又上升的趋势说明低浓度盐胁迫
对燕麦影响较小!未能诱导燕麦耐盐基因的表达!而
高浓度盐胁迫下!不同响应速度及表达时间的耐盐
相关基因差异表达!使相关的生理指标出现了以上
变化趋势相对电导率与丙二醛的变化趋势可能与
测序中发现的
T
`
*5;a>0I
基因(钠离子转运蛋白
基因
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(钾离子转运蛋白基因(
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`
%
T
`逆向转
运蛋白基因等在不同胁迫时间的差异表达有关"表
-
#!这些基因表达合成膜转运蛋白(保护性蛋白等为
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`
(
T
`
(
L
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胞组织免受伤害
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H
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转录因子
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转录因子
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钾离子转运
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钾转运体
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高亲和钾转运体
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钠离子转运体
7A3/C=/A1OV>10
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钠%氢转换器
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图
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脯氨酸(丙二醛含量变化
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3IBA1OI1O/1
?I>XI0AZA>OC13IV0>?O0OVI00
脯氨酸含量增加较快!可能是高盐胁迫激发燕麦迅
速启动
a$47
基因编码合成脯氨酸&而胁迫
!+D
时!相关基因上调表达量加大!使脯氨酸的合成大于
分解!脯氨酸含量迅速积累!但是生理反应略滞后于
基因表达!所以脯氨酸的生理变化趋势与测序结果
相符"表
-
#!说明可以根据燕麦对盐胁迫的生理响
应判断其相关基因的表达情况!并作为测序结果的
验证依据
%
!
讨
!
论
盐胁迫下!植物通过改变基因的表达来调控代
谢与信号转导途径等!从转录(翻译水平响应逆境
研究人员已经利用基因芯片!采用基因突变(基因过
表达等技术从拟南芥(水稻等植物中鉴定了许多盐
胁迫响应基因)!!*!%*!但植物响应盐胁迫的分子机制
复杂!不同的植物存在自身独特的响应方式!且基因
芯片只适用于具有全基因组信息的生物采用高通
量测序技术!从转录水平上研究燕麦的表达谱差异!
有助于燕麦响应盐胁迫的分子机制及其它禾本科植
物耐盐机理的研究本试验通过对燕麦叶片进行
G?C=/1>
测序结果表明!基因覆盖率基本接近饱和!
不同盐处理时间测序结果可靠!能满足表达谱分析
的需要但由于燕麦基因组信息缺乏!增加了实验
中发现的未知基因和新基因研究的难度!限制了表
达谱数据的深入挖掘与分析
本研究通过对耐盐性强的燕麦品种
E5F*)
的
高通量测序产生的数字基因表达谱分析发现!虽然
胁迫只引起
!_
左右的测序标签表达量发生了变
化!但其差异表达基因的功能多样化!影响燕麦大多
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&
期
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高彩婷!等$燕麦盐胁迫响应基因的差异表达与生理响应的关系
数生理生化代谢途径说明植物转录系统是相对稳
定的!同时又是高度灵敏的一个开放式表达体
系)!+*盐胁迫下渗透调节物质(抗氧化蛋白的修复
和离子平衡等相关基因的诱导表达表明!燕麦对盐
胁迫的保护性响应是多种代谢途径和信号通路共同
作用的结果脯氨酸等渗透调节物质的迅速积累也
是燕麦抵御逆境的方式!本研究发现吡咯啉
*$*
羧酸
还原酶"
a$46
#和吡咯啉
*$*
羧酸合成酶"
a$47
#基因
的上调表达量变化与脯氨酸含量变化趋势基本一
致!说明盐胁迫的生理响应可作为判断相关基因表
达调控的依据&本实验中还发现中高浓度盐处理
D
!脯氨酸含量略有下降!可能是脯氨酸脱氢酶
"
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#合成基因在胁迫
%
至
D
内上调表达!使
aVA:T
活性升高!抑制脯氨酸的合成
耐盐植物可通过胞质膜和液泡膜上的各种离子
泵调节离子的吸收和区域化以适应盐胁迫!有研究
发现用
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%
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`
(
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`
%
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`逆向转
动蛋白基因(
L
`运输蛋白基因等差异表达!调节燕
麦的离子吸收以适应盐胁迫
除以上发现外!燕麦表达谱分析还发现有响应
逆境胁迫的转录因子如
WU8
(
954
(
5a!
%
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(
:6<8
等上调表达
WU8
是植物最大的转录因子
家族之一!从转录水平上调控下游基因的表达水
平)!&*!响应逆境胁迫&
954
转录因子是陆生植物特
有的逆境胁迫响应因子!水稻
7954
基因在小麦中
超表达也可以提 高其抗旱和抗盐性)!*&
5a!
%
<6<8a
家族转录因子受生物和非生物胁迫诱导表
达!在低温(干旱(盐等胁迫抗性中发挥重要作用!如
棉花
234567
基因过量表达可以提高小麦的干
旱(高盐和冻害等多种胁迫抗性)!)*本研究发现
954
(
f6LU
转录因子与部分钾(钠离子转运蛋白
基因的表达量变化趋势相同!可能是这两个转录因
子对这些基因的表达有调控作用离子转运蛋白对
于植物响应逆境胁迫!避免离子毒害!调节渗透平衡
具有重要作用本研究中发现一个高亲和性钾离子
转运蛋白基因"
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%
个胁迫处理
中皆下调表达!且表达量相同!这与拟南芥(水稻等
植物的研究结果不同)%"*%#*!该基因在燕麦响应盐胁
迫中的作用及其代谢过程需要进一步研究其它离
子转运蛋白基因的差异表达证实燕麦可通过选择性
吸收
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`
(
9>
`来调节地上部分
L
`
%
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`
!维持细胞
内离子的动态平衡)%!*
燕麦对盐胁迫的代谢响应说明要通过克隆某一
个基因达到改良盐敏感品种的耐盐性难度很大通
过对燕麦的转录组表达谱分析!可以较全面的理解
燕麦盐胁迫下各代谢途径的相互作用关系!为挖掘
植物耐盐新基因!筛选主效基因!阐明燕麦耐盐的分
子机制!指导耐盐育种提供了理论基础
本研究中燕麦叶片的生理变化趋势与表达谱结
果一致!但除已知的基因!其他大量差异表达的基因
具体调控哪些相关的生理过程需要进一步研究水
稻高盐胁迫下基因的表达结果显示!有的基因在胁
迫
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即开始表达!
%D
后趋于未胁迫水平&大部
分基因属于中期上调表达!即胁迫
%D
开始表达!还
有部分基因胁迫
!+D
开始表达)%%*本研究发现!
随着盐胁迫时间的延长!燕麦大部分基因差异表达
量依次升高!且胁迫
!+D
上调表达的基因所占比例
较大"
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后迅速表达!
%D
后与对照相近!
+D
表达量再度上升!这与林鸿
宣等的研究结果存在差异差异产生的原因可能是
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能在
!+D
内承受更高浓度盐的胁迫!
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胁迫
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未能最大程度激发耐盐基因
的表达!但随着胁迫时间的延长!燕麦耐盐基因逐渐
被诱导表达!
+D
时差异表达量达到最高值
综上所述!本研究通过转录组测序所得原始序
列数据去除杂质后得到
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条
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差异表达基因涉及逆境胁迫相关的植物激素信号转
导代谢途径(
584
转运蛋白代谢(肌醇磷酸代谢途
径(渗透调节途径等同时!相对电导率(丙二醛含
量(脯氨酸等
%
个指标的变化趋势基本上与表达谱
中相关的差异表达基因量的变化相同!说明以上
%
个生理指标的变化可以间接反映出燕麦在不同盐胁
迫浓度下耐盐基因的表达情况!可作为测序结果的
生理验证
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高彩婷!等$燕麦盐胁迫响应基因的差异表达与生理响应的关系