全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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$
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+/001+#"""*"!$+!"#$+#"+#&#
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收稿日期$
!"#$*"$*!-
&修改稿收到日期$
!"#$*")*"!
!!
基金项目$国家自然科学基金"
2##!)%"#
#&国家十二五(科技支撑计划"
!"##345%$3"$
#&石河子大学高层次人才专项 "
6789!"#!#!
#
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作者简介$朱守鸿"
#&),(
#!男!在读博士研究生!主要从事棉花遗传育种研究)
:*;$
>?@0?A@?A1
B
!"#
!
#!-+CA;
!!"
通信作者$薛
!
飞!博士!副教授!主要从事棉花遗传育种及棉花功能基因组学研究)
:*;$
D@EFE/!"#%
!
?AG;棉花微管结合蛋白基因
1234!05$
的克隆与表达分析
朱守鸿#!薛
!
飞#"!赵兰杰!!刘永昌#!李艳军#!熊显鹏#!孙
!
杰#
"
#
石河子大学 农学院%新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室!新疆石河子
)%!""%
&
!
石河子大学 生命科学学院!新疆石
河子
)%!""%
#
摘
!
要$
7H4IJ
蛋白"
7H4IJ0
#是一种能够特异地与微管结合!参与调节微管结构与功能的微管结合蛋白
"
K4J0
#!在植物细胞形成*细胞伸长等方面起着关键作用)该研究利用电子克隆结合
6L*J76
技术从陆地棉
"
!"##
$%
&()&*#+(H+
#中克隆获得
#
个
,-./0
基因!命名为
!),-./0#
"
M73N
登录号为
OJ,!&--
#)序列分
析显示!
),-./0#
属于
7H4IJ
基因家族!开放阅读框长度为
#))P
Q
!编码含
#%&$
个氨基酸残基的蛋白&
R?*
7H4IJ#
蛋白含有
#
个
S:4L
重复结构域和
!
个
7H4IJ*M
端结构域)进化分析表明!
R?7H4IJ#
与可可树
"
1)2"3*"(45454"
#
7H4IJ
蛋白的亲缘关系最近)
T
6L*J76
分析表明!
!),-./0#
在棉花的根*茎*叶*花及纤维
发育的不同时期均有表达!且
!),-./0#
基因表达量最大值出现在纤维发育次生壁加厚期"开花后
!,U
#!推测
!),-./0#
基因可能对棉花纤维次生壁的形成起着重要的作用)利用本氏烟草"
6&5"+&474327+)4(&474
#叶片瞬
时表达系统对
!),-./0#
基因编码的蛋白进行亚细胞定位结果显示!
R?7H4IJ#
蛋白定位在细胞膜上)上述结
果为进一步研究
,-./0
基因在棉花中的功能奠定了基础)
关键词$棉花&纤维发育&
7H4IJ
&表达分析&亚细胞定位
中图分类号$
V,)$
&
V,)-
!!!
文献标志码$
4
%&"#
(
)!*+
,
-.//#"0)&
1
/#/"21234!05$3..#1&66
78
-9:2-(69#9:45
8S2I?A@?A1
B
#
!
92:WE/
#
"
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8S4XH<1
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HN2YA1
B
C?<1
B
#
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HNY<1
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9NXMR9/<1
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E1
B
#
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I2MZ/E
#
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B
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B
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B
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Q
!
I?/?E*
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9/1
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B
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7?/1<
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!7A=E
B
EAFH/FEIC/E1CE0
!
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!
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!
9/1
.
/<1
B
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7?/1<
#
06/7-)87
$
7HNJ*400AC/"
7H4IJ0
#
/00
Q
EC/F/C<=
P/1U/1
B
GA;/C[AG@P@=E0AF;/C[AG@P@=E<00AC/*
Q
[AGE/10
"
K4JI
#!
/1]A=]EU/1;EU/B
G?E0G[@CG@[E<1UF@1CG/A1AF;/C[AG@P@=E0
!
<1U
Q
=<
E^
[A=E0
U@[/1
B
CE=FA[;B
B
E1E_<0APG$%
&()&*#+( H+
P
E=ECG[A1/CC=A1/1
B
<1U[E]E[0E*G[<10C[/
Q
G/A1
Q
A=
;E[<0EC?"
6L*J76
#
GEC?1A=A
B+IE
T
@E1CE
<1<=
0/00?A_EUG?B
0GAG?E7H4IJ
B
E1EF<;/=
!
G?EF@==E1
B
G?X6WAF!),-./0#/0
#))P
Q
!
E1CAU/1
B
#%&$<;/1AL?E
Q
?
=A
B
E1EG/C<1<=
0/0AF?A;A=A
B
@E7H4IJ
Q
[AGE/10AFAG?E[
Q
=<1G00?A_EUG?C=A0E[E=Q
_/G?LC7H4IJAF1)2"3*"(45454"+6E<=*G/;E
T
@<1G/GQ
G/A1J76
"
T
6L*J76
#
0?A_EUG?Q
[E00EU/1[AAG
!
0GE;
!
=E!
Q
EG<=<1UF/PE[Q
*
;E1G
Q
E[/AU0+L?E?/
B
?E0GED
Q
[E00/A1AFG?E!),-./0#_<0AP0E[]EU/1G?E0ECA1U<[
\Q
E[/AUAFG?ECAGGA1
F/PE[_<=G?/C^
"
!,U<
\Q
A0G<1G?E0/0
#
<1U0@
BB
E0G/1
B
G?B
?G
Q
=<
<1/;
Q
A[G<1G[A=E/1G?E
FA[;_<= 0
1G?E0/0AFCAGGA1F/PE[+L[<10/E1GED
Q
[E00/A10
0GE; AFG?E6&5"+&474
327+)4(&474=E<]E0_<0@0EUGA<1<=
>E0@PCE=@=<[=AC<=/>!
<1U0?A_EUG?B
?G=AC/1G?ECE=;E;P[<1E+L?/00G@U
\Q
[A]EU/1
B
G?EF@1CG/A10AF,-./0
B
E1E0/1F/PE[
UE]E=A
Q
;E1G+
9.
1
:"-!/
$
CAGGA1
&
F/PE[UE]E=A
Q
;E1G
&
7H4IJ
&
ED
Q
[E00/A1<1<=
0/0
&
0@PCE=@=<[=AC<=/>!!
微管是植物细胞骨架的重要组成部分!在植物细
胞分化*生长"伸长#和次生壁加厚以及物质运输*信号
转导等方面均起着广泛而重要的作用!尤其是在棉纤
维伸长和次生壁合成过程中发挥着重要的作用+#*,)
7H4IJ
蛋 白 "
7HNJ*400AC/!
7H4IJ0
#是一种能够特异地与微管结合!参与调节
微管结构与功能的微管结合蛋白"
;/C[AG@P@=E*<0*
0AC/Q
[AGE/10
!
K4J0
#)它属于膜蛋白的基质结
合分子
(#
+
$
,
!能够特异地结合在微管的正端!又称
为微管正端跟踪蛋白)同时!
7H4IJ
蛋白和微管结
合也受到
RIO%
"
"
B
=
CA
B
E10
1G?<0E /^1<0E%
"
#激
酶磷酸化调节!该调节对于影响细胞内微管局部的
稳定性起到很重要的作用+-,)有研究表明!
/^1E0/1*
#%
家族使微管变得不稳定!增加崩塌的机会!使微
管解聚)相反!
7H4IJ
蛋白具有调节动态微管的稳
定性!促进微管多聚的功能+,,!在细胞内抑制微管崩
塌的 机 会!起 到 重 建 因 子 的 作 用+),)
4;P[A0E
等+&*##,发现
IM9#
"
0A[G/1
B
1ED/1#
#通过和
7H4IJ
相互作用与微管相连!
7H4IJ
依靠生长素运输通路
JNM!
"
JNM*WX6K:5!
#回收调节微管)
在拟南芥基因组中
,-./0
基因只有
#
个拷
贝!没有发现
7HNJ0
"
C
GA
Q
=<0;/C=/1^E[
Q
[AGE/10
#的
同源物!表明
,-./0
在植物中具有独特的作
用+#!,)与野生型拟南芥植株相比!
,-./0
的功能
缺失突变体
584#
%
9#
表现出株型矮小!顶端优势不
明显!叶表皮毛分支数目减少!下胚轴及根生长发育
缓慢!侧根增多!细胞伸长受阻等不良表型+&!#!,)当
用微管解聚药剂处理突变体
584#
%
9#
时!突变体的
根毛异常肿胀!下胚轴及根生长更加缓慢+#!,)由于
拟南芥表皮毛和棉纤维发育机制相似!棉花纤维细
胞形状为直线形*无分支!推测
,-./0
在棉花中可
能具有相同的生物学功能)鉴于
7H4IJ
家族的基
因可能参与并影响了植物生长发育*细胞内物质的
运输等主要生理过程!而棉花中有关
,-./0
基因
的数量*功能的研究还未见有报道)所以!棉花中
,-./0
基因在纤维发育中的作用值得深入研究)
棉纤维细胞是研究植物细胞伸长和细胞壁纤维
素生物合成的理想模型)本研究利用拟南芥
.+9
,-./0
蛋白为查询序列!查询雷蒙德氏棉基因组
数据库!克隆陆地棉中的
,-./0
基因!并对其序列
及在棉纤维中的表达模式进行分析!以理解其在棉
花生长发育中的作用!揭示该类基因家族在棉纤维
发育及棉花品质形成等方面的分子机制!为进一步
探索
,-./0
基因在棉花中的功能奠定基础)
#
!
材料与方法
$+$
!
材
!
料
陆地棉"
!"##
$%
&()&*#+( H+
#品种-新陆早
%%
号.种子由石河子大学棉花研究所提供)种植在
石河子大学试验站)为了观察基因的时空表达模
式!取棉花种子!剥去种皮后用
"+#` S
B
7=
!
浸泡
#";/1
!灭菌水冲洗
%
#

次!播种于
#
%
!KI
培养
基上!
)a
暗培养
U
!用霍格兰营养液培养至
!
片
真叶时!取幼苗的根*茎*叶样品&在田间棉花盛花期
挂牌标记当日开花花蕾!分别摘取开花后
%
*
-
*
&
*
#!
*
#$
*
#)
*
!#
*
!
*
!,
和
%"U
的棉铃!室内剥取纤维
样品&从田间植株摘取花)将上述材料液氮速冻后
保存于
()"a
冰箱!用于
6M4
的提取)
$+;
!
方
!
法
$5;5$
!
棉花总
<=0
提取及
8>=0
第一链合成
!
采
用
7L43
法提取棉花样品总
6M4
+
#%
,
!用
5M<0EN
处理后!利用
M5#"""
紫外分光光度计测定
X5
!-"
和
X5
!)"
值!计算
6M4
的浓度与纯度)用
#+!`
琼
脂糖凝胶电泳检测
6M4
的完整性!保存于
()"a
备用)按照
6E]E[0EL[<10C[/
Q
G<0EK*KHb
"
6M<0E
S*
#说明书合成
C5M4
的第一链)
$5;5;
!
棉花
1234!05$
基因克隆
!
以拟南芥
.+9
,-./0
基因"
.1!!!"#&"
#作为探针序列!与二倍
体雷蒙德氏棉的基因组序列进行
3=<0G
比对"
?G*
G
Q
$%%
___+
Q
?
GA>A;E+1EG
%#!获得其同源基因!用
J[/;E[%
设计扩增开放阅读框的引物"表
#
#)
以棉纤维
C5M4
为模版进行
J76
扩增!反应
体系含
#"cP@FFE[!
$
H
*
!+$;;A=
/
H
(#
UMLJ#+-
$
H
*
C5M4
模版
!
$
H
*
$2
/
$
H
(#
H414
:
5M4
聚
合酶
"+!
$
H
*
#"
$
;A=
/
H
(#上下游引物各
#
$
H
!补
UUS
!
X
至
!"
$
H
)
J76
反应程序
& a
预变性
$
;/1
&
a
变性
$0
!
$)a
退火
$0
!
,!a
延伸
+$
;/1
&重复
%!
个循环&
,!a
延伸
#";/1
)
J76
产物
用
#`
琼脂糖电泳进行检测!回收并纯化后连接至
Q
K5!"*L
载体!转化大肠杆菌
LXJ#"
感受态细胞
!&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
表
$
!
引物列表
L!
J[/;E[0E
T
@E1CE0
引物名称
J[/;E[1<;E
序列
IE
T
@E1CE
"
$d
#
%d
#
用途
MAGE
R?7H4IJ#*W
R?7H4IJ#*6
4LRR4R4447L77LLR447L4R747R
R47LR7LRR7444LL44L4R7LL7447
扩增
!),-./0#
全长
4;
Q
=/F/C=E1
B
G?C5M4AF!),-./0#
R?7H4IJ#*
T
6L*W
R?7H4IJ#*
T
6L*6
4R747LL74R74R7L74L4
4R44L74RR4L7RL77447
!),-./0#
T
6L*J76
23N*W
23N*6
74R4L7LL7RL4444777L
R47L77LL7LRR4LRLLRL4
内参基因
6L*J76 L?E[EFE[E1CE
B
E1EAF
6L*J76
R?7H4IJ#*R*W
R?7H4IJ#*R*6
RRRRL4774LRR4R4447L77LLR447L4R747R
7RRR4L77R47LR7LRR7444LL44L4R7LL7447
!),-./0#
亚细胞定位
4;
Q
=/F/C0/
B
1<=
Q
E
Q
G/UAF!),-./0#
!!
注$下划线为酶切位点)
MAGE
$
21UE[=/1EU0E
T
@E1CE00?A_[E0G[/CG/A1E1>
;E0/GE0+
"本实验室保存#!挑取单菌落!提取质粒进行
J76
和酶切鉴定!鉴定正确的质粒送至北京华大基因公
司测序)
$5;5?
!
1234!05$
基因序列的生物信息学分析
!
用
J[AGJ<[<;
"
?GG
Q
$%%
_EP+ED
Q
<0
+A[
B
%
Q
[AG*
Q
<[<;
%#分析蛋白质的基本理化性质&用
IXJK4
软件"
?GG
Q
0
$%%
1
Q
0<*
Q
[

Q
+F[
%
C
B
/*P/1
%
1
Q
0<
0
<@*
GA;Q
=
1
Q
<
B
Ee
%
MJI4
%
1
Q
0<
0
0A
Q
;<+?G;=
#在线
预测和分析蛋白质的二级结构组成形式&用
:3H*
:3N
"
?GG
Q
$%%
___+EP/+%
/1GE[
Q
[A
%
0E<[C?
%
0E*
T
@E1CE*0E<[C?
#和
M73N
的
3=<0GJ
分析氨基酸序列
的蛋白质保守区&采用
5XR!+"
软件绘制蛋白结构
域图&用
fXHWJIX6L
"
?GG
Q
$%%
Q
0A[G+?
B
C+
.Q
%#进
行信号肽及亚细胞定位分析&采用
bECGA[MLN
和
7=@0G<=9
进行多重序列比对及同源性比对!采用
K:R4-+"
软件构建进化树分析)
$5;5@
!
1234!05$
基因在棉花不同组织中的表达
分析
!
根据
!),-./0#
基因的
C5M4
序列!设计
特异引物!利用
T
6L*J76
方法!以根*茎*叶*花和
不同发育时期的棉纤维
C5M4
为模板!进行
J76
扩增!检测
!),-./0#
基因在不同组织的表达情
况)在罗氏
H/
B
?G7
C=E[)"
实时荧光定量
J76
仪
上进行!内参基因为
23N
!程序为
& a
预变性
#
;/1
!
&$
变性
#$0
!
-"a
退火
!"0
!
,!a
延伸
%"0
!
$
个循环)实验重复
%
次!每次实验
%
个重复!按
照
!
(
%%
7G法分析结果)
$+;+A
!
亚细胞定位载体构建及观察
!
使用本实验
室保 存 的 亚 细 胞 定 位 瞬 时 表 达 载 体
Q
7<;*
P/<#%""!!#*RWJ
!构建
!),-./0#
基因的植物亚
细胞定位载体)分别将
!),-./0#
全长
75I
克隆
到表达载体
Q
7<;P/<#%""!!#*RWJ
的
;
%
7
&
和
<4(S
&
之间!构建
Q
7<;P/<#%""!!#*RWJ*7H4IJ
融合表达载体)构建好的载体通过限制性内切酶
;
%
7
&
和
<4(S
&
进行酶切鉴定!鉴定正确的重组
质粒转入农杆菌
Rb%#"#
中)经过转化液"
#""
$
;A=
/
H
(#
4I
和
#";;A=
/
H
(#
K
B
IX

#重悬的农
杆菌注入生长
%
周的本氏烟草幼苗的叶片背面!将
注射后的本氏烟草放入
!$a
*
#-?
%
#)?
光暗周期
的培养箱中共培养
%U
后!在激光共聚焦显微镜
"
HE/C#下检测荧光)
!
!
结果与分析
;5$
!
1234!05$
基因的克隆及序列分析
利用拟南芥
.+,-./0
基因"
.1!!!"#&"
#序列
作为探针!在二倍体雷蒙德氏棉中发现

个同源性较
高的基因!其序列号分别为
RA[*
RA*
[*
RA[和
RA[""-R"$-""+#
)由于它们在微管的动态性和组织结
构方面的作用及其在棉花纤维发育中的功能还未知!
选取其中
#
个在棉纤维发育过程中具有优势表达的
基因 "
RA[#为研究对象!其序列全
长为
#!-#P
Q
!包含长度为
#))P
Q
的开放阅读框
"
X6W
#!与拟南芥
.+,-./0
基因
X6W
核苷酸序列的
相似性为
-"+$!`
!氨基酸序列一致性为
$%+,"`
)以
-新陆早
%%
号.棉纤维
C5M4
为模板!用特异引物
R?7H4IJ#W
和
R?7H4IJ#6
!进行
6L*J76
扩增!经
#+"`
琼脂糖凝胶电泳检测!获得
#
条约
!""P
Q
目
的条带"图
#
#)回收目的片段!测序结果分析显示扩
增获得的
C5M4
序列包含长度为
#))P
Q
的
X6W
!
编码
#%&$
个氨基酸!与
RA[序列相
似性为
&)+-&`
!氨基酸序列一致性为
&,+,#`
!与陆
地棉
7AG45
0
)!%!
序列相似性为
&)+"`
!氨基酸序
列一致性为
&)+"&`
!表明四倍体陆地棉与二倍体雷
蒙德氏棉不同的种间核酸序列之间存在一些差异)
%&#
#"
期 朱守鸿!等$棉花微管结合蛋白基因
!),-./0#
的克隆与表达分析
鉴于棉花中
,-./0
基因尚未见到相关研究报道!将
其命名为
!),-./0#
"
M73N
登录号为
OJ,!&--
#)
;5;
!
1234!05$
基因编码蛋白的生物信息学分析
从
!),-./0#
基因
C5M4
序列推测
R?7H4IJ#
蛋白包含
#%&$
个氨基酸残基!运用
J[AGJ<[<;
预
测该蛋白的基本理化性质)结果表明!
R?7H4IJ#
成熟蛋白的分子式是
7
-)")
S
#"&)
M
#&"
X
!"&"
I
-&
!分子
量为
#$$+#!$ 5^
!理论等电点为
-+%&
!负电荷的氨
基酸残基数"
40
Q
gR=@
#是
#--
!正电荷的氨基酸残
基数"
4[
B
gH
0
#是
#$-
&脂肪系数为
&#+%&
!总平均
亲水性为
"+!#!
!不稳定系数是
,+-&
)
利用
IXJK4
在线预测分析
R?7H4IJ#
蛋白
的二级结构!结果表明!该蛋白主要由

*
螺旋*延伸
直链*
"
*
转角和无规则卷曲

种结构形式构成!

*
螺
旋包含
,,
个氨基酸!约占
$%+$$`
&延伸直链包含
$$
个氨基酸!约占
%+&`
&
"
*
转角包含
%,
个氨基
酸!约占
!+-$`
&无规则卷曲包含
$$-
个氨基酸!约
占
%&+)-`
)可见!

*
螺旋是该蛋白二级结构的主
要组成部分)
图
#
!
!),-./0#
基因
6L*J76
扩增
K+K<[^E[
(
&
#
#
!+!),-./0#J76
扩增结果
W/
B
+#
!
:=ECG[A
Q
?A[E0/0/;<
B
E0AFG?E6L*J76
<;
Q
=/F/CB
E1E
K+K<[^E[
(
&
#(!+L?E<;
Q
=/F/EU
Q
[AU@CG0AF!),-./0#
!!
为了进一步确定
!),-./0#
基因是否属于
7H4IJ
家族!利用
:3H*:3N
在线分析!结合
M73N
中
3=<0GJ
比对!对该基因氨基酸序列进行蛋白质保
守区分析!发现
!),-./0#
基因具有
#
个
S:4L
重复结构域和
!
个典型的
7H4IJ*M
端结构域!该
,-./0
基因属于典型的
7H4IJ
基因家族成员!其
位置如图
!
所示)由
fXHWJIX6L
软件在线预测
该蛋白的信号肽及亚细胞定位情况表明!
!)9
,-./0#
定位在细胞膜上)
;5?
!
3B%40CD$
蛋白多重序列比对和蛋白进化树
分析
!!
为了解棉花
!),-./0#
与其他植物
7H4IJ
蛋白的亲缘关系!利用
7=@0G<=9
软件和
K:R4-+"
软件将
!),-./0#
氨基酸序列与
M73N
上公布的
其他植物
7H4IJ
蛋白进行多重序列比较!结果"图

#表明!棉花
!),-./0#
与
RE1E3<1^
中葡萄*桑
树*番茄等植物的序列相似性均较低!与雷蒙德氏棉
和可可树相似性较高!与陆地棉
,"+.=9)!%!
序列
的相似性最高!其同源区域主要集中在
7H4IJ*M
端结构域!即在
M
端含有
!
个串联的
7H4IJ*M
端
结构域"图

#)基于棉花
!),-./0#
及其它植物
图
!
!
!),-./0#
基因与陆地棉
,"+.=9)!%!
和
.+,-./0
基因的蛋白结构比较
黑色和斜线区域分别表示
7H4IJ*M
端结构域和
S:4L
重复结构域
W/
B
+!
!
!),-./0#
B
E1E<1U!"##
$%
&()&*#+(
,"+.=9)!%!<1U.+,-./0
B
E1E
Q
[AGE/10G[@CG@[E
3=T
@E=/1E0[E
Q
[E0E1GG?E7H4IJ*M
GE[;/1<=<1US:4L[E
Q
EQ
[AGE/1
!
[E0
Q
ECG/]E=
图
%
!
R?7H4IJ#
与其它植物
7H4IJ
蛋白的进化树分析
系统树各分支上数字是
3AAG0G[<
Q
#"""
次循环检验的置信度&标尺代表遗传距离&三角符号代表
R?7H4IJ#
W/
B
+%
!
J?
=A
B
E1/C[E=Q
AFR?7H4IJ#<1UAG?E[
Q
=<1G7H4IJ
Q
[AGE/10
L?E1@;PE[0A1G?EG[EEP[<1C?E0[E
Q
[E0E1GPAAG0G[<
Q
CA1F/UE1CE]<=@E0<0
PAAG0G[<
Q
/0#"""
&
L?E0C<=EP<[[E
Q
[E0E1G0
B
E1EG/CU/0G<1CE
&
L[/<1
B
=E0G<1U0FA[R?7H4IJ#
&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图

!
R?7H4IJ#
与拟南芥
4G7H4IJ
等其他植物蛋白的
7H4IJ*M
端结构域多重序列比对
所用植物
7H4IJ
包括陆地棉"
7AG45
0
)!%!
#*雷蒙德氏棉"
RA[#*可可树"
9J"","%$##
#*拟南芥"
4G!R!"#&"
#*
莲藕"
9J"#"!-%&&)
#*葡萄 "
9J""!!-$%-,
#*桑树"
9J"#"#"&--&
#*番茄"
9J""!,###
#和茸毛烟草"
9J""&$)&,&#
#&
黑色箭头表示
!
个
7H4IJ*M
端结构域
W/
B
+
!
4;/1AT
@E1CE0<=/
B
1;E1GAFR?7H4IJ#<1UAG?E[
Q
=<1G7H4IJ
Q
[AGE/10
L?E
Q
=<1G7H4IJ0E
T
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0
)!%!
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#
<1U6&5"+&474+"(27+"#&
?
"*(&#
"
9J""&$)&,&#
#&
L?EP=Q
[AGE/1
,-./0
基因蛋白序列构建系统进化树!分析结果
"图
%
#表明!棉花
!),-./0#
同陆地棉
,"+.=9
)!%!
基因在同一个进化分支!与拟南芥*烟草等物
种
,-./0
基因遗传距离较远)
;5@
!
1234!05$
基因在棉花不同组织中的表达
为了解
!),-./0#
基因在棉花中的时空表达
特性!以棉花幼苗的根*茎*叶*田间采集的花及不同
发育时期棉纤维的总
6M4
反转录的
C5M4
为模
$&#
#"
期 朱守鸿!等$棉花微管结合蛋白基因
!),-./0#
的克隆与表达分析
图
-
!
棉花微管结合蛋白
R?7H4IJ#
亚细胞定位分析
4
#
7+%
周烟草叶片中
RWJ*7H4IJ
蛋白的亚细胞定位&
5
#
W+%
周烟草叶片中
RWJ
蛋白的亚细胞定位&其中!
4
*
5
为荧光图像&
3
*
:
为明场图像&
7
*
W
为叠加图像&标尺为
!"
$
;
W/
B
+-
!
I@PCE=@=<[=AC<=/>0/0AFG?E;/C[AG@P@=E<00AC/Q
[AGE/1R?7H4IJ#
4(7+I@PCE=@=<[=AC<=/>Q
[AGE/1/1=E&
5(W+I@PCE=@=<[
=AC<=/>Q
[AGE/1/1=E&
4<1U5FA[RWJF=@A[E0CE1CE/;<
B
E
&
3<1U:FA[P[/
B
?GF/E=U/;<
B
EAFG?E0<;E=E&
7<1UWFA[;E[
B
EU/;<
B
EAFG?E0<;E=E&
IC<=EP<[e!"
$
;
板!以棉花
23N
基因作为内参基因!利用
T
6L*J76
技术!分析
!),-./0#
在棉花不同组织的表达情
况)结果表明!
!),-./0#
基因在棉花的根*茎*
叶*花及棉纤维中均有表达!并在棉纤维发育的早期
表达量低&随着棉纤维的发育!
!),-./0#
表达量
逐渐升高!在开花后
!,U
棉纤维中表达量达到高峰
"图
$
#!暗示其可能在棉花纤维发育过程中发挥着
重要的作用)
;5A
!
3B%40CD$
亚细胞定位观察
为了解
!),-./0#
编码蛋白的亚细胞定位情
况!将构建酶切验证正确的
Q
7<;P/<#%""!!#*RWJ*
7H4IJ
融合表达载体转化农杆菌!注射
%U
后的烟
草叶片于激光共聚焦显微镜下进行观察!结果显示
该基因的
RWJ
的荧光均分布在叶片的细胞膜上"图
-
#)以上结果说明!
R?7H4IJ#
可能定位在细胞膜
上!与生物信息学分析中预测的结果一致)
%
!
讨
!
论
7H4IJ
是与微管正端结合的蛋白!它既能结合
微管也能结合细胞质连接蛋白"
7HNJ*400AC/图
$
!
!),-./0#
基因在棉花不同组织中表达的
T
6L*J76
分析
#+
根&
!+
茎&
%+
叶&
+
花&
$
#
#
分别为开花后
%
*
-
*
&
*
#!
*
#$
*
#)
*
!#
*
!
*
!,
*
%"U
纤维
W/
B
+$
!
V@<1G/G0E0G?EED
Q
[E00/A1
=E]E=AF!),-./0#
B
E1E/1U/FFE[E1GG/00@E0/1CAGGA1
#+6AAG
&
!+IGE;
&
%+HE&
+W=A_E[
&
$(#+6E
Q
[E0E1GF/PE[CE=0
!
-
!
&
!
#!
!
#$
!
#)
!
#
!

!
,<1U%"U
Q
A0G<1G?E0/0
!
[E0
Q
ECG/]E=
J[AGE/10
!
7H4J0
#
+
#
,
)
7H4IJ
蛋白的一般包括
!
个保守的结构域$
S:4L
重复结构域和
7H4IJ*M
端结构域)有些
7H4IJ
蛋白只含有
7H4IJ*M
结
构)通过体内和体外试验已经证实!
S:4L
结构域
能形成螺旋结构及调节蛋白之间的相互作用!参与
细胞内物质的运输+#$*#-,&
7H4IJ*M
端结构域是很
-&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
保守的结构域!是与微管结合的部位!具有调节动态
微管的稳定性作用+#,*#),)本试验中克隆的
!)9
,-./0#
含有
!
个保守的
7H4IJ
!
M
端结构域和
#
个
S:4L
重复结构域!和拟南芥
.+,-./0
的结
构域相比!
),-./0#
少了
#
个
S:4L
重复结构
域&与陆地棉
,"+.=9)!%!
的结构相比!多了
#
个
S:4L
重复结构域)这些
S:4L
重复结构域和
7H4IJ*M
端结构域可能对于蛋白功能的正常发挥
是必需的)
棉花纤维发育分为纤维原始细胞分化和突起*
纤维伸长*次生壁加厚和脱水成熟

个时期!这

个
时期之间存在着某些重叠!没有截然区分的界
限+#&,)在纤维发育的各个时期都有大量的相关基
因参与纤维的发育和调控)本研究
T
6L*J76
表
明!
),-./0#
基因在花后
!,U
表达量最高!该时
期正是处于纤维次生壁加厚期!表明该基因可能在
纤维发育次生壁合成期发挥重要的作用!可能对棉
纤维比强度有重要影响)
7H4IJ
主要在微管的正
端富集!其聚集的点沿着微管的整个长度分布+!"*!#,)
在拟南芥中通过细胞学研究分析发现
.+,-./0
基
因编码的蛋白与所有的微管列阵共定位+!"!!*!%,!
5?A1@^0?E
等+!,研究表明
JHL*
生长素
*K4J-$*
7H4IJ
模型在拟南芥根的定向细胞分裂中起着重
要的作用)
7H4IJ
定位在细胞的上下两面有利于
微管跨过边缘从横向排列变为纵向排列!从而使得
细胞从垂周分裂转变成平周分裂!
7N4IJ
的定位变
化调控微管列阵的方向+!,)本研究中
R?7H4IJ#
蛋白亚细胞定位表明!
R?7H4IJ#
蛋白定位在细胞
膜上!与生物信息学预测的一致)据此我们推测其
为一个微管结合蛋白!同时作用于微管和细胞膜!可
能与细胞内物质的运输相关!通过调控微管的排向
和动态分布!参与纤维发育调控!影响纤维的伸长和
次生壁的合成!从而改变纤维的品质)该基因在纤
维发育过程中的功能还有待进一步深入研究)
到目 前 为 止!在 动 植 物 基 因 组 中 发 现 的
,-./0
基因数目很少!如$人的基因组中只有
!
个
,-./0
基因+#,!在果蝇和线虫基因组中已报道的
有其同源相似物+!$*!,,)而在植物拟南芥基因组中只
有
#
个
,-./0
基因+#!,)根据已经公布陆地棉基
因组数据库+!),!预测棉花中有
)
个
,-./0
基因!
其在棉花中的功能尚未知!彼此之间是否有功能冗
余也有待进一步研究)本研究为进一步探讨棉花中
,-./0
基因的功能奠定了基础)
参考文献!
+
#
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5N9NL6
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7Y66+:1CA@1GE[0PEG_EE1U
1<;/CCA[G/C<=;/C[AG@P@=E0
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的克隆与表达分析
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