全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５４５３ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
张胤冰，孙鑫博，樊波，韩烈保，张雪，袁建波，许立新．结缕草犣犼犖犃犆基因的克隆与表达分析．草业学报，２０１６，２５（４）：２３９２４５．
ＺＨＡＮＧＹｉｎＢｉｎｇ，ＳＵＮＸｉｎＢｏ，ＦＡＮＢｏ，ＨＡＮＬｉｅＢａｏ，ＺＨＡＮＧＸｕｅ，ＹＵＡＮＪｉａｎＢｏ，ＸＵＬｉＸｉｎ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犣犼犖犃犆ｆｒｏｍ
犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（４）：２３９２４５．
结缕草犣犼犖犃犆基因的克隆与表达分析
张胤冰１，孙鑫博２，樊波１，韩烈保１，张雪１，袁建波１，许立新１
（１．北京林业大学草坪研究所，北京１０００８３；２．河北省作物生长调控重点实验室，河北农业大学，河北 保定０７１００１）
摘要：ＮＡＣ类家族的基因是植物特有的转录因子，并且它在植物的生长发育中发挥着重要的作用。本研究以结缕
草为研究材料，对结缕草转录组数据库利用ｌｏｃａｌｂｌａｓｔ的办法克隆出１个 ＮＡＣ类转录因子。为深入探讨和研究
ＮＡＣ类转录因子在植物逆境生理上的作用奠定基础。通过与水稻的犗狊犖犃犆狊家族成员进行进化树分析，结合蛋
白分析，ＱＲＴ－ＰＣＲ等的方式探索其生物学功能。实验结果表明，该基因长度为１４９６ｂｐ，包含１个完整开放阅读
框（ＯＲＦ），长度为１３３２ｂｐ，编码４４９个氨基酸，该蛋白含有１个ＮＡＭ结构域。与水稻的ＮＡＣ类转录因子家族的
系统进化树对比发现，它与ＯｓＮＡＣ０３６近缘性最高，因此将该基因命名为犣犼犖犃犆０３６。ＱＲＴ－ＰＣＲ结果显示，该
基因在干旱情况下表达量呈上升趋势，并且干旱处理８ｈ的时候，差异倍数最大，达到了５０倍左右，而在盐胁迫、低
温胁迫下没有规律性变化。这表明犣犼犖犃犆０３６在干旱逆境生理上可能有重要的作用，而在高盐及寒冷的逆境生理
方面可能作用不大。
关键词：结缕草；ＮＡＣ转录因子；进化树；表达分析
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犣犼犖犃犆犳狉狅犿犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪
ＺＨＡＮＧＹｉｎＢｉｎｇ１，ＳＵＮＸｉｎＢｏ２，ＦＡＮＢｏ１，ＨＡＮＬｉｅＢａｏ１，ＺＨＡＮＧＸｕｅ１，ＹＵＡＮＪｉａｎＢｏ１，ＸＵＬｉＸｉｎ１
１．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犜狌狉犳犵狉犪狊狊犛犮犻犲狀犮犲，犅犲犻犼犻狀犵犉狅狉犲狊狋狉狔犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犅犲犻犼犻狀犵１０００８３，犆犺犻狀犪；２．犓犲狔犾犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犮狉狅狆犵狉狅狑狋犺狉犲犵狌犾犪
狋犻狅狀狅犳犎犲犫犲犻犘狉狅狏犻狀犮犲，犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犎犲犫犲犻，犅犪狅犱犻狀犵０７１００１，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅＮＡＣｆａｍｉｌｙ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＮＡＭ，ＡＴＡＦ１／２，ａｎｄＣＵＣ２ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ａｒｅｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｐｌａｙｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅａｎｄｅｘｐｌｏｉｔｔｈｅｅｘｃｅｌｅｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｇｅｎｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｚｏｙｓｉａ（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪），ａｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａＮＡＣｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ（犣犼犖犃犆）ｗａｓｃｌｏｎｅｄ
ｂｙｂｌａｓｔｉｎｇｔｈｅ犣狅狔狊犻犪狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋狅犿犲ｄａｔａｂａｓｅ．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌｏｎｅｄ犣犼犖犃犆ｇｅｎｅｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄ
ｂｙａｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈＯｓＮＡＣｓｏｆｒｉｃｅ（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｔｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｃｌｏｎｅｄ
犣犼犖犃犆ｇｅｎｅｗａｓ１４９６ｂｐｌｏｎｇ，ａｎｄｃｏｎｔａｉｎｅｄａ１３３２ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ４４９ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ
ｗｉｔｈａＮＡＭｄｏｍａｉｎ．Ｉｎａｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｃｌｏｎｅｄ犣犼犖犃犆ｇｅｎｅｓｈｏｗｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏＯｓ
ＮＡＣ０３６ｆｒｏｍｒｉｃｅ，ａｎｄｓｏｔｈｅｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｗａｓｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ犣犼犖犃犆０３６．ＴｈｅｑＲＴ－ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ
犣犼犖犃犆ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｕｎｄｅｒｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ，ｒｅａｃｈｉｎｇｐｅａｋｌｅｖｅｌｓ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ５０ｆｏｌｄｔｈａｔｉｎｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ）ａｆｔｅｒ８ｈｏｆｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犣犼犖犃犆ｄｉｄｎｏｔｓｈｏｗｏｂｖｉｏｕｓｖａｒｉａｔｉｏｎｓｕｎｄｅｒｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓｏｒｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓ．Ｔｏｇｅｔｈｅｒ，ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙ犣犼犖犃犆０３６ｍａｙｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒ
第２５卷 第４期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２３９－２４５
２０１６年４月
收稿日期：２０１５０９２３；改回日期：２０１５１１３０
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金（ＢＬＸ２０１２０３４）和国家高新技术研究发展计划项目（２０１３ＡＡ１０２６０７）资助。
作者简介：张胤冰（１９９０），女，黑龙江哈尔滨人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：１３０２００１９０４２＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｌｉｘｉｎｘｕ＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｒａｔｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｓａｌｔｏｒｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪；ＮＡＣｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ
日本结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪），禾本科结缕草属，原产于亚洲东南部，是一种耐高温，耐干旱的Ｃ４ 类暖季型
草坪草，由于其抗逆性强，耐践踏，再生性强等优良特性而成为了我国重要的草坪草种质资源［１３］。结缕草是异源
四倍体植株，具有相当小的基因组尺寸［４］，这些使得结缕草成为了重要的草坪模式植物。而干旱目前成为了全球
共同关注的难题，我国也是如此，水资源短缺成为了限制植物生长发育，尤其是限制草坪草正常生长的重要因
素［５６］。因此，在园林绿化及运动球场绿地的节水灌溉成为当前研究草坪草的焦点，通过生物技术方法培育耐旱
耐盐新品种也成为一项重要的手段。
近年来，如ＴＣＰ，ＭＹＢ类的植物转录因子被广泛研究，其中，ＮＡＣ作为植物特异性转录因子，是目前发现的
数量最大的转录因子家族之一。研究表明，ＮＡＣ家族基因参与多种植物的发育及形态建成，并且在植物的生长
发育，器官发育以及各种生物，非生物胁迫等方面发挥着重要的作用。ＮＡＣ转录因子家族的蛋白都含有１个靠
近Ｎ端的，高度保守的ＮＡＣ结构域，可以联结ＤＮＡ以及其他蛋白［７］。其命名来自于矮牵牛（犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪）
的犖犃犕 基因以及拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的犃犜犃犉１，犃犜犃犉２，犆犝犆２基因。最早发现是在矮牵牛的突变
体中，这个突变体的胚胎不含有顶端分生组织，无法形成茎顶端分生组织，经鉴定是一个犖犃犕 基因，与其他几个
未知基因共有１段保守的Ｎ端区域［８］。而后Ａｉｄａ等［９］在拟南芥的杯状子叶突变体中克隆了犆犝犆２基因，该基
因编码的蛋白Ｎ末端与矮牵牛ＮＡＭ蛋白具有较高的同源性。这一基因在植物胚胎及花器官的发育中扮演了
重要的角色。随后在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪），小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等物种中相继发现，目前研究显示，在拟南
芥中共发现了１０５个犖犃犆成员，水稻中发现了７５个犖犃犆成员［１０］，研究表明，ＮＡＣ类转录因子在植物的生长发
育，器官建成方面发挥着十分重要的作用［１１］。Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等［１２］发现拟南芥中的一个ＮＡＣｄｏｍａｉｎ的转录因子
ＶＮＤＩＮＴＥＲＡＣＴＩＮＧ２对拟南芥的木质部导管分化起到负调控作用。同时也发现胁迫诱导的ＮＡＣ转录因子
基因在干旱、高盐等非生物胁迫中直接或间接地参与调控作用［１３］。Ｈｕ等［１４］发现，过量表达犛犖犃犆１基因可以增
强水稻的耐胁迫能力。同时还发现过量表达犛犖犃犆２，犗犖犃犆０４５等可以增强水稻的耐低温、干旱以及高盐的能
力［１５１６］。拟南芥犃犜犃犉１基因受干旱、高盐、ＡＢＡ、病原菌等诱导表达，过量表达该基因能明显提高植株耐旱
性［１７］。并且研究显示 犃犜犃犉２对某些拟南芥病程相关蛋白起抑制作用［１８］。Ｚｈｅｎｇ等［１６］发现过量表达
犗犖犃犆０４５基因提高了水稻的耐干旱能力。过量表达ＡＢＡ响应基因犗狊犖犃犆５２，可以激活转基因拟南芥下游基
因的表达，从而提高了植物的耐旱性［１９］。一个胁迫诱导基因犣犿犛犖犃犆１在拟南芥中过量表达后，可以提高幼苗
对脱水胁迫的耐受力［２０］。在拟南芥中，过量表达高粱（犛狅狉犵犺狌犿狏狌犾犵犪狉犲）的ＮＡＣ基因犛犫犛犖犃犆１后，与野生型
相比明显提高了抗旱能力［２１］。目前，从各种植物中克隆到了许多的ＮＡＣ转录因子基因，并发现其参与并调控了
许多植物非生物胁迫响应机制，尤其是干旱脱水胁迫，如拟南芥犃犜犃犉１，水稻犛犖犃犆１，烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪
犮狌犿）犖狋犖犃犆犚１［２２］等，但是在草坪草日本结缕草中却鲜有报道。
本研究利用ｌｏｃａｌｂｌａｓｔ的办法，从结缕草转录组比对得到了犣犼犖犃犆０３６基因序列，并通过ＲＴ－ＰＣＲ等方法
从日本结缕草中分离出了该基因。生物信息学预测了该基因的功能，并对该基因在胁迫处理下的时间及空间表
达模式进行了分析，研究其与抗旱的相关性，为结缕草抗旱性分子育种奠定技术基础，同时为该基因的进一步研
究与利用提供有效的参考依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
选用的日本结缕草品种ｃｏｍｐａｄｒｅ，采自于北京林业大学草坪研究所。２０１４年６月种植于北京林业大学草坪
研究所智能温室［（２５±１）℃，１６ｈ光照，１２０００ｌｘ，８ｈ黑暗，相对湿度７５％］中。先将种子播种于穴盘中，发芽３
周后，将幼苗转移至直径１５ｃｍ，深１４．５ｃｍ 的花盆中，土壤成分为沙土和蛭石（１∶１）。出苗８周后用１５０
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，４℃低温及２０％ＰＥＧ６０００分别处理材料。每个处理进行３次生物学重复，设置了８个取样点，分
０４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
别为０，１，２，４，８，１２，２４，４８ｈ，取不同处理时间的叶片，液氮速冻，置于－８０℃超低温冰箱储存备用。
１．２ ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成
采用Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）分别提取日本结缕草叶片的总ＲＮＡ。用ＤＮａｓｅⅠ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，美国）去除剩余的基因组ＤＮＡ，使用１％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００检测其浓度
及纯度。以总ＲＮＡ为模板，合成ｃＤＮＡ（全式金，ＡＥ３０１），储存于－２０℃冰箱备后续实验使用。
１．３ 犣犼犖犃犆基因的克隆
通过结缕草根部的转录组数据初步分析，得到了一段含有ＮＡＣ转录因子家族ＮＡＭ 结构域的序列，比对分
析其包含有完整的ＯＲＦ区。根据序列片段设计１对基因特异性引物，ＱＳ：５′ＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＧＣＣＴＧＣ
ＣＴＣＣ３′；ＱＡ：５′ＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧＧ３′，以日本结缕草总ＲＮＡ反转录的ｃＤＮＡ为模板，扩增
目的基因，获得包含有完整ＯＲＦ的犣犼犖犃犆基因。反应程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，５８℃退火３０
ｓ，７２℃延伸１１０ｓ，３０个循环；７２℃再延伸１０ｍｉｎ；４℃保存。将ＰＣＲ产物进行１．０％琼脂糖凝胶电泳分离，利用
ＤＮＡ回收试剂盒回收，纯化目的片段，与ｐＭＤ?１８Ｔ载体（ＴａＫａＲａ）连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑
筛选，菌液ＰＣＲ鉴定。
１．４ 测序与分析
经鉴定的阳性克隆菌液送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生命技术公司进行测序。序列分析及同源性分析采用ＮＣＢＩ的ｂｌａｓｔ
在线分析（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）及ＤＮＡＭＡＮ等软件分析。利用 ＮＣＢＩ比对序列查找完
整的ＯＲＦ框。利用ＰＢＩＬＩＢＣＰ在线预测ＺｊＮＡＣ０３６蛋白的二级结构。Ｂｌａｓｔｘ搜索其他物种的相似蛋白，用
ＤＮＡＭＡＮ进行序列的多重比对，ＭＥＧＡ６软件进行进化树分析。
１．５ 犣犼犖犃犆的表达分析
利用ＢＩＯ－ＲＡＤＣＦＸ９６实时荧光定量ＰＣＲ仪对日本结缕草ｃｏｍｐａｄｒｅ的各种胁迫取样点的ｃＤＮＡ模板进
行荧光相对定量分析。目的基因的扩增引物为：Ａｃｔｉｎ的扩增引物为 ＡｃｔｉｎＦ：５′ＧＣＴＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧ
ＴＡＴＴＣＡ３′，ＡｃｔｉｎＲ：５′ＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＣ３′。ｑＲＴ－ＰＣＲ 反应采用２０μＬ 反应体系。
ｑＲＴ－ＰＣＲ的反应程序采用三步法，程序如下：５０℃２ｍｉｎ；９４℃预变性１０ｍｉｎ；９５℃变性２０ｓ；５８℃退火２０ｓ；
７２℃延伸１５ｓ；６５℃５ｓ；９５℃５ｓ；３９个循环。每个处理样品设两个生物学重复。利用２－ΔΔＣＴ方法进行数据分析。
２ 结果与分析
２．１ 结缕草犣犼犖犃犆０３６基因克隆与序列分析
图１ 犣犼犖犃犆０３６基因的犘犆犚结果
犉犻犵．１ 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狅犳犣犼犖犃犆０３６犵犲狀犲
通过克隆和ＲＴ－ＰＣＲ方法，从结缕草中克隆到
犣犼犖犃犆０３６新基因。以结缕草的ｃＤＮＡ 为模板，以
ＺｊＮＡＣＦ，ＺｊＮＡＣＲ为引物扩增目的基因，均获得大
小约为１０００ｂｐ的片段（图１）。ＰＣＲ产物回收纯化后
连接Ｔ１中间载体，经测序分析结果显示，该基因的全
长为１４９６ｂｐ，含有１３３２ｂｐ的开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄ
ｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），共编码４４９个氨基酸，相对分子量
为５０．１３ｋＤａ，理论等电点为４．１５（图２）。含有碱性
氨基酸（Ｈ，Ｋ，Ｒ）４２个；酸性氨基酸（Ｄ，Ｅ）７２个。该
蛋白中相对含量比较多的氨基酸为丝氨酸（Ｓｅｒ）３９
个；谷氨酸（Ｇｌｕ）３７个，含量比较少的氨基酸为色氨酸
（Ｔｒｐ）５个；半胱氨酸（Ｃｙｓ）９个。根据 ＮＣＢＩ数据库分析该蛋白的保守结构域发现，在 Ｎ端包含有一个典型的
ＮＡＭ保守结构域（图３）。经ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴｘ分析表明该序列与玉米ＮＡＣ类的基因相似度最高，达到７９％，由
此推测克隆得到的基因为ＮＡＣ类转录因子基因，后经过与水稻的ＮＡＣ类转录因子家族成员的比对发现，该基
因与水稻犗狊犖犃犆０３６的亲缘关系最近，故将结缕草的ＮＡＣ家族基因命名为犣犼犖犃犆０３６。
１４２第２５卷第４期 草业学报２０１６年
利用ＰＢＩＬ－ＩＢＣＰ在线预测ＺｊＮＡＣ０３６蛋白的二
图２ 犣犼犖犃犆０３６核苷酸及编码的氨基酸序列
犉犻犵．２ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犣犼犖犃犆０３６犵犲狀犲
级结构（图４），结果表明，ＺｊＮＡＣ０３６蛋白含有α螺旋
２８．５１％，β转角７．３５％，无规则卷曲４９．６７％，延伸链
１４．４８％。其中，无规则卷曲所占的比例最高，连接着
其他二级结构原件，如α螺旋，β转角和延伸链。利用
ＨＭＭＴＯＰ在线软件预测表明该蛋白没有跨膜区域。
２．２ 犣犼犖犃犆０３６基因序列的系统进化树分析
根据Ｏｏｋａ等［１０］发表的文章，获得水稻中 ＮＡＣ
转录因子家族所有成员基因的序列号，然后从 ＮＣＢＩ
网站上检索并获得这些 ＮＡＣ家族基因序列，进而构
建犣犼犖犃犆与水稻所有ＮＡＣ转录因子基因家族成员
的系统进化树。系统的进化关系表明，日本结缕草
犣犼犖犃犆０３６与水稻的犗狊犖犃犆０３６的同源性最高。
２．３ 犣犼犖犃犆０３６基因表达分析
实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ结果显示（图５），以水
处理的日本结缕草为对照，通过实时荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ分析了干旱胁迫、盐胁迫、低温胁迫下的结缕草
叶片中犣犼犖犃犆０３６基因的时空表达。发现该基因在
干旱胁迫处理的２～４８ｈ间的表达量均高于对照水
平，在处理４ｈ时基因的表达量显著提高，８ｈ时达最
大表达量。随着处理时间的延长，１２ｈ后，表达量下
降；在盐胁迫处理后的２和２４ｈ，表达量下调，其余时
间段呈上升趋势；在低温胁迫下，该基因在１和２ｈ
时，表达量下调，而从３到４８ｈ，该基因表达量都高于
对照。结果表明，犣犼犖犃犆０３６基因受干旱诱导调控表
达，干旱条件下，表达量上调；而高盐和低温胁迫下，该
基因并无明显规律变化。
３ 讨论
ＮＡＣ类转录因子是植物中特有的一类调控因子，一般通过与目标基因的启动子中特定的ＤＮＡ序列相结合
从而达到激活或抑制其靶基因的表达［２３２４］。本研究通过电子克隆及ＲＴ－ＰＣＲ的方法，获得了日本结缕草的一
个ＮＡＣ转录因子家族基因：犣犼犖犃犆０３６，利用相关的生物信息学软件对该基因的碱基序列及氨基酸序列进行比
对分析后，发现该基因上具有植物特异性的ＮＡＣ转录因子特征，如蛋白的Ｎ端具有相对保守的ＮＡＣ功能结构
域，因此推测该基因属于ＮＡＣ转录因子家族成员。已有研究表明，ＮＡＣ转录因子的Ｎ端存在一个高度保守的
ＮＡＣ结构域，该结构域一般由约１５０个氨基酸组成。而其Ｃ端是变化多样的转录调控域［７］。本研究中得到的
犣犼犖犃犆０３６基因的蛋白序列，经与其他物种比对分析后发现，这些转录因子在ＮＡＣ结构域处序列高度保守，尤
其是与谷子（犛犲狋犪狉犻犪犻狋犪犾犻犮犪）和玉米（犣犲犪犿犪狔狊）的ＮＡＣ转录因子基因的蛋白同源性最高，该结果表明日本结缕
草在进化上与谷子和玉米的亲缘关系最近。而在Ｃ端的序列差异较大，这种结构说明了ＺｊＮＡＣ０３６蛋白具有
ＮＡＣ家族的高度保守性，并且具有激活功能的多样性，也表明该蛋白在结缕草中可能发挥着十分重要的作用。
目前研究表明，ＮＡＣ类转录因子不仅参与植物的生长发育过程，还直接或间接的在植物的生物及非生物胁
迫的响应中起到十分重要的作用［２３］。Ｈｕ等［１５］研究显示，水稻犛犖犃犆１基因受保卫细胞脱水诱导表达，过表达的
转基因水稻与野生型相比展现出更好的耐旱性和耐盐性。本课题组对日本结缕草ＮＡＣ转录因子犣犼犖犃犆０３６基
２４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
因的非生物胁迫进行了时空表达模式分析，发现在高盐，低温环境的胁迫下，该基因表达量总体呈上升趋势，但并
未有明显的相关性，而在干旱胁迫下表达量呈先上升后下降的趋势，不同处理间的差异达到极显著水平，说明
犣犼犖犃犆０３６基因可能参与调控植物的干旱相关的响应机制，并且很有可能是特异响应干旱胁迫的基因。
图３ 犣犼犖犃犆０３６蛋白的保守结构域
犉犻犵．３ 犆狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狅犳犣犼犖犃犆０３６狆狉狅狋犲犻狀
图４ 犣犼犖犃犆０３６蛋白的二级结构预测
犉犻犵．４ 犘狉犲犱犻犮狋犲犱狊犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犣犼犖犃犆０３６狆狉狅狋犲犻狀
蓝色：α螺旋；红色：延伸链；绿色：β转角；浅紫色：无规则卷曲。Ｂｌｕｅ：Ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ；Ｒｅｄ：Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ；Ｇｒｅｅｎ：Ｂｅｔａｔｕｒｎ；Ｐｕｒｐｌｅ：Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ．
图５ 犣犼犖犃犆０３６基因在胁迫诱导后的相对表达量
犉犻犵．５ 犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犣犼犖犃犆０３６
犵犲狀犲犻狀犱狌犮犲犱犫狔狊狋狉犲狊狊
ＮＡＣ转录因子家族在参与植物生长发育及生物、非生物胁迫中发挥重要作用，具有普遍的生物学功能多效
性，使其在植物的生物育种实践中具有较大的应用潜力。如拟南芥（犃犜犃犉１，犃犜犃犉２，犇犚２６），水稻（犛犖犃犆１，
犗犖犃犆０４５）等，而结缕草中ＮＡＣ转录因子家族成员研究甚少，大部分的成员功能尚未确定。本实验克隆到的
３４２第２５卷第４期 草业学报２０１６年
犣犼犖犃犆０３６基因受非生物胁迫的诱导表达，可能在结缕草抗逆遗传改良中具有一定的利用价值，为今后的深入
研究提供有效的证据。
４ 结论
本研究从日本结缕草中克隆得到了１个ＮＡＣ类转录因子，命名为犣犼犖犃犆０３６。该基因包含一个完整的开
放阅读框（ＯＲＦ），推测编码４４９个氨基酸。ＺｊＮＡＣ０３６蛋白Ｎ端中含有一个ＮＡＭ保守结构域。犣犼犖犃犆０３６基
因受干旱诱导，在该条件下，表达量出现了上调，且在处理８ｈ，表达量差异最大。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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