全 文 ：林业科学研究 ２０１４，２７（４）：４６６ ４７３
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１４）０４０４６６０８
白桦雄花序发育早期和中期差异表达
基因的 ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
暴 帅１，孔 雪１，邢 磊１，张翠霞２，官民晓１，
赵丽红１，刘 闯１，刘雪梅１
（１．东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０；２．香城镇林业站，山东 邹城 ２７３５０３）
收稿日期：２０１３１１０５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１００４４９）
作者简介：暴帅（１９８８—），吉林省敦化市，在读硕士
通讯作者：东北林业大学生命科学学院，副教授
摘要：白桦雄花发育周期较长，从出现雄花序至花粉成熟经历近一年，其发育早期和中期是决定雄配子体发育的重
要时期。采用ｃＤＮＡＡＦＬＰ方法对白桦早期和中期发育雄花序进行了差异表达谱分析，共得到了６２个 ＴＤＦｓ，其中
３０个ＴＤＦｓ与Ｇｅｎｂａｎｋ中的基因具有较高的同源性，其它３２个是未知序列。ＧＯ分析结果显示，这些已知基因主要
参与代谢过程、细胞过程、刺激应答、生殖、信号传导和生物调控等生物学过程，其分子功能主要涉及催化活性、结合
分子功能、酶调节活性和转运活性等；发现了参与生殖和雄花发育的两个重要 ＴＤＦｓ，Ｂｐｌｂｓ６５８和 Ｂｐｌｂｓ１９９。另外，
选择１１个ＴＤＦｓ进行不同组织的ｑＲＴＰＣＲ转录表达分析，结果表明这些基因不仅参与花发育，也参与营养组织的
发育，但各自具有不同的组织表达特征。
关键词：白桦；生殖；差异表达；转录；花发育；雄花序
中图分类号：Ｓ７９２．１５３ 文献标识码：Ａ
ｃＤＮＡＡＦＬＰＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙＥｘｐｒｅｓｓｅｄＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎＥａｒｌｙ
ａｎｄＭｉｄｄｌｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｔａｇｅｓｏｆＭａｌｅＩｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎＷｈｉｔｅＢｉｒｃｈ
（ＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａＳｕｋ．）
ＢＡＯＳｈｕａｉ１，ＫＯＮＧＸｕｅ１，ＸＩＮＧＬｅｉ１，ＺＨＡＮＧＣｕｉｘｉａ２，ＧＵＡＮＭｉｎｘｉａｏ１，ＺＨＡＯＬｉｈｏｎｇ１，
ＬＩＵＣｈｕａｎｇ１，ＬＩＵＸｕｅｍｅｉ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
２．ＦｏｒｅｓｔｒｙＳｔａｔｉｏｎｏｆＸｉａｎｇｃｈｅｎｇＴｏｗｎ，Ｚｏｕｃｈｅｎｇ ２７３５０３，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ．）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍａｌｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｆｏｒＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａｔａｋｅｓａｌｍｏｓｔａｗｈｏｌｅｙｅａｒｆｒｏｍ
ｔｈｅｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｍａｌｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｏｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍａｔｕｒｅｐｏｌｅｎ．Ｔｈｅｅａｒｌｙａｎｄｍｉｄｄｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｐｅｒｉｏｄｓａｒｅｍｕｃｈｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍａｌｅｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｏｆＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌａ．Ｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｅａｒｌｙａｎｄｍｉｄｄｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｓｍ（ｃＤＮＡＡＦＬＰ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａｍｏｎｇ６２ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｓｅｑｕｅｎｃｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ，３０ｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓｔｏ
ｋｎｏｗｎｇｅｎｅｓｉｎＧｅｎｂａｎｋ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｏｔｈｅｒ３２ｗｅｒｅｓｕｐｐｏｓｅｄｔｏｕｎｋｎｏｗｎａｎｄｎｅｗｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＧＯａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅｓｅｋｎｏｗｎｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ，ｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ，ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｉｍｕｌｕｓ，
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｎｗｉｔｈｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉ
ｔｙ，ｂｉｎｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｅｎｚｙｍｅｒｅｇｕｌａｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｗｏｉｍｐｏｒｔａｎｔＴＤＦｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎａｎｄｍａｌｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌａｗｅｒｅｆｏｕｎｄ，ｎａｍｅｄａｓＢｐｌｂｓ６５８ａｎｄＢｐｌｂｓ１９９．Ｉｎａｄｄｉ
第４期 暴 帅等：白桦雄花序发育早期和中期差异表达基因的ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
ｔｉｏｎ，ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ１１ＴＤＦｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｂｙｑＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ
ｔｈｅｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｏｔｈｆｌｏｒａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓｏｆＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌａｗｉｔｈｄｉｓ
ｔｉｎｃｔｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｅｒｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａ；ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ｆｌｏｒａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ｍａｌｅｉｎｆｌｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ
当植物经过充分的营养生长后，达到一定的生
理状态，当外界诱导成花的因素存在时（如光周
期，春化作用和激素），就进入花发育阶段［１］。随
着测序技术和生物信息学的迅猛发展，植物花发育
转录表达谱研究日益丰富，并提供了大量有价值的
序列和调控网络信息。基于生殖发育的序列表达
谱将会对其表型特征相关的基因提供功能注解。
例如，ＳｈａｏｇｕｉＧｕｏ等从黄瓜（ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）两
种类型的花即雌花和雌雄同体花的花芽中鉴定了
大量差异表达基因和 ＳＳＲ、ＳＮＰ标记，这些 ＥＳＴ序
列有利于促进更好地了解植物性别决定的分子机
制［２］。ＤａｖｉｄＨ．ａｎｄＤａｖｉｄＴ．［３］利 用 Ａｆｙｍｅｔｒｉｘ
ＡＴＨ１基因芯片技术鉴定了拟南芥１３５５个雄配子
体特异表达的基因，并揭示了配子体调控网络的调
节蛋白和共表达基因。共表达分析鉴定了１７个玉
米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）基因模块，其表达模式与曾报导
的基因有共同之处，其中的基因注释、基因家族特
征和重要的候选基因等信息将有助于了解玉米的
生殖发育机理［４］。
被子植物雄性生殖发育以减数分裂和小孢子
发生为基础，在此期间，多种基因共同调控下使得
此过程顺利完成［５］。近年来分子遗传研究表明在
拟南芥小孢子发生阶段，信号分子和转录因子在决
定花药细胞类型和控制基因表达方面起着重要作
用［６］，并有不少转基因的报道。从拟南芥中分离
出的 ＦＬＡ３基因参与小孢子发育和花粉内壁的形
成［７］，ＡＭＳ（ＡＢＯＲＴＥＤＭＩＣＲＯＳＰＯＲＥＳ）基因编码
的是一种 ｂＨＬＨ蛋白，受转录因子 ＭＹＢ３５调控，控
制许多与开花相关的基因［８］，是正常小孢子发生
所必需的［９］。
白桦（ＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａＳｕｋ．）为雌雄同株的单
性花树种，其雄花为不完全花，只有两轮，即退化的
花被和雄蕊，其生殖发育周期很长，近１年，单核小
包子经过冬季后，在次年春天发育为成熟的雄配子
体，从小孢子母细胞至形成小孢子历时 １个多
月［１０］。根据多年来对白桦雄花序发育的解剖学研
究结果［１０］，将雄花序发育划分为早期、中期和晚期。
早期为减数分裂前，中期为减数分裂或小孢子发生，
后期为雄配子体形成期。而雄花序发育早期和中期
是决定雄配子体即花粉形成的重要阶段。因此，这
两个时期的差异表达基因将在一定程度上揭示雄花
序早、中期发育的分子机制。互补脱氧核酸扩增片
断长度多态性（ｃＤＮＡＡＦＬＰ）是一项分析基因差异
表达的技术，具有灵敏度高、重复性好、假阳性低等
优点［１１］，是寻找差异表达基因的有效手段［１２］。本
研究利用 ｃＤＮＡＡＦＬＰ技术分析白桦雄花序早期和
中期差异表达基因，对其进行生物信息学功能预测
和归类，确定关键基因及其表达规律，将有助于今后
进一步揭示白桦雄花发育的分子机制。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
白桦雄花一般在每年的６月初开始发育，７月
中旬到８月中旬是减数分裂和小孢子发生时期［７］。
本研究材料经取材后解剖观察，早期（减数分裂前）
雄花序采自２０１１年６月１７日至２０１１年６月２９日，
中期（减数分裂期）雄花序采自２０１１年８月５日至
２０１１年８月１７日，每３ ４天取材１次，每次取生
长良好的雄花序，用液氮速冻后放入 －８０℃冰箱中
保存，用于 ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析。２０１２年 ５月 １日至
２０１２年５月３日搜集白桦成熟花粉，２０１２年７月１８
日对白桦的老叶、老叶柄、幼叶、幼叶柄、老枝、幼枝、
嫩枝、雌花、雌花柄、雄花进行取材，用液氮速冻后放
入－８０℃冰箱中保存，用于ｑＲＴ－ＰＣＲ分析。
１．２ 总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成
采用 ＣＴＡＢＬｉＣｌ沉淀法提取总 ＲＮＡ［１３］。各白
桦组织的总 ＲＮＡ经 ＤＮａｓｅＩ（ＭＢＩ公司）消化除去
ＤＮＡ，并用ＲＮＡ清洁纯化试剂盒（北京盖宁金诺生
物技术有限责任公司）纯化回收，０．８％琼脂糖凝胶
电泳检测，紫外分光光度计检测其纯度及浓度。采
用ＭＭＬＶＲｔａｓｅｃＤＮＡ合成试剂盒（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）
合成双链ｃＤＮＡ。
１．３ ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
ｃＤＮＡＡＦＬＰ应用技术参考了 Ｂａｃｈｅｍ等［１４］的
７６４
林 业 科 学 研 究 第２７卷
方法，并利用优化的白桦 ｃＤＮＡＡＦＬＰ体系［１５］，采用
低频酶ＥｃｏＲＩ和高频酶 ＭｓｅＩ酶切双链 ｃＤＮＡ。预
扩增中Ｍｇ２＋浓度为２ｍｍｏｌ·Ｌ－１，引物浓度为０．３
μｍｏｌ·Ｌ－１，ｄＮＴＰ浓度为０．２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，Ｔａｑ酶浓
度为１Ｕ，退火温度控制在６０℃时，预扩增的结果好。
扩增的产物经过６％的聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）电
泳和银染检测。
１．４ 差异片段的克隆及序列分析
将ｃＤＮＡＡＦＬＰ得到的具有差异表达条带经过
回收和纯化克隆到 ＰＭＤ１８Ｔ载体（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）
并测序，利用ＢＬＡＳＴＸ程序与ＮＣＢＩ数据库进行同源
性比对分析［１６］。应用 Ｂｌａｓｔ２ｇｏ软件进行 ＧＯ（Ｇｅｎｅ
ＯｎｔｏｌｏｇｙＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）分析。
１．５ 差异片段的ｑＲＴＰＣＲ分析
使用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物（表１）。反应试
剂为ＴｒａｎｓＳｔａｒｔＴｏｐＧｒｅｅｎｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ（北京全式
金），反应体系：１０μＬＴｒａｎｓＴｏｐｑＰＣＲＭｉｘ、１μＬｃＤ
ＮＡ模板、上下游引物各１μＬ、６μＬｄｄＨ２Ｏ。扩增程
序：９４℃ ３０ｓ；９４℃ １２ｓ，５７℃ ３０ｓ，７２℃ ４５ｓ，７９℃
１ｓ，共４５个循环。实验设置３次重复，整个反应在
ＡＢＩ公司生产的荧光实时定量 ＰＣＲ仪上进行，通过
利用ＯｐｔｉｃｏｎＭｏｎｉｔｏｒ２软件进行数据的处理和分析。
表１ 用于ｑＲＴＰＣＲ的引物
基因名称 上游引物 （５＇３＇） 下游引物 （５＇３＇）
Ｂｐｌｂｓ６８ ＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣ
ＴＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧＣ
ＣＡＡＣＣＴＣＴ
Ｂｐｌｂｓ１１０ＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＴＡＴＧＴＣＣＧＡＣ
ＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＡＣＡＴ
ＧＡＴＡＣＴＴＡＴＴ
Ｂｐｌｂｓ１９９ＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧ
ＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧ
ＴＡＡＧＣ
Ｂｐｌｂｓ３１９ＧＡＣＣＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣ
ＣＧＣＡＡＴＣＴＡＣＣＡＡＣＴ
ＴＣＴＧＡ
Ｂｐｌｂｓ３３６
ＡＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡＣＴＧ
ＧＡＧＡＧ
ＣＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＡＧＧ
ＴＡＧＡＡ
Ｂｐｌｂｓ４１９ＴＧＴＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＴＴＧＡ
ＣＣＧＧＣＧＡＴＴＡＣ
ＴＡＧＣＧＡＴＴＣ
Ｂｐｌｂｓ４２８ＴＡＣＡＣＣＡＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＣ
ＣＡＡＴＴＣＡＧ
ＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡ
Ｂｐｌｂｓ４５４ＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＧ
ＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＣＡＧ
ＧＡＡＧＡＴＧ
Ｂｐｌｂｓ４７５ＴＴＣＡＧＴＣＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＧＴＡ
ＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡ
ＡＧＴＡＡＴＣＧ
Ｂｐｌｂｓ５５３ＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＣＧ
ＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴ
ＧＴＣＴＣＡ
Ｂｐｌｂｓ７１５ＧＧＡＧＧＣＴＴＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡ
ＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＡＣＣＡＴ
ＧＴＧＧＡＡＧ
Ａｃｔｉｎ ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧ
ＡＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴ
ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＧ
２ 结果与分析
２．１ ｃＤＮＡＡＦＬＰ筛选的ＴＤＦｓ序列分析
在白桦雄花序发育早期和中期的差异基因表达
谱中，共显示约３５００个多态性片断（ＴＤＦｓ）（图１），
４２５个是差异表达的，其中１２０个 ＴＤＦｓ在早期特异
表达或表达量较高，２１０个 ＴＤＦｓ在中期特异表达或
表达量较高。从中筛选出信号强、重复性好的６２个
条带进行回收、克隆、测序。通过 ＢＬＡＳＴＸ同源性比
对，有３０个片段（４５．５％）与已知基因有较高相似
性，其余片段均是未知功能片段。其中１７个 ＴＤＦｓ
（５６．７％）在雄花早期较强表达（Ｅ），１３个 ＴＤＦｓ
（４３．３％）为中期较强表达（Ｍ）（表２）。
图１ 白桦早期和中期发育雄花序ｃＤＮＡＡＦＬＰ的差异片段
对３０个已知同源性的ＴＤＦｓ序列进行ＧＯ功能
分类，共有 １７个 ＴＤＦｓ得到 ＧＯ注释，其中 １６个
ＴＤＦｓ归于生物学过程，１７个归于分子功能，１３个归
于细胞组分。在生物过程中，共涉及６２个生物过程
（图２），分为６个分类级别，二级分类包含１１个生
物学过程。可见，一个基因可参与多个生物过程。
从二级分类看，代谢过程和细胞过程均为２３．５％，
刺激应答占１３．７％，单生物体过程占９．８％，信号生
物过程和生物调控均为７．８％，另外，生殖、多细胞
有机体过程、细胞组分组织和发育过程均为１．６％。
在分子功能中（图３），共涉及１８项，分为５个分类
级别，二级分类中包含 ４项分子功能：催化活性
５１９％，结合分子活性４０．７％，酶调节活性和转运
活性均为３．７％。细胞组分中，共涉及２９种组分，分
８６４
第４期 暴 帅等：白桦雄花序发育早期和中期差异表达基因的ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
为７个从属级别，二级分类为 ５项，包含细胞
（３７５％）、膜（２５．０％）、细胞器（２８．１％）、细胞外区
（６２５％）和大分子复合体（３．１％）。上述 ＧＯ注释
的多样性说明了雄花序发育中基因表达的复杂性，
也暗示了雄花发育不同阶段具有不同的基因表达和
调控机制。
表２ ｃＤＮＡＡＦＬＰ差异片段的序列同源性分析
差异片段 长度／ｂｐ 同源序列 同源性／Ｅ值 表达模式
Ｂｐｌｂｓ７ １１３ ＮＡＤＨｐｌａｓｔｏｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＩｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｍｏｓｃｈａｔａ（ＡＦＳ３５５２６） １００％／３ｅ１９ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ６８ １７７ Ｄｅｌｔａ１ｐｙｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｆｒｏｍＰｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ×Ｐｏｐｕｌｕｓａｌｂａ（ＡＢＬ９５９５９） ９３％／６ｅ２９ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ１１０ １８０ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ１ｆｒｏｍＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ（ＣＡＪ１８３２９） ９８％／５ｅ３２ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ１７４ １８０ ＳｉｅｖｅｅｌｅｍｅｎｔｏｃｃｌｕｓｉｏｎａｆｒｏｍＭａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ＡＤＮ３２８１５） ５２％／４ｅ１９ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ１９９ ２３３ ＣＣＲ４ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ１ｈｏｍｏｌｏｇ７ｌｉｋｅｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４３０５４８２） ８４％／５ｅ３８ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ２０１ １３８ ＡｕｘｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＡＢＰ１９ａｌｉｋｅｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４２８７６２９） ７８％／５ｅ１３ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ２５３ ２８８ ＰｅｐｔｉｄｅｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｕｌｆｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｌｉｋｅｆｒｏｍＣｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ（ＸＰ＿００４５０１８４０） ９８％／１ｅ１９ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ２７９ １１９ ＰｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｌｉｋｅｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４３０６７４９） ９２％／４ｅ１６ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ３１９ ２５４ Ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ２ｆｒｏｍＰｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ（ＡＣＹ７８３９７） ６８％／２ｅ２７ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ３３６ ２５５
ＳｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔＳＥＣ１１Ｃｌｉｋｅｉｓｏｆｏｒｍ２ｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．Ｖｅｓ
ｃａ（ＸＰ＿００４３０３３２２）
９６％／５ｅ４８ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ３３７ １６８ ＳＵＭＯｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅＳＣＥ１ｌｉｋｅｉｓｏｆｏｒｍ１ｆｒｏｍＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（ＸＰ＿００３５７４２５７） ９７％／３ｅ１５ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ３４３ １９４ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｌｉｋｅｆｒｏｍＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ（ＸＰ＿００２２７７９３９） ７５％／３ｅ２２ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ３４９ １１８ ＲａｃｌｉｋｅＧＴＰｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３ｌｉｋｅｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４２９９５７４） ９７％／５ｅ１９ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ３５１ １４４ ＥｘｐａｎｓｉｎｌｉｋｅＢ１ｌｉｋｅｆｒｏｍＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿００４１４８３８３） ８４％／４ｅ１１ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ３７０ ２２４ Ａｓｐａｒｔｙｌａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ｐｕｔａｔｉｖｅｆｒｏｍＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５１１２１５） ６５％／４ｅ２５ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ３９８ ２１２ Ａｒｇｉｎａｓｅ，ｐａｒｔｉａｌｆｒｏｍＰｒｕｎｕｓａｒｍｅｎｉａｃａ（ＡＡＹ３４９０７） ９３％／１ｅ０７ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ４１９ ２８０ ＯＲＦ１６ｌａｃＺｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＳａｌｍｏｎｅｌａｅｎｔｅｒｉｃａｓｕｂｓｐ（ＡＡＸ６７９２７） ５８％／３ｅ１７ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ４２８ ２２９
Ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｙｌｙｓｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆ２ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ
２，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｉｋｅｆｒｏｍＳｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＸＰ＿００４２４４１０１）
９９％／５ｅ４０ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ４５４ ２１１ Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ２，４ｄｉｅｎｏｙｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅｌｉｋｅｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４３０６５７１） ８７％／９ｅ３６ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ４７５ ２２０ ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ４（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ）ｆｒｏｍＶｉｇｎａａｎｇｕｌａｒｉｓ（ＹＰ＿００７８８９７９５） ９７％／８ｅ３３ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ４８４ １５３ ＰＯＬ３ｌｉｋｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｆｒｏｍＰｈａｓｅｏｌｕｓｃｏｃｃｉｎｅｕｓ（ＡＡＫ１４３１７） ６５％／１ｅ１３ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ５５３ １６０ ＲａｂｔｙｐｅｓｍａｌＧＴＰｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＣｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ（ＢＡＡ７６４２２） ９２％／２ｅ２５ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ６５８ １５１ ＬｅｕｃｉｎｅｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＥＸＳｆｒｏｍＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＸＰ＿００３６１４０１９） ８６％／４ｅ２０ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ６７７ １６５ ＣＯＶ１ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＺｅａｍａｙｓ（ＮＰ＿００１１５１９８１） ９２％／２ｅ０７ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ７０６ １７６ Ｌｙｓｉｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ３ＡｌｉｋｅｆｒｏｍＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ．ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４３０１８４７） ６４％／４ｅ０６ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ７１１ ２３３ ＲＲＮＡｉｎｔｒｏｎｅｎｃｏｄｅｄｈｏｍｉｎｇｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｆｒｏｍＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＸＰ＿００３６１４３８７） ９３％／１ｅ１４ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ７１５ ２５２
Ｒｉｂｕｌｏｓｅ１，５ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔｆｒｏｍ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｌｏｂｕｌｅｓ
（ＢＡＩ５３１２０）
９０％／４ｅ４６ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ７２１ １１７ ＡＴＰａｓｅｆｒｏｍＶｉｔｉｓｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ（ＡＢＣ７０５３４） １００％／１ｅ１６ Ｅ
Ｂｐｌｂｓ７２７ １８８ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇ／ＡＴＰａｓｅａｃｔｉｖａｔｏｒｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿２００６１９） ７９％／３ｅ２６ Ｍ
Ｂｐｌｂｓ７８８ ３０９ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＸＰ＿００３６３１０４６） ６０％／５ｅ２７ Ｍ
２．２ 差异表达ＴＤＦｓ的转录表达
为了检测是否为雄花特异性表达，从３４个具有
功能注释的ＴＤＦｓ中，选择１１个差异表达较强、大于
１００ｂｐ的 ＴＤＦｓ进行不同组织的 ｑＲＴＰＣＲ分析，其
中早期 ＴＤＦｓ６个（Ｂｐｌｂｓ６８、Ｂｐｌｂｓ１９９、Ｂｐｌｂｓ３１９
Ｂｐｌｂｓ３３６、Ｂｐｌｂｓ４２８、Ｂｐｌｂｓ４５４），中期 ＴＤＦｓ５个
（Ｂｐｌｂｓ１１０、 Ｂｐｌｂｓ４１９、 Ｂｐｌｂｓ４７５、 Ｂｐｌｂｓ５５３、
Ｂｐｌｂｓ７１５）。结果表明，几乎所有 １１个基因不仅在
雌雄花中较高表达甚至高于雌雄花（如 Ｂｐｌｂｓ７１５），
也在其它组织有不同程度的较高表达，但它们在不
同组织表达情况有明显差异（图４）。Ｂｐｌｂｓ６８在老
叶中的表达量最高，与雌花相比，在雄花中转录水平
更高（图４ａ）。Ｂｐｌｂｓ１１０在幼叶柄中表达量最高，而
在幼叶和花粉中极低。雌花转录水平较雄花高（图
４ｂ）。Ｂｐｌｂｓ１９９在叶片中的表达量高于其它组织，
且在雌花和雄花中的表达量基本持平（图 ４ｃ）。
Ｂｐｌｂｓ３１９在老叶柄和雄花中的表达量较高，在叶片
和花粉中表达量极低（图４ｄ）。Ｂｐｌｂｓ３３６在老叶中
表达量最高，在茎和花粉中表达量较低，且其表达量
在雌花中高于在雄花中（图４ｅ）。Ｂｐｌｂｓ４１９在雌花
中的表达量非常高，远远高于雄花和其它组织，在叶
片、叶柄和花粉中表达量极低（图４ｆ）。Ｂｐｌｂｓ４２８在
老叶和雌雄花中表达量较高，且在叶柄高于叶片（图
４ｇ）。Ｂｐｌｂｓ４５４在叶组织和雌雄花序中表达水平较
９６４
林 业 科 学 研 究 第２７卷
图２ 白桦雄花发育早期和中期差异表达基因的
ＧＯ生物过程分析
图３ 白桦雄花发育早期和中期差异表达
基因的ＧＯ分子功能分析
高，且老叶明显高于幼叶，而花粉中的表达量极低
（图４ｈ）。Ｂｐｌｂｓ４７５在雌花中表达量非常高，约为雄
花的３倍，在其它组织中表达量均较低（图 ４ｉ）。
Ｂｐｌｂｓ５５３在叶和雌雄花序中表达均较高，在茎和花
粉中表达量低（图４ｊ）。Ｂｐｌｂｓ７１５只在叶片高水平
表达，而在其它组织表达极低（图４ｋ）。值得强调
的是，该１１个ＴＤＦｓ在花粉中的表达量均很低。
３ 讨论
本研究通过ｃＤＮＡＡＦＬＰ技术，获得了白桦雄花
序早期和中期差异表达的６６个 ＴＤＦｓ，对其中３０个
具有功能注释的ＴＤＦｓ进行了ＧＯ分析，发现白桦雄
花两个不同发育时期的生物学过程有很大差异。但
其中的代谢过程、细胞过程、生物调节过程、信号传
递过程、刺激应答和单生物体过程是两个发育时期
共有的，说明相同的生物学过程可能需要不同的基
因维持其发育及生物学活动，同时暗示了这些生物
学过程在维持白桦雄花序早期和中期发育具有重要
作用。除此之外，通过 ＧＯ注释发现了其它重要的
生物学过程，如生殖、多细胞生物过程、定位、发育和
细胞组分的组织等过程。由于本研究涉及的基因数
量较少，不宜根据 ＧＯ注释确定两个发育时期所特
有的生物学过程。另外，白桦雄花序中包含有大量
的苞片，对于雄花的发育具有支持、保护和营养的作
用，因此，这些ＧＯ注释的基因序列不仅来源于花药
及花粉发育组织，同时也可能来源于周围的苞片
组织。
为了更详细了解差异基因所涉及的生物过程，
分析了三级生物过程分类，共包含２１个生物过程，
其中，细胞代谢、有机物代谢和初级代谢过程各占
６／５９，单生物体细胞过程占５／５９，生物过程调控、细
胞刺激应答和单生物信号生物过程均占４／５９，生物
合成过程、分解代谢过程和定位建成均占３／５９。值
得注意的是，各类刺激或胁迫应答过程占１１／５９，除
了生物内因素，环境因素如光、温度、水分、病原体、
激素和生长调节剂等可直接影响植物有性生殖发
育［１７－１８］。因此，白桦雄花发育过程是一个具有活跃
代谢和信号传递的过程，并受多种生物体内外因素
的影响。另外，约１１／５９为单生物细胞过程、单生物
代谢过程、单生物信号生物学过程及单生物发育过
程等。
另外，发现了两个与花发育和细胞周期相关的、
分别具有激酶活性和核酸结合作用的基因：Ｂｐｌｂｓ６５８
和Ｂｐｌｂｓ１９９。根据功能注释，Ｂｐｌｂｓ６５８推测为富亮氨
酸重复序列类受体蛋白激酶（ＬＲＲＲＬＫ），该类ＬＲＲ
０７４
第４期 暴 帅等：白桦雄花序发育早期和中期差异表达基因的ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
ＬＹ：老叶；ＬＹＢ：老叶柄；ＹＹ：幼叶；ＹＹＢ：幼叶柄；ＬＺ：老枝；ＮＺ：嫩枝；ＨＦ：花粉；ＭＩ：雄花；ＦＩ：雌花．
图４ 白桦雄花发育差异表达基因的不同组织转录表达
ＲＬＫ蛋白激酶主要具备３种生物学功能：抗逆性反
应、调节植物发育和介导植物激素信号传导［１９－２０］。
本研究中，其ＧＯ分子功能分类中主要为激酶活性、
催化活性和对含磷基团的转移酶活性，ＧＯ细胞组分
分类中为细胞质、外膜、细胞器、高尔基体。在 ＧＯ
生物过程我们发现了生殖发育、花发育和后胚胎发
育过程。拟南芥中该基因的突变体杂交植株ｂｒｌ１１／
ｂｒｌ１４为完全雄性不育［１９］，由此推测，该基因在白桦
的花发育中可能具有重要作用。除此之外，该基因
还涉及其它ＧＯ生物过程，如生物学过程调控、细胞
交流、单有机体过程、芽系统发育、信号传导和生物
刺激应答，但没有涉及非生物刺激应答，推测该基因
除了参与花发育，也可能参与生物内的多种发育调
控和信号传导。后续将对其进行更深入的生物学功
能研究。
Ｂｐｌｂｓ１９９被推测为编码 ＣＡＦ１的基因。本研究
中，该基因的 ＧＯ分子功能为水解酶活性、核酸结
合、有机循环、核酸酶和杂环复合物结合活性，ＧＯ细
胞组分显示为具有外膜的细胞器和细胞核。ＣＡＦ１
通过与细胞周期蛋白激酶 ＤＢＦ２调控细胞周期［２１］。
缺失ＣＡＦ１可导致雄鼠不育［２２］。该基因可能参与白
桦雄花发育，值得今后进一步探讨。
ｑＲＴＰＣＲ分析中，Ｂｐｌｂｓ６８、Ｂｐｌｂｓ３１９、Ｂｐｌｂｓ４２８、
Ｂｐｌｂｓ４５４和Ｂｐｌｂｓ４７５分别在雄花中比在其它多数组
织中的表达量较高，后四者在雄花中的表达量高于
其它７个ＴＤＦｓ（图４），推测它们可能与雄花发育有
关。另外，Ｂｐｌｂｓ４１９和 Ｂｐｌｂｓ４７５在雌花中表达量非
常高，Ｂｐｌｂｓ５５３在雌雄花和叶组织表达量显著高于
１７４
林 业 科 学 研 究 第２７卷
其他组织，Ｂｐｌｂｓ７１５只在叶片中高表达，说明它们具
有较强的组织特异性表达差异（图４）。
在雄花表达量较高的４个ＴＤＦｓ中，Ｂｐｌｂｓ３１９与
桃的ＥＩＮ２（乙烯不敏感２）有着较高的同源性，乙烯
是一种植物激素，在植物的生长和发育过程中起着
重要的作用［２３］。ＥＩＮ２蛋白定位于内质网，在乙稀
信号中起至关重要的作用［２４］。Ｅｃｋｅｒ［２５］研究小组发
现内质网中 ＥＩＮ２蛋白加工的一种机制以及信号分
子移动到细胞核中是激活乙稀反应的必要条件，而
且乙烯外界压力条件可触发植物中的各种负反应，
包括光合效率减低、授粉不良以及花、叶和种子损失
等［２６］。在白桦和番茄中具有相似的表达类型，在幼
叶中表达明显高于老叶［２７］，此外本研究还发现，该
基因在雄花序中高表达，在花粉中几乎不表达（图４
ｄ）。这个结果暗示了该基因可能参与叶片成熟和雄
花发育。
Ｂｐｌｂｓ４２８与茄属的酮戊二酸脱氢酶复合物
２（ＯＧＤＨＣ）具有较高的同源性，ＯＧＤＨＣ便随着柠檬
酸合酶和ＮＡＤ异柠檬酸脱氢酶被认为是柠檬酸循
环控制中的调节点，在柠檬酸循环中起着十分重要
的作用［２８－３０］。柠檬酸循环是植物代谢的主要能量
来源，能够为植物花发育提供能量［３１］。本研究中，
该基因在雌雄花和老叶发育中呈高水平表达（图４
ｇ），与在拟南芥老叶中的表达水平相似［３２］，推测
Ｂｐｌｂｓ４２８可能在参与了叶片成熟的同时也参与白桦
雌雄花的成熟。
Ｂｐｌｂｓ４５４与草莓属 ２，４二烯酰辅酶 Ａ还原酶
（ＤＥＣＲ２）同源性较高，近几年研究表明 ＤＥＣＲ２参
与不饱和脂肪酸代谢作用［３３］，植物当中的不饱和脂
肪酸含量决定植物对温度逆境的适应能力［３４］，而温
度是植物花发育过程中至关重要的影响因素。该基
因与Ｂｐｌｂｓ４２８类似，在雌雄花和老叶中明显高表达
（图４ｈ）。由此推测Ｂｐｌｂｓ４２８可能对白桦的生长发
育和花发育中起一定作用，由于相关报道较少，需要
以后更多证据来证明。
Ｂｐｌｂｓ４７５与豇豆的ＡＴＰ合成酶具有较高的同源
性，ＡＴＰ合成酶广泛分布于线粒体内膜，叶绿体类囊
体上，参与氧化磷酸化和光合磷酸化，合成 ＡＴＰ，在
不同的光强下，它会改变对光合作用的反馈调
节［３５］。在早期和中期发育的雄花序外部聚集大量
的绿色苞片，其物质和能量代谢直接影响内部花药
的发育。Ｂｐｌｂｓ４７５在白桦雄花和雌花中较其它组织
呈高水平表达，尤其在雌花中更显著（图４ｉ），与在
拟南芥花序中的表达类型相似［３６］，可以推测该基因
可能在花发育和雌性生殖发育中起着重要的作用。
除了已知功能 ＴＤＦｓ，还获得了一些未知基因
ＴＤＦｓ，进一步研究这些未知基因，可以为白桦花发育
相关新基因开发提供新的资源。本研究筛选出来的
与白桦雄花发育相关的基因，为今后对白桦花发育
以及花器官形成的后续研究奠定了基础。
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