全 文 ：书羊草叶片犮犇犖犃文库的构建及
部分表达序列标签的分析
王丽娟１，金治平１，王能飞２，李晓峰１，刘公社１
（１．中国科学院植物研究所，北京１０００９３；２．国家海洋局青岛海洋一所，山东 青岛２６６０６１）
摘要：采用ＳＭＡＲＴ技术，以品质优良羊草“吉生一号”叶片为材料，构建了高质量ｃＤＮＡ文库。原始文库滴度达到
１０６ｃｆｕ／ｍＬ，扩增文库滴度接近１０１１ｃｆｕ／ｍＬ。随机抽样检查结果表明，插入片断大小在０．５～３．０ｋｂ，主要集中在１
ｋｂ左右，其中检测到插入片断大于１ｋｂ的占７０％，最大达到２．５ｋｂ，其重组率达到９８％。同时在扩增文库中检测
到了羊草维生素Ｅ合成途径中的关键酶基因α生育酚环化酶（ＴＣ）及γ生育酚甲基转移酶（γＴＭＴ）的特异信号，
挑选３０７个筛选出了２８５条ＥＳＴ序列，将得到的１１７条非重复序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已知序列比对，获得了如３磷酸
甘油醛脱氢酶、光系统Ⅱ蛋白Ｄ１、翻译起始因子蛋白、翻译延生因子蛋白、ＲＮａｓｅＳｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒ蛋白等基
因。羊草高质量的ｃＤＮＡ文库的构建为进一步从分子水平研究羊草及开发利用这一基因资源提供了条件。
关键词：羊草；叶片；ｃＤＮＡ文库；ＥＳＴ
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３．２；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０１００６５０７
羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）为禾本科赖草属植物，主要以我国东北部松嫩平原及内蒙古东部为分布中心，是欧
亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种［１］。羊草以其生长期长，产草量高，营养丰富，适口性好，
享有“牲口的细粮”的美称，同时羊草具有很强的抗寒、抗旱、耐盐碱及耐土壤瘠薄的能力，具有很强的生态适应
性，在生态环境保护中具有重要作用。前人对羊草的生态学［２～７］、抗性及生物多样性［８～１１］、种质资源鉴定［１２～１４］等
多方面进行了研究。而在分子生物学的研究方面，除中国科学院植物研究所能源中心基因筛选与分子育种实验
室曾克隆过硫氧还蛋白酶基因、叶绿体核酮糖１，５二磷酸羧化酶／加氧酶Ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基基因外［１５～１８］，却鲜有报
道；尽管在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中有１６４８个叶片及根ＥＳＴ序列，但远不能满足对其特性相关分子水平的研究。本
研究以中国特有的优质羊草品种“吉生一号”为材料，构建高质量的ｃＤＮＡ文库，以期为羊草这一重要资源的深
入研究及开发利用奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
“吉生一号”羊草（王克平女士惠赠）种子种植于中国科学院植物研究所试验田，在自然条件下生长。春季羊
草返青后２个月，选取生长旺盛的幼嫩叶片，每２００ｍｇ１份，分别冻存于液氮中备用。
１．２ 试剂
文库构建试剂盒ＣｒｅａｔｏｒＴＭＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃａｔｌｏｇ＃：Ｋ１０５３１）购自ＢＤＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ公司，ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩＺＯＬ购自ＧＩＢＣＯ公司，无ＲＮＡ酶的离心管、枪头及其他常规试剂
及耗材均为国产。
１．３ 研究方法
１．３．１ 总ＲＮＡ的提取 取１份液氮中保存的羊草叶片（２００ｍｇ），于加有液氮的研钵中迅速研磨后，平均转移
到２个ＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａ，焦碳酸二乙酯）处理的１．５ｍＬ离心管中，立即加入１ｍＬＴＲＩＺＯＬ提取液，混
匀后，后续的操作参照ＴＲＩＺＯＬ提取液说明书进行。用７５％乙醇洗涤后，取１管ＲＮＡ，用ＤＥＰＣ处理的水溶解，
第１８卷 第１期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
６５－７１
２００９年２月
收稿日期：２００８０１２１；改回日期：２００８０４１４
基金项目：国家基础研究发展规划（９７３项目）课题 （２００７ＣＢ１０８９０５）资助。
作者简介：王丽娟（１９７４），女，回族，宁夏吴忠人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｊｕａｎｗａｎｇ２７９＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｇｓ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
分成２份，第１份用ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＤＵ６４０紫外分光光度计测定ＲＮＡ的纯度及含量，将第２份置于３７℃下保
育２ｈ后，做非变性琼脂糖电泳，检测ＲＮＡ的完整性和稳定性。
１．３．２ ｃＤＮＡ第一链的合成与ＬＤＰＣＲ（ｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅＰＣＲ） 取２μＬ（约１．０μｇ）总ＲＮＡ，参照试剂盒操作程
序做反转录及ＬＤＰＣＲ。取５μＬＬＤＰＣＲ产物，用１．１％ＴＡＥ凝胶进行电泳检测。
１．３．３ ｃＤＮＡ的纯化与回收 参照试剂盒操作程序，取５０μＬＬＤＰＣＲ产物，加入２μＬ蛋白酶Ｋ（２０μｇ／μＬ），
于４５℃保育２０ｍｉｎ消化残存的Ｔａｑ酶。纯化回收ｃＤＮＡ，用ＳｆｉⅠ于５０℃酶切２ｈ产生粘性末端。将酶切产物
过ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ４００柱，每管过柱收集物取３μＬ电泳检测，回收５００ｂｐ以上的ｃＤＮＡ片段。
１．３．４ ｃＤＮＡ与ｐＤＮＲＬＩＢ载体的连接及连接产物纯化 参照试剂盒要求分别取０．５，１．０和１．５μＬｃＤＮＡ与
１μＬｐＤＮＲＬＩＢ载体设置３个试连接反应，１６℃下连接过夜。连接产物用糖原乙醇于－７０℃下沉淀过夜，室温
下回收ＤＮＡ，溶于５μＬＤＥＰＣ处理的水中备用。
１．３．５ 大肠杆菌电击感受态制备与电击转化 参照试剂盒说明书，采用１０％甘油法制备大肠杆菌ＤＨ５α电击
感受态，取２５μＬ电击感受态，加入５μＬ纯化连接产物混合均匀，转入冰预冷的０．１ｍＬ电击杯中，在电击仪
（ＥＱＵＩＢＩＯ）中，于２５００Ｖ下电击５ｍｓ后，将电击产物立即转入盛有９７０μＬＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培养基的１０ｍＬ
离心管中，３７℃，２２５ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养１ｈ获得原始文库。
１．３．６ 文库质量评价 原始文库与扩增文库滴度测定参照试剂盒说明书，取５μＬ原始文库做１０倍梯度稀释，
测定原始文库滴度。按每个１５ｃｍ平板２×１０４ 个独立克隆扩增原始文库。待每个平板上菌生长到汇聚时，加入
５ｍＬ含１０％甘油的ＬＢ培养基，收集所有菌落并汇聚在一起混合均匀为扩增文库。总文库分装到１．５ｍＬ离心
管中，保存于－７０℃。取５μＬ总文库做梯度稀释，测定总文库滴度。
文库插入片段大小及重组率检测：从原始文库中随机挑选５０个单菌落，接种于０．５ｍＬ附加３４ｍｇ／Ｌ氯霉
素的ＬＢ培养基中，３７℃振荡培养过夜。取３μＬ培养物为模板，以 Ｍ１３ｆＭ１３ｒ为引物，做ＰＣＲ检测插入片段大
小并估计文库重组率。扩增条件：在９５℃变性１０ｍｉｎ裂解菌体后，加入ＰＣＲ反应混合物，９４℃预变性４ｍｉｎ；
９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸３ｍｉｎ，２５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
从扩增总文库中检测目的基因：特异基因检测都采用降落ＰＣＲ（ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ），在９５℃变性１０ｍｉｎ裂
解菌体，加入ＰＣＲ反应混合物，并按以下程序扩增：９４℃变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５０～６５℃退火１ｍｉｎ，每循
环退火温度下降０．５℃，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，１５个循环；
７２℃延伸５ｍｉｎ。
１．４ 引物设计
根据文库载体ｐＤＮＲＬＩＢ序列设计检测插入片断引物 Ｍ１３ｆＭ１３ｒ，根据中国科学院植物研究所能源中心基
因筛选与分子育种实验室前期工作得到的羊草维生素Ｅ生物合成关键酶基因α生育酚环化酶（ＴＣ）及γ生育酚
甲基转移酶（γＴＭＴ）特异探针序列设计基因特异检测引物ＰｔｃｆＰｔｃｒ及ＰｔｍｔｆＰｔｍｔｒ，预期产物分别为６６０和
４００ｂｐ，引物序列如下：
Ｍ１３ｆ：５′ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＡ３′
Ｍ１３ｒ：５′ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＴＣ３′
Ｐｔｃｆ：５′ＧＧＡＧＴＡＴＡＧＣＡＣＡＣＧＣＣＣ３′
Ｐｔｃｒ：５′ＧＡＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＧＣＣ３′
Ｐｔｍｔｆ：５′ＧＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＡＴＧＧＡ３′
Ｐｔｍｔｒ：５′ＣＣＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＧＣＡＴ３′
２ 结果与分析
２．１ ＲＮＡ纯度
ＲＮＡ的完整度与稳定性直接决定ｃＤＮＡ的完整度，是构建高质量ｃＤＮＡ文库的关键。采用ＴＲＩＺＯＬ法提
取的羊草叶片总ＲＮＡ在３７℃下保育２ｈ后的非变性电泳结果（图１）显示其具有良好的完整度及稳定性，同时测
得Ａ２６０／Ａ２８０＝１．９０，表明ＲＮＡ具有很高纯度，为建立高质量羊草ｃＤＮＡ文库奠定了基础。
６６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
２．２ 反转录及ＬＤＰＣＲ
由于ＳＭＡＲＴ技术只需要微量的总ＲＮＡ（０．０５～
图１ 羊草叶片总犚犖犃
犉犻犵．１ 犜狅狋犪犾犚犖犃犳狉狅犿犾犲犪狏犲狊狅犳犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊
图２ 羊草叶片犮犇犖犃犔犇犘犆犚
犉犻犵．２ 犔犇犘犆犚犮犇犖犃狅狀１．１％犪狉犵狉狅狊犲犵犲犾
Ｍ：１ｋｂＤＮＡ分子量标记；Ｌｃ：ｃＤＮＡＬＤＰＣＲ产物
Ｍ：１ｋｂＤＮＡｌａｄｄｅｒ；Ｌｃ：ＰｒｏｄｕｃｔｏｆｃＤＮＡＬＤＰＣＲ
１．００μｇ）为模板进行反转录，所产生的第一链ｃＤＮＡ量
极少，不足以直接进行后续试验，必须经过 ＬＤＰＣＲ
（ｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅＰＣＲ）扩增后才能获得足够量的ｃＤＮＡ。
以１μｇ羊草叶片总ＲＮＡ为模板反转录后得到１０μＬ第
一链ｃＤＮＡ。参照试剂盒说明，进行１８个循环的ＬＤ
ＰＣＲ，获得的ｃＤＮＡ为０．５～３．０ｋｂ，而且在１～２ｋｂ有
２条十分明显的丰富带（图２），表明已获得足够高质量的
ｃＤＮＡ，符合建库的要求。
２．３ ｃＤＮＡ酶切纯化连接与电击转化
通过蛋白酶Ｋ及ＳｆｉⅠ酶切的ｃＤＮＡ中含有大量的
小于５００ｂｐ的小片段，这些小片段包括未使用完的引
物、引物二聚体以及小的ｃＤＮＡ片段，这些片段必须通
过ＳＰＩＮ４００柱的分级分离除去，选取合适大小的片段
进行克隆。一般通过ＳＰＩＮ４００柱分离的第６～１０个管
中的片段比较合适，但到了第１０管时就有较多的小于
５００ｂｐ的片段，第６管的量比较少，但片段很大（由于
ＤＮＡ量少且在高电压下短时间电泳，电泳图的效果多不
理想，在此未显示），因此回收第６～９管产物，用于连接
克隆。电击转化的转化率很高，但这取决于电击条件和
感受态的质量。采用ｐＤＮＲＬＩＢ质粒作对照，优化转化
条件。在２５００Ｖ，５ｍｓ的条件下，０．１μｇ质粒可以获得
１０７ 个转化子。在此条件下对３个试连接进行转化，都
得到了理想的结果。
２．４ 文库质量评价
ｃＤＮＡ文库的质量取决于原始文库与扩增文库的滴度、插入片断的大小及重组率、文库对目的基因的覆盖
度。
２．４．１ 文库滴度 质粒文库的滴度相对于噬菌体文库而言要略低一些，但本试验中所获得的３个试连接及放大
连接原始文库都达到１０６ｃｆｕ／ｍＬ，扩增文库滴度接近１０１１ｃｆｕ／ｍＬ，与噬菌体文库近似。如此高的滴度足以克隆
到低丰度表达的基因。
２．４．２ 重组率及插入片断大小检测 从原始文库中随机挑取的单克隆ＰＣＲ检测结果表明，文库重组率达到
９８％，插入片段最大可到２．５ｋｂ，主要集中在大于１ｋｂ的区域，约占７０％左右（图３）。由于植物ｃＤＮＡ一般为
０．５～３．０ｋｂ，主要集中于１ｋｂ左右，因此本试验所获得的文库具有极高的重组率与完整度。
２．４．３ 覆盖度检测 不同目的对文库覆盖度的要求各不相同，但以能检测到目的基因的存在为标准。本试验
中，以特异探针检测到了羊草维生素Ｅ生物合成的关键酶基因α生育酚环化酶（ＴＣ）及γ生育酚甲基转移酶（γ
ＴＭＴ）的特异信号（图４），表明所获得的文库具有较高的覆盖度。
以上结果表明，本试验已经获得了高质量的羊草叶片ｃＤＮＡ文库。
２．５ ＥＳＴ序列分析
随机挑选３０７个重组子提取质粒纯化后，以 Ｍ１３为引物测序，在去除载体序列后，获得２８５个ＥＳＴｓ，其中部
分ＥＳＴ序列已经录入ＧｅｎＢａｎｋ，其序列接受号为ＤＹ６３２４４０ＤＹ６３２４２２、ＤＹ８９５７７４ＤＹ８９５７４４。选取测序后长
度大于１００ｂｐ的序列用相似性比较的分析（ＢＬＡＳＴ，ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ））在ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎ
ｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，美国国立生物技术信息中心）中的数据库进行同源性检索，共得到非重复序列
７６第１８卷第１期 草业学报２００９年
图３ 文库插入片断大小及重组率检测
犉犻犵．３ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犻狀狊犲狉狋狊狅犳狋犺犲犾犻犫狉犪狉狔犪狀犱狋犺犲犮狅犿犫犻狀犻狀犵狉犪狋犲
Ｍ：１ｋｂＤＮＡ分子量标记；－ＣＫ：阴性对照；１～１９：随机挑选单克隆 Ｍ：１ｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ；－ＣＫ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；
１－１９：Ｒａｄｏｍｓｅｌｅｃｔｅｄｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒｏｆｓｉｎｇｌｅｃｌｏｎｅｓ
１１７条，经过与ＮＣＢＩ数据库比对，发现８４条序列在ＮＣＢＩ
图４ 文库特异基因检测
犉犻犵．４ 犌犲狀犲狊狆犲犮犻犪犾犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犾犻犫狉犪狉狔
Ｍ：１００ｂｐＤＮＡ分子量标记；－ＣＫ：阴性对照；１：ＴＣ；２：
γ－ＴＭＴＭ：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；－ＣＫ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ；１：ＴＣ；２：γＴＭＴ
数据库中检索到同源序列，其中功能已知的有６２条，占
７３．８％，功能未知的２２条，占２６．２％。经过分析后，将
与已知基因同源的ＥＳＴｓ按功能分为４个大类：第１大
类为与初级代谢相关的基因，此类中参与光合作用相关
的基因，如１，５二磷酸核酮糖羧化酶、光合系统中心蛋
白在统计结果中出现的频率最高；第２大类为参与蛋白
质合成加工、细胞结构建成等过程的基因，如翻译延长因
子、甲硫氨酸合成酶；第３类为细胞代谢、细胞结构、细胞
信号相关基因，如３磷酸甘油醛脱氢酶、天冬氨酸蛋白
酶；第４类为抗逆相关基因如热激蛋白、冷积累蛋白等。
其分析结果见表１。
３ 讨论
３．１ ＳＭＡＲＴ技术的特点
构建高质量的ｃＤＮＡ文库是研究某一特定器官、组织或特定时期基因表达及克隆这些基因的有效手段之
一，目前商售ｃＤＮＡ文库构建试剂盒已有很多种，其原理基本相同。但多数试剂盒都要求有大量高质量的总
ＲＮＡ或ｍＲＮＡ，而且在操作过程中都要求进行甲基化、加接头等多步操作，不仅繁琐而且容易使产物连续损失，
乃至降解。本试验采用ＢＤＣＬＯＮＴＥＣＨ 公司的ＳＭＡＲＴｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔ，并采用ＳＭＡＲＴ（
ｓｗｉｔｃｈｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍａｔ５′ｅｎｄｏｆＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）技术，可以在反转录合成第一链ｃＤＮＡ时利用反转录酶的末端
滑动机制所自动添加的３个Ｃ碱基，将带有３个互补的Ｇ碱基的５接头引物直接接上并继续反转录获得完整的
第一链ｃＤＮＡ，该ｃＤＮＡ两端都已经自动添加了接头引物，可以直接通过ＬＤＰＣＲ将微量的ｃＤＮＡ扩增至足以
进行后续操作，同时未转录到末端提前终止的ｃＤＮＡ不能添加这３个碱基，因此在ＬＤＰＣＲ中，这类不完整的
ｃＤＮＡ就得不到扩增，从而保证ＬＤＰＣＲ产物都具有完整的５′末端，为获得全长基因序列奠定了基础。对获取
大量ＲＮＡ比较困难的材料，该方法具有独特的优势。尽管ＳＭＡＲＴ技术高效简单，但ＰＣＲ扩增过程可能导致
的失真，仍然是个值得关注的问题。不过随着越来越多高保真的Ｔａｑ酶羊草总ＲＮＡ提取叶片材料的开发和利
用，ＰＣＲ过程中的失真问题在本方法中已被控制在可以接受的范围内。
３．２ ＥＳＴ序列分析
羊草总ＲＮＡ提取材料为叶片除细胞质ｒＲＮＡ外，还存在大量的叶绿体ｒＲＮＡ。在反转录过程中，叶绿体基
因与核基因一起被转录成ｃＤＮＡ，这可能是所构建的ｃＤＮＡ文库中与光合作用及叶绿体发育相关基因大量存在
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
表１ 部分功能基因在犌犲狀犅犪狀犽中比对结果
犜犪犫犾犲１ 犘犪狉狋犻犪犾狉犲狊狌犾狋犳狅狉犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犺狅犿狅犾狅犵狔狑犻狋犺犳狌狀犮狋犻狅狀犵犲狀犲狊犱犲狆狅狊犻狋犲犱犻狀犌犲狀犅犪狀犽
编号
ＣｏｎｔｉｇＩＤ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
比对结果
Ｈｉｇｈｅｓｔｈｏｍｏｌｏｇｙ
来源物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
期望值
Ｅｖａｌｕｅ
数量
Ｃｏｐｉｅｓ
Ｃｏｎｔｉｇ２３ ４８１ 光系统ＩＩ多肽ＰｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩＩｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ 小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ ８
Ｃｏｎｔｉｇ１８ ５７４ １，５二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶Ｒｉｂｕｌｏｓｅ１，５ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ
１，５二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶大亚基 Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅｌａｒｇｅ
ｓｕｂｕｎｉｔ（ｒｂｃＬ）ｇｅｎｅ
新麦草犘狊犪狋犺狔狉狅狊狋犪犮犺狔狊犼狌狀犮犲犪
绵毛丝盖伞犐狀狅犮狔犫犲犾犪狀狌犵犻狀狅狊犪
０ １８
Ｃｏｎｔｉｇ３４ ４２１ 天冬氨酸蛋白酶 Ａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲 ９ｅ１７５ １
Ｃｏｎｔｉｇ５７ ４７２ 茉莉酮酸酯诱导蛋白Ｊａｓｍｏｎａｔｅｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ６ｅ１１４ ２
Ｃｏｎｔｉｇ１３ ７２１ ＲＮａｓｅＳ样蛋白 ＲＮａｓｅＳｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ（ｒｓｈ１）ｇｅｎｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ９ｅ１３８ ２
Ｃｏｎｔｉｇ５３ ５８４ 光系统ＩＩＤ１蛋白ＰｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩＩｐｒｏｔｅｉｎＤ１ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ １２
Ｃｏｎｔｉｇ１５ ４３４ 聚泛素蛋白Ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ 复原草犛狆狅狉狅犫狅犾狌狊狊狋犪狆犳犻犪狀狌狊 ５ｅ１７８ １
Ｃｏｎｔｉｇ１０ ７５４ ３磷酸甘油醛脱氢酶 Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ ２
Ｃｏｎｔｉｇ４４ ８３７ 膜蛋白Ｅｎｖｅｌｏｐｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ 拟斯卑尔脱山羊草
犃犲犵犻犾狅狆狊狊狆犲犾狋狅犻犱犲狊
０ １
Ｃｏｎｔｉｇ４２ ４１２ 网格蛋白ＣｌａｔｈｒｉｎａｓｓｅｍｂｌｙＡＰ１７ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ 水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 ２ｅ１６４ １
Ｃｏｎｔｉｇ２６ ３６６ 磷酸二酯酶Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 １ｅ１５３ １
Ｃｏｎｔｉｇ４７ ６１２ ｃｐ３１ＢＨｖ蛋白Ｃｐ３１ＢＨｖｐｒｏｔｅｉｎ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ５ １００７ 翻译延伸因子１α亚基 Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１ａｌｐｈａｓｕｂｕｎｉｔ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ ２
Ｃｏｎｔｉｇ６ ４０４ 泛素 Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ６ｅ１７７ １
Ｃｏｎｔｉｇ１７ ９１２ 氨酸羧肽酶类蛋白Ｓｅｒｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ８ ６６７ 小麦谷氨酰胺合成酶 Ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ ２
Ｃｏｎｔｉｇ１９ ７８３ 蛋氨酸合酶２Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ２ｅｎｚｙｍｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ１２ ４８２ 碳酸酐酶Ｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ１６ ５９２ 线粒体２６ｓ亚基 Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎｒｒｎ２６ｇｅｎｅｆｏｒｒＲＮＡｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔ（２６Ｓ）小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ ２
Ｃｏｎｔｉｇ１１ ２７５ 细胞色素还原酶Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 １ｅ１３２ １
Ｃｏｎｔｉｇ２８ ２８１ 丙氨酸转氨酶 Ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ５ｅ１２６ ２
Ｃｏｎｔｉｇ３２ ４３８ Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶 Ｒｉｂｕｌｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ ２
Ｃｏｎｔｉｇ１９ ７４０ 起始因子４Ｆｐ８２亚基Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｓｏｚｙｍｅ４Ｆｐ８２ｓｕｂｕｎｉｔ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ４２ ４７６ 冷积累蛋白Ｃｏｌｄａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ２ｅ１７９ １
Ｃｏｎｔｉｇ１４ ２６６ 假定的酸性磷酸酶Ｐｕｔａｔｉｖｅａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ 大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 １ｅ９１ １
Ｃｏｎｔｉｇ２７ ６４９ 假定的纤维素合成酶亚基Ｐｕｔａｔｉｖｅｃｅｌｕｌｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔ 大麦 犎．狏狌犾犵犪狉犲 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ４０ ５３５ 叶绿体ＮＡＤＰＨ还原酶ＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＮＡＤＰＨｐｌａｓｔｏｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｒｅｄｕｃｔａｓｅ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ ３
Ｃｏｎｔｉｇ３ ４３３ 翻译起始因子１ＡＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１Ａ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ２９ ９２６ 维生素Ｅ环化酶 Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｃｙｃｌａｓｅ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ０ １
Ｃｏｎｔｉｇ３１ ７３４ 热激蛋白Ｐｕｔａｔｉｖｅｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ２ｅ８０ １
的根本原因，通过对文库中部分ＥＳＴｓ进行序列测定和功能分析，对羊草叶片的基因表达情况进行初步探索。本
试验所获得的ＥＳＴ中，已知功能的同源基因涉及到光合作用相关的基因如Ｒｕｂｉｓｃｏ基因及ＰＳⅡ的光合反应中
心Ｄ１蛋白基因。光合作用是植物体最重要的生命活动之一，是决定作物产量最重要的因素，作物中９０％以上的
干重直接来源于光合作用。因此，光合作用效率的高低直接关系到作物的产量。Ｒｕｂｉｓｃｏ是决定光合作用同化
速率的关键酶。植物光合作用的能量转化过程是在叶绿体的类囊体上完成的，ＰＳⅡ的光合反应中心Ｄ１蛋白作
为类囊体膜上的重要色素蛋白复合物，对光合作用的完成起着至关重要的作用［１９］。已有研究表明，植物在低温、
衰老、水分亏缺、重金属胁迫以及紫外线照射等条件下，可通过影响Ｄ１蛋白的表达及其周转，进而影响植物的光
合作用［２０～２３］。
９６第１８卷第１期 草业学报２００９年
翻译延伸因子１Ａ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１ａｌｐｈａ，ＥＦ１α）是蛋白质合成过程中的关键因子，ｅＥＦ１α在蛋白质合成
中起主要作用，与氨酰ｔＲＮＡ和ＧＴＰ生成三元复合物结合在核糖体Ａ位点，于是植物细胞内的编码基因就开始
组成型表达［２４，２５］。研究表明，ＥＦ１α能够与新生的肽链结合，而且能够和在胞质中不能正确折叠的蛋白相互作用
并加速这些蛋白的降解，ＥＦ１α具有类似分子伴侣的活性［２６］。ＥＦ１α除了参与同翻译控制有关的信号传导，还参
与细胞生长、应激反应及运动性有关的信号传导。ＥＦ１α有１个小多基因家族编码，在大肠杆菌中有２个ＥＦＴｕ，
在人类中至少有２个ＥＦ１α，在水稻中有４个基因，而在玉米（犣犲犪犿犪狔狊）中超过１０个基因。自交不亲和是显花植
物防止自交繁殖而形成的一种机制，在许多植物上已经表明ＲＮａｓｅＳｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ参与了植物的自交不亲和［２７］，
目前已在苹果（犕犪犾狌狊狆狌犿犻犾犪）、梨（犘狔狉狌狊狆狔狉犻犳狅犾犻犪）、樱桃（犆犲狉犪狊狌狊狆狊犲狌犱狅犮犲狉犪狊狌狊）、杏（犃狉犿犲狀犻犪犮犪狏狌犾犵犪狉
犻狊）［２８，２９，３０］等树种上分离出了ＲＮａｓｅＳｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ基因，转基因植物的研究表明，ＲＮａｓｅＳｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ在雌蕊识
别和拒绝花粉的过程中起重要作用，参与自交不亲和提供了直接的活体证据［３１，３２］。
虽然获得的ＥＳＴ不多，但ＥＳＴ测序结果表明，包括了核糖体组成蛋白、与初级代谢产物相关的酶类、参与蛋
白质合成加工、细胞结构建成等过程的蛋白、与生物或非生物胁迫相关的蛋白如热激蛋白、冷积累蛋白，与信号传
导相关的蛋白以及构成细胞结构建成或细胞代谢等相关的蛋白等。这些种类的蛋白参与到羊草的物质与能量代
谢中，与羊草基础生理反应紧密相关。羊草是以我国为分布中心的重要牧草资源，同时由于羊草的耐寒、耐旱、耐
盐碱、耐贫瘠等特性，也是重要的抗性基因资源库。本试验构建了高质量的羊草叶片ｃＤＮＡ文库，不仅为克隆羊
草重要基因奠定了基础，还为进一步研究及开发利用这一基因资源库提供了条件。虽然获得了部分的测序结果
所指代的信息不够全面，但是通过这些有限的信息可以粗略地了解羊草叶片基因的种类及表达丰度，这为更全
面、详尽地了解羊草中基因表达模式，进一步挖掘羊草的特有基因资源奠定基础。
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犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犪犮犇犖犃犾犻犫狉犪狉狔狅犳狋犺犲犾犲犪犳狅犳犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犪狉狋犻犪犾犲狓狆狉犲狊狊犲犱狊犲狇狌犲狀犮犲狋犪犵狊
ＷＡＮＧＬｉｊｕａｎ１，ＪＩＮＺｈｉｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧＮｅｎｇｆｅｉ２，ＬＩＸｉａｏｆｅｎｇ１，ＬＩＵＧｏｎｇｓｈｅ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９３，Ｃｈｉｎａ；２．ＦｉｒｓｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ
Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，ＳｔａｔｅＯｃｅａｎｉｃＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６０６１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆ犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊 （“Ｊｉｓｈｅｎｇｙｉｈａｏ”）ｌｅａｖｅｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙＴＲＩＺＯＬｒｅａｇｅｎｔａｎｄａ
ｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇＳＭＡＲＴｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｌｉｂｒａｒｙｈａｄａｈｉｇｈｔｉｔｅｒｏｆ１０６ｃｆｕ／ｍＬ，
ｉｎｗｈｉｃｈ９８％ｏｆｔｈｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｄｔｈｅｉｎｓｅｒｔｃＤＮＡｓｗｅｒｅｆｒｏｍ０．５ｋｂｔｏ３．０ｋｂ．Ｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｌｉｂｒａｒｙｈａｄａｔｉｔｅｒｏｆ１０１１ｃｆｕ／ｍＬ．ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｉｇｎａｌｓｏｆＴＣａｎｄγＴＭＴｇｅｎｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲｏｆｔｈｅａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｌｉｂｒａｒｙ．Ｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｂｙ３０７ｏｆｔｈｅｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓ．ＩｎｔｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ，１１７ｃｌｏｎｅｓ
ｗｅｒｅｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ａｎｄＢＬＡＳＴｌｅｄｔｏｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｐｕｔａｔｉｖｅｇｅｎｅｓ（ｅ．ｇ．ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＲＮａｓｅＳｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１Ａ，
ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｐｓｂＡｇｅｎｅｆｏｒＤ１ｐｒｏｔｅｉｎ）．ＴｈｉｓｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｐｒｏｖｉｄｅｓａｕｓｅｆｕｌｔｏｏｌｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ
ｏｆｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｖｉｔａｍｉｎＥａｎｄｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊；ｌｅａｆ；ｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ；ＥＳＴ
１７第１８卷第１期 草业学报２００９年