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过氧乙酸离析法观测蓝靛果忍冬叶片脉序的方法研究



全 文 :黑龙江农业科学2016(3):80~83
Heilongjiang Agricultural Sciences
过氧乙酸离析法观测蓝靛果忍冬叶片脉序
的方法研究
徐清华1,吴旭飞1,БРЫКСИНД.М.2,张雪霞1,李富恒
(1.东北农业大学 生命科学学院,黑龙江 哈尔滨150030;2.俄罗斯米丘林园艺研究所,坦波夫
州米丘林斯克市393774)
摘要:过氧乙酸离析法主要用于植物叶片表皮的观测,也可用于叶片脉序的观测,操作简单实用。为获得适
于蓝靛果忍冬叶片脉序观测的最佳组合,以蓝靛果忍冬叶片为材料,采用单因素试验和正交试验对过氧乙酸
浓度、水浴温度、水浴时间的处理条件进行了系统的研究。结果表明:在70℃水浴中用12%的过氧乙酸处理
蓝靛果忍冬叶片3.5h或用14%的过氧乙酸溶液在60℃水浴中处理3.5h,得到的装片脉序观测效果最佳。
关键词:蓝靛果忍冬;叶片;过氧乙酸离析法;脉序;正交试验
中图分类号:S663.9 文献标识码:A 文章编号:1002-2767(2016)03-0080-04 DOI:10.11942/j.issn1002-2767.2016.03.0080
收稿日期:2015-12-16
基金项目:黑龙江省教育厅资助项目(12531013)
第一作者简介:徐清华(1989-),女,山东省菏泽市人,在读硕
士,从事植物生理研究。E-mail:1272636460@qq.com。
通讯作者:李富恒(1962-),男,博士,教授,从事植物生理学
的教学和科研工作。E-mail:lifuheng1963@126.com。
  叶脉由贯穿在叶肉内的维管束或维管束及其
外围的机械组织组成,是叶内的输导组织和支持
结构。叶脉在叶片中呈有规律地分布,通过叶柄
与茎内的维管组织相连[1]。脉序是叶片中叶脉分
布的类型,是植物分类的重要依据[2]。脉序观测
方法主要以氢氧化钠离析法[3]、次氯酸钠离析
法[4]为主,过氧化氢-醋酸离析溶液也可用于植物
叶片脉序的制片[5],离析后获得的叶片材料柔韧
度好且观测效果清晰,既可用于临时观察,又可用
做成永久装片,但此方法在脉序观测方面的应用
研究较少。有关离析法用于叶片脉序观测的研究
多是针对双子叶草本植物的[6-7],而以双子叶木本
植物蓝靛果忍冬为材料的研究却鲜有报道。每一
种方法随着植物种类的不同处理条件有较大差
异[8-9]。过氧乙酸是一个混合物,含有乙酸及过氧
化氢等物质,能够使叶肉细胞的胞间层溶解,使叶
肉细胞分离,还具有漂白作用,故可用于植物叶片
脉序的观测。本文以蓝靛果忍冬叶片为材料,采
用单因素和正交试验设计对过氧乙酸离析法中的
各种条件进行了系统的研究,以期获得适合蓝靛
果忍冬叶片脉序观测的最佳方法,为科研和教学
工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为蓝靛果忍冬启明星(Зарница)品
种的成熟叶片,取自中国科学院东北地理与农业
生态研究所试验田。
1.2 方法
1.2.1 单因素试验设计 对可能影响过氧乙酸
离析法观测效果的过氧乙酸浓度、水浴温度及水
浴时间这3个因素先进行单因素试验,以初步筛
选出适宜范围。
各个单因素的水平设计:过氧乙酸浓度(%):
2、6、10、14;水浴温度(℃):20、40、60、80;水浴时
间(h):2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。
在进行处理蓝靛果叶片的某一单因素试验
时,其它各因素的水平取值固定为:过氧乙酸浓度
12%,水浴温度60℃,水浴时间3.5h。
1.2.2 正交试验设计 在单因素试验筛选出的
各个因素范围基础上,采用L9(34)正交表进行三
因素三水平的正交试验,根据试验结果筛选出最
优组合。
1.2.3 叶片脉序装片的制取 将蓝靛果忍冬叶
片剪切成约1cm×1cm的小块。按照单因素和
正交试验设计,将叶片小块放入装有过氧乙酸溶
液的试管中,置于水浴锅中加热处理一定时间。
用镊子将处理好的叶片从试管中取出,放在载玻
片上,蒸馏水冲洗3~5次后,对离析后的叶片染
色30min。用蒸馏水冲洗掉叶片上及其周围的
余液,滴加一点蒸馏水,盖上盖玻片,在显微镜下
08
3期   徐清华等:过氧乙酸离析法观测蓝靛果忍冬叶片脉序的方法研究
观察获取的脉序效果并进行显微摄影。
2 结果与分析
2.1 影响过氧乙酸离析法脉序观测效果的单因
素试验结果分析
2.1.1 过氧乙酸浓度 由表1可知,用10%和
14%的过氧乙酸溶液处理叶片,叶片柔韧性好,得
到的装片观测效果最好(图1-a);6%的过氧乙酸
浓度处理叶片柔韧性好,有少量叶肉细胞未被清
除干净,观测效果良好;2%的过氧乙酸浓度处理
叶片有大量叶肉细胞残留,严重影响观测效果。
表1 不同过氧乙酸浓度下的脉序观测效果
Table 1 Observations effect of different
concentration of the peroxyacetic acid
浓度/%Concentration  2  6  10  14
观测效果 Observations effect  D  B  A  A
  A:优;B:良;C:中;D:差。下同。
A:Excelent;B:Good;C:Average;D:Poor.The same
below.
2.1.2 水浴温度 由表2可知,在50℃和70℃
水浴温度条件下观测效果最好,叶片柔韧性好,观
测效果优(图1-b);当水浴温度为90℃时,观测效
果中等,叶片柔韧性差,容易破碎;水浴温度为
30℃的处理虽叶片柔韧性好,但叶片中有许多叶
肉细胞残留,在显微镜下不能清晰地观测各级脉
序,观测效果差。
2.1.3 水浴时间 由表3可知,当水浴时间为
3.5~4.5h时,叶片柔韧性较好,得到的装片观
测效果最好(图1-c);水浴处理叶片5h,在显微镜
下观测效果良好,但叶片柔韧性差,不利于操作;
水浴处理叶片3h,叶片柔韧性好,但有少量叶肉
细胞残留,观测效果中等;水浴处理叶片2.5h,叶
片柔韧性较好,但有大量叶肉细胞残留,观测效
果差。
表2 不同过氧乙酸水浴温度下的脉序观测效果
Table 2 Observations effect of different
water-bath temperature of the peroxyacetic acid
水浴温度/℃
Water-bath temperature
30  50  70  90
观测效果
Observations effect
D  A  A  C
表3 不同过氧乙酸水浴处理时间下的
脉序观测效果
Table 3 Observations effect of different
water-bath time of the peroxyacetic acid
水浴时间/h
Water-bath time
2.5  3.0  3.5  4.0  4.5  5.0
观测效果
Observations effect
D  C  A  A  A  B
  综合以上单因素试验结果,初步得出各个因
素的适宜取值范围为过氧乙酸浓度10%~14%、
水浴温度50~70℃、水浴时间3.5~4.5h。
2.2 优化蓝靛果忍冬叶片脉序观测条件的正交
试验
  在单因素试验结果的基础上,确定各因素的
大致适用范围,采用L9(34)正交表进行三因素三
水平的正交试验,进一步优化筛选出最佳的处理
组合,结果见表4。
表4 蓝靛果忍冬叶片观测条件正交试验结果
Table 4 The result for observing Lonicera caerulealeafs condition of the orthogonal experiment
处理
Treatments
水浴温度/℃
Water-bath temperature
过氧乙酸浓度/%
Concentration of the peroxyacetic acid
水浴时间/h
Water-bath time
观测效果
Observations effect
1  50  10  3.5 D
2  50  12  4.0 B
3  50  14  4.5 C
4  60  10  4.0 B
5  60  12  4.5 C
6  60  14  3.5 A
7  70  10  4.5 B
8  70  12  3.5 A
9  70  14  4.0 C
  由表4可知,在正交试验中,处理组合6(图
1-d)和组合8(图1-e)观测效果最好,且柔韧性
好;组合2、4和7观测效果良好但柔韧性稍差;组
合3、5和9观测效果中等,但柔韧性较差,在操作
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     黑 龙 江 农 业 科 学 3期
中易碎;组合1叶片有微量叶肉细胞残留,观测效 果差。
a~c为单因素试验结果图:其中a为10%过氧乙酸溶液处理叶片获取的脉序图;b为50℃水浴处理叶片获取的脉序图;c为水浴处
理叶片4h后获取的脉序图。d~e为正交试验结果:其中d为处理组合6获取的脉序图;e为处理组合8获取的脉序图。
a~c are the result map of single factor experiment:a is the venation graph of leaf under the treatment of 10%peracetic acid aerosol;
b is the venation graph of leaf in 5℃ water-curing condition;c is the venation graph of leaf in 4hwater-curing condition.d~e are
the orthogonal test results:d is the venation graph of the sixth treatment combination;e is the venation graph of the eighth treat-
ment combination.
图1 过氧乙酸离析法观测蓝靛果忍冬脉序的效果,100×
Fig.1 The observation effects of the Lonicera caerulea nervation treated by peroxyacetic acid maceration
a为氢氧化钠离析法处理叶片获取的脉序图;b为次氯酸钠离析法处理叶片获取的脉序图;c为改良后的次氯酸钠离析法处理叶片
获取的脉序图;d为过氧乙酸离析法处理叶片获取的脉序图。
a is the venation graph of leaf treated with the sodium hydroxide segregation method;b is the venation graph of leaf treated with the
sodium hypochlorite segregation method;c is the venation graph of leaf treated with the modified sodium hypochlorite segregation
method;d is the venation graph of leaf treated with the peracetic acid segregation method.
图2 蓝靛果忍冬叶片脉序不同制片方法的效果,100×
Fig.2 The mounting effect of nervation fromLonicera caerulea by using different methods
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3期   徐清华等:过氧乙酸离析法观测蓝靛果忍冬叶片脉序的方法研究
  由图1可以观察到,蓝靛果忍冬叶片具有网
状脉序,根据叶脉的粗细和发育的先后顺序可把
叶脉分为5级,相应的由各级叶脉形成的脉岛也
可以分为5级,整个叶片是由各级叶脉围成的各
级脉岛构成的。中脉只有一个,它将叶片分为左
右两部分,所以一级脉岛只有两个。二级叶脉的
数量也不多,二级脉岛的数量比二级叶脉的数量
多两个。利用各级脉岛面积的测量数据,可以计
算三、四、五级叶脉和脉岛的数量。前三级叶脉长
和脉岛面积可以直接在新鲜叶片上测量;四、五级
叶脉长和脉岛面积要先把叶片脱色,再在显微镜
下测量。对双子叶植物叶片网状叶脉各级叶脉和
脉岛量化研究有利于揭示双子叶植物网状脉和叶
片形成的机理。
3 结论与讨论
离析类方法主要原理是是利用化学试剂将叶
片叶肉细胞的胞间层溶解,使叶肉细胞分离,达到
表皮与叶肉分离的目的。离析方法有多种,如次
氯酸钠法、过氧化氢-醋酸法、铬酸-硝酸法、碳酸
钠法、氢氧化钠法等,主要用于叶片表皮及气孔的
观测,其中应用较多的是次氯酸钠法[4,10],目前观
测脉序应用较多的也是此法,但多需要与其它试
剂配合使用才能获得理想的制片效果。过氧化
氢-醋酸法常用来离析木质材料,在叶片表皮的观
测中仅见少数学者使用[11-12];孙同兴[5]等对此方
法进行了简单探究,发现过氧化氢-醋酸法作用比
较温和,离析时间和温度易于控制,更为重要的是
离析过程不会破坏所要观察的表皮结构;在过去
研究工作的基础上,将此方法用于脉序的观测也
可获得理想的装片。
叶片脉序的制片方法很多,本文对不同制片
方法的效果进行了比较,结果表明,氢氧化钠离析
法(图2-a)及次氯酸酸钠离析法(图2-b)制片的
观测效果较差;改良后的次氯酸离析法(氢氧化钠
和次氯酸钠两种试剂同时使用)可获得柔韧性较
好且观测清晰度较高的装片(图2-c),但此法操作
复杂,不同种类植物要求的离析条件不尽相同,影
响因素较多,离析时间和温度不易于控制,工作量
较大;过氧乙酸离析法只需要一种试剂,影响因素
较少,操作简单,其制片效果与改良后的次氯酸钠
离析法效果类似(图2-d),可以用于脉序的定性
和定量观测。
本试验通过单因素和正交试验对过氧乙酸法
观测蓝靛果忍冬叶片脉序的制片条件进行了较深
入的研究,得到了适于脉序观测的最佳处理条件。
这一处理条件对与蓝靛果忍冬叶片差别不大的其
它双子叶木本植物叶片脉序观测有一定的借鉴作
用,而对于与蓝靛果忍冬叶片差别较大的单子叶
草本植物叶片脉序的观测,则需要对离析条件重
新进行摸索和调整。本研究得出过氧乙酸离析法
观测蓝靛果忍冬叶片脉序的最佳处理条件为:用
12%过氧乙酸溶液在 70℃ 水浴中处理叶片
3.5h,或用14%的过氧乙酸溶液在60℃水浴中
处理叶片3.5h。
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Research of L-citruline Content Determination
and Extractive Technique in Watermelon Rind
LAN Jing-jing1,WU Wei-jie2,WANG Jian-zhong2
(1.Guangxi University of Chinese Medicine,NanNing,Guangxi 530001;2.Colege of Biologi-
cal Science and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083)
Abstract:In order to better use of watermelon resource and extracte the effective components in watermelon
rind,the extraction method of L-citruline was explored by controling the process parameters and conditions.
The type HD-8cation exchange resin was used to isolate L-citruline from watermelon rind and then the eluent
was decolorized by the type HZ-820resin.The results showed that the typeHD-8cation exchange resin was
high-efficiency with the largest exchange capacity of 23.125mg L-citruline per gram resin.The elution rate
reached 89.6% when the typeHD-8resin loading L-citruline was eluted by 0.25mol·L-1 NH4OH for 20min
which was 3.5times higher than using NaOH at the same concentration as eluent.Type HZ-820adsorbent res-
in had optimal decolorizing efficiency compared with type HZ-803and type D303.
Keywords:watermelon rind;L-citruline;cation exchange resin
(上接第83页)
Observation on the Characteristics of Lonicera caerulea
Leaf by Segregation Method of Peroxyacetic Acid
XU Qing-hua1,WU Xu-fei 1,БРЫКСИНД.М.2,ZHANG Xue-xia1,LI Fu-heng1
(1.Colege of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030;
2.The I.V.Michurin Al-Russia Research Institute of Horticulture,Michurinsk,Tambov
393774)
Abstract:Segregation method of Peroxyacetic acid was used to observe the epidermis of plant leaves and used
for observing leaf nervation,it was a simple and practica method.Taking Lonicera caerulea L.var.edulis
Turcz.ex Herd.f.edulis as material,single factor experiment and orthogonal experiment were designed for the
treatment conditions of Peracetic acid concentration,water-bath temperature and water-bath time.Observing
leaf nervation was used in order to obtain the optimal reaction condition.The results of orthogonal test showed
that the best condition of observation effect was 12%peroxyacetic acid treatment by 3.5hwater bath(70℃)or
14%peroxyacetic acid treatment by 3.5hwater bath(60℃)for fresh leaves.
Keywords:Lonicera caerulea;leaves;segregation method of peroxyacetic acid;venation;orthogonal design
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