全 文 ：书豌豆属种质资源遗传多样性的犐犛犛犚分析
曾亮１，李敏权１，２，杨晓明２
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省农业科学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：用ＩＳＳＲ标记技术对来自国内外的７３份豌豆材料进行遗传多样性分析，结果表明，１００个ＩＳＳＲ引物中共筛选
出１１个多态性明显、条带清晰、反应稳定的引物，７３份材料ＤＮＡ共扩增出９１条条带，其中７８条为多态性条带，平
均每个引物扩增的条带数为８．２条，多态性比率为８６．４％。Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数平均为０．４２０２，每个位点的有效
等位基因数为１．４５１８，品种间遗传相似系数变幅为０．４０６５～０．９３４０，表现出丰富的遗传多样性。利用 ＵＰＧＭＡ
聚类分析，以遗传相似系数０．５２为界限，７３份材料划分为５类，聚类基本符合地理来源相近的材料聚为一类，呈现
出一定的地域性分布规律。
关键词：豌豆；ＩＳＳＲ标记；遗传多样性；聚类分析
中图分类号：Ｑ９４３；Ｓ５４０．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０３０１２５０７
　　豌豆属（犘犻狊狌犿）是豆科蚕豆族的一年或越年生草本植物，是粮菜饲兼用作物，喜冷冻湿润气候，幼苗能耐５℃
低温，生长期适温１２～１６℃，结荚期适温１５～２０℃，具有耐寒、耐旱、耐瘠等特点，因其适应性很强，在全世界的地
理分布很广［１］。中国是世界第二大豌豆主产国，广阔的地理分布范围和多样化的生境造就了丰富的豌豆种质资
源，形成了豌豆的遗传多样性［２］。分析豌豆的遗传结构和遗传多样性，不仅有利于豌豆种质资源的合理保存、优
异豌豆种质资源的挖掘与创新，而且对豌豆生产和育种也具有重要的指导意义。
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ）是一种建立在ＰＣＲ反应基础上的ＤＮＡ分子标记技术，由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ
等［３］于１９９４年创建。该技术克服了ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔ）、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）、ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等
标记技术的一些局限性，具有无需预知基因组背景信息、ＤＮＡ样品用量少、信息量大、操作简单、重复性好等优
点，现已被广泛应用于植物的品种鉴定、基因定位、遗传作图、进化和系统发育等方面的研究［４，５］。
对于豌豆属种质资源遗传多样性的研究，以往主要是通过形态性状和细胞学特征、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ技术
等进行分析，如宗绪晓等［６］利用ＳＳＲ标记分析了国内豌豆地方品种的遗传多样性，２１对ＳＳＲ引物共扩增出１０４
个等位变异，有效等位变异为６２．５２％；Ｈｏｅｙ等［７］利用同工酶和ＲＡＰＤ标记方法研究发现野生型和栽培型豌豆
品种间有明显差别；Ｓａｍｅｃ和Ｎａｓｉｎｅｃ［８］及Ｓｉｍｉｏｎｉｕｃ等［９］利用ＲＡＰＤ和ＡＦＬＰ标记发现草料豌豆和粒用饲料豌
豆有明显差异。但是侧重于豌豆属植物ＩＳＳＲ分子标记的研究尚罕见报道。本研究应用ＩＳＳＲ标记技术，从
ＤＮＡ水平上探讨了来自国内外的７３份豌豆品种种质资源的遗传多样性与亲缘关系，为有效利用ＤＮＡ标记评
价豌豆种质资源亲缘关系，保护和合理利用种质资源以及加快新品种选育提供科学依据。
１　材料与方法
１．１　供试材料
７３份豌豆材料为甘肃省农业科学院作物研究所多年来从全国各地引进和选育品种（表１），于２０１１年３月种
植于甘肃省农业科学院秦王川试验基地。该试验地位于甘肃省兰州市永登县秦川镇，属温带大陆性季风气候，平
均海拔２１００ｍ，年降水量２５０～３００ｍｍ。于５月采摘豌豆新鲜幼嫩叶，放入冰盒，带回实验室置于－８０℃超低
温冰箱保存以备ＤＮＡ提取。
第２１卷　第３期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１２５－１３１
２０１２年６月
收稿日期：２０１２０１０５；改回日期：２０１２０２２７
基金项目：现代农业食用豆产业技术体系专项（ＣＡＲＳ０９）和国家自然科学基金（３１１６０３０４）资助。
作者简介：曾亮 （１９８３），男，甘肃兰州人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｓｔｅｖｅ１３１４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｍｑ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
表１　供试材料
犜犪犫犾犲１　犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犿犪狋犲狉犻犪犾狊
序号Ｎｏ． 品种名称Ｖａｒｉｅｔｙ 来源地Ｏｒｉｇｉｎ 序号Ｎｏ． 品种名称Ｖａｒｉｅｔｙ 来源地Ｏｒｉｇｉｎ
１ 新西兰红花６０３Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄｓａｆｆｌｏｗｅｒ６０３ 新西兰 Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄ ３８ 定豌５号ＤｉｎｇｗａｎＮｏ．５ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２ Ｌ１４１７ 云南Ｙｕｎｎａｎ ３９ 定豌６号ＤｉｎｇｗａｎＮｏ．６ 甘肃Ｇａｎｓｕ
３ 食荚大菜豌Ｆｏｏｄｐｏｄｄａｃａｉｐｅａ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ ４０ ＤＨＮ７ 甘肃Ｇａｎｓｕ
４ 食荚甜脆豌Ｆｏｏｄｐｏｄｔｉａｎｃｕｉｐｅａ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ ４１ ＤＨＮ１７ 甘肃Ｇａｎｓｕ
５ 无须豆尖１号 ＷｕｘｕｐｅａＮｏ．１ 河北 Ｈｅｂｅｉ ４２ ＣＶ２０１０ 甘肃Ｇａｎｓｕ
６ Ｓ３０１２３ 甘肃Ｇａｎｓｕ ４３ 甜脆豆Ｔｉａｎｃｕｉｐｅａ 福建Ｆｕｊｉａｎ
７ 奇珍７６Ｑｉｚｈｅｎ７６ 江苏Ｊｉａｎｇｓｕ ４４ 定豌１号ＤｉｎｇｗａｎＮｏ．１ 甘肃Ｇａｎｓｕ
８ 前进１号ＱｉａｎｊｉｎＮｏ．１ 河北 Ｈｅｂｅｉ ４５ 定豌２号ＤｉｎｇｗａｎＮｏ．２ 甘肃Ｇａｎｓｕ
９ 荷兰白花６０４Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓｗｈｉｔｅｆｌｏｗｅｒ６０４ 荷兰Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ４６ 定豌３号ＤｉｎｇｗａｎＮｏ．３ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１０ 定褐Ｄｉｎｇｈｅ 甘肃Ｇａｎｓｕ ４７ ＤＨＮ５７ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１１ 灰豆 Ｈｕｉｄｏｕ 甘肃Ｇａｎｓｕ ４８ Ｓ１００６ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１２ Ａｆｉｌａ 加拿大Ｃａｎａｄａ ４９ ＤＨＮ５８ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１３ Ｈａｆｉｌａ 加拿大Ｃａｎａｄａ ５０ 定豌４号ＤｉｎｇｗａｎＮｏ．４ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１４ 针定Ｚｈｅｎｄｉｎｇ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５１ 珍珠绿Ｐｅａｒｌｇｒｅｅｎ 台湾Ｔａｉｗａｎ
１５ 武威珍珠绿 Ｗｕｗｅｉｐｅａｒｌｇｒｅｅｎ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５２ 针叶１Ｚｈｅｎｙｅ１ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１６ 古浪麻豌豆Ｇｕｌａｎｇｇｒｅｙｐｅａ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５３ Ｌ０３１３ 云南Ｙｕｎｎａｎ
１７ Ｘ９００２ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５４ 苏豌１号ＳｕｗａｎＮｏ．１ 江苏Ｊｉａｎｇｓｕ
１８ 台湾小白花Ｔａｉｗａｎｓｍａｌｗｈｉｔｅｆｌｏｗｅｒ 江苏Ｊｉａｎｇｓｕ ５５ 苏豌３号ＳｕｗａｎＮｏ．３ 江苏Ｊｉａｎｇｓｕ
１９ Ｙ９Ｐ８ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５６ ＣＳ５００４ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２０ 超级甜脆豆Ｓｕｐｅｒｔｉａｎｃｕｉｐｅａ 河北 Ｈｅｂｅｉ ５７ Ｓ４００８ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２１ Ｓ３００８ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５８ Ｓｎ２０１ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２２ Ｓ５００８ 甘肃Ｇａｎｓｕ ５９ 北京５号ＢｅｉｊｉｎｇＮｏ．５ 北京Ｂｅｉｊｉｎｇ
２３ 青１９９１Ｑｉｎｇ１９９１ 青海Ｑｉｎｇｈａｉ ６０ 中豌４号ＺｈｏｎｇｗａｎＮｏ．４ 北京Ｂｅｉｊｉｎｇ
２４ Ｇｒａｆ 加拿大Ｃａｎａｄａ ６１ ＲＷ０８ 河北 Ｈｅｂｅｉ
２５ ＣＧＷ２００９ 甘肃Ｇａｎｓｕ ６２ ＣＳ１００１ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２６ 德豌Ｄｅｗａｎ 加拿大Ｃａｎａｄａ ６３ Ｓ８００６ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２７ 草原２７６Ｃａｏｙｕａｎ２７６ 青海Ｑｉｎｇｈａｉ ６４ 古１号ＧｕＮｏ．１ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２８ 成豌１号ＣｈｅｎｇｗａｎＮｏ．１ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ ６５ 古３号ＧｕＮｏ．３ 甘肃Ｇａｎｓｕ
２９ 成豌８号ＣｈｅｎｇｗａｎＮｏ．８ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ ６６ 古４号ＧｕＮｏ．４ 甘肃Ｇａｎｓｕ
３０ Ｈａｆ 加拿大Ｃａｎａｄａ ６７ 古５号ＧｕＮｏ．５ 甘肃Ｇａｎｓｕ
３１ Ｒｗ０９ 河北 Ｈｅｂｅｉ ６８ 古１１号ＧｕＮｏ．１１ 甘肃Ｇａｎｓｕ
３２ Ｄａｆ１ 甘肃Ｇａｎｓｕ ６９ 新西兰３号ＮｅｗｚｅａｌａｎｄＮｏ．３ 新西兰Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄ
３３ 陇豌１号ＬｏｎｇｗａｎＮｏ．１ 甘肃Ｇａｎｓｕ ７０ 新西兰双花１０１ 新西兰Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄ
３４ ＣＳ２００１ 甘肃Ｇａｎｓｕ Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄｄｏｕｂｌｅｆｌｏｗｅｒ１０１
３５ ＣＳ５００８ 甘肃Ｇａｎｓｕ ７１ 须菜１号ＸｕｃａｉＮｏ．１ 河北 Ｈｅｂｅｉ
３６ 古杂２号ＧｕｚａＮｏ．２ 甘肃Ｇａｎｓｕ ７２ ＣＳ６００３ 甘肃Ｇａｎｓｕ
３７ 成功３０Ｃｈｅｎｇｇｏｎｇ３０ 福建Ｆｕｊｉａｎ ７３ 针高纯Ｚｈｅｎｇａｏｃｈｕｎ 甘肃Ｇａｎｓｕ
１．２　ＤＮＡ提取和定量
每份材料取１０～１５个植株上的新鲜叶片，ＤＮＡ提取采用改进ＣＴＡＢ法［１０］；用０．８％的琼脂糖电泳检测
ＤＮＡ质量；将所得的ＤＮＡ提取液于紫外可见分光光度计上测定波长２６０和２８０ｎｍ处的吸光度ＯＤ２６０和ＯＤ２８０，
６２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３
计算ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的值以检测ＤＮＡ样品纯度，检测比值为１．８～１．９；用０．１倍ＴＥ将ＤＮＡ稀释至１０ｎｇ／μＬ，置
于－２０℃冰箱保存备用。
１．３　ＩＳＳＲ引物
选用加拿大哥伦比亚大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｎｂｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＢＣ）公布的１００对ＩＳＳＲ引物
（ＵＢＣ８０１ＵＢＣ９００），由上海生工生物技术公司合成。
１．４　ＰＣＲ扩增及检测
利用优化的ＰＣＲ反应体系从１００条ＩＳＳＲ引物中筛选出１１条对全部ＤＮＡ样品均有清晰、稳定扩增产物且
条带清晰、重复性好的引物进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增，每条引物３次重复。２０μＬ反应体系中各反应物含量为：１５
ｎｇ模板ＤＮＡ，０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，０．５μｍｏｌ／ＬＩＳＳＲ引物，１ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶，２μＬ１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ。ＰＣＲ
扩增程序为：９４℃充分变性３ｍｉｎ，然后进行以下３４个循环：９４℃变性３０ｓ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，最后于
７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃终止反应保存。
扩增产物在２％（Ｗ／Ｖ）的琼脂糖凝胶（含ＥＢ０．５μｇ／ｍＬ）、１×ＴＡＥ缓冲液中电泳分离（５Ｖ／ｃｍ），用２０００
ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ作分子量标准，在紫外凝胶成像系统下拍照记录。
１．５　数据处理与分析
同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，选择清晰的谱带进行统计，扩增产物在相同迁移
位置有带赋值为１，无带赋值为０，建立原始数据矩阵。利用Ｐｏｐｇｅｎ３２软件计算ＩＳＳＲ扩增引物的Ｓｈａｎｎｏｎ多样
性信息指数，多态位点数，多态位点比率和有效等位基因数。采用ＮＴＳＹＳＰＣ２．１软件的ＳＡＨＮ程序和ＧＳ值
按非加权配对算术平均法（ＵＰＧＭＡ）计算各豌豆品种间的相似系数并进行聚类分析构建聚类图。
２　结果与分析
２．１　引物筛选
从１００条ＩＳＳＲ引物中筛选出１１条多态性丰富、
条带清晰且重复性较好的引物，用于供试７３个豌豆材
料的ＰＣＲ扩增。并根据各引物的特性和具体的扩增
反应对照，确定了各引物的最佳退火温度（表２）。
２．２　ＩＳＳＲ扩增结果及多态性分析
１１条引物对７３份豌豆材料共扩增出９１条带，大
小为２００～２０００ｂｐ（图１），其中多态性条带为７８条，
平均多态性比率达到８６．４％。每个引物可扩增出２～
１２条多态性条带，平均产生７条多态性谱带。其中引
物ＵＢＣ８１８、８２５、８３６、８４０的多态性信息含量达到了
１００％。这１１条引物全部是二核苷酸重复序列类型的
引物，其中（ＧＡ）ｎ 有３条，（ＣＡ）ｎ 有１条，（ＡＣ）ｎ 有４
条，（ＡＧ）ｎ有２条，（ＣＴ）ｎ有１条，说明豌豆属基因组
中存在大量的（ＧＡ）、（ＡＣ）、（ＡＧ）等二核苷酸重复序
表２　犐犛犛犚分析的引物序列
犜犪犫犾犲２　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犐犛犛犚犪狀犪犾狔狊犻狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｌｉｓｔ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｅｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
ＵＢＣ８１２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡ ５０
ＵＢＣ８１８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧ ５０
ＵＢＣ８２５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ ５０
ＵＢＣ８３４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ ５０
ＵＢＣ８３６ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＡ ５０
ＵＢＣ８４０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＴ ５０
ＵＢＣ８４２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＧ ５０
ＵＢＣ８４５ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＲＧ ５０
ＵＢＣ８５５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＴ ５２
ＵＢＣ８５６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＡ ５２
ＵＢＣ８５７ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＧ ５２
列。Ｓｈａｎｎｏｎ多样性信息指数评价样品遗传多样性的结果表明，平均多样性指数（犐）为０．４２０２，每个位点的有效
等位基因数（犖犲）为１．４５１８（表３），表明豌豆材料间具有较高的多态性，遗传多样性较丰富。
２．３　豌豆品种间遗传相似性与差异性分析
根据扩增产物的电泳结果，通过ＮＴＳＹＳＰＣ２．１软件对７３份豌豆材料的遗传相似系数（ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）
和遗传距离（ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ）进行计算，结果表明，７３份豌豆材料间的遗传相似系数为０．４０６５～０．９３４０，遗传
距离变幅范围为０．０５９２～０．９８７４ｃｍ。其中，Ｌ１４１７和德豌之间的遗传相似系数最小（０．４０６５），遗传距离最大
（０．９８７４ｃｍ），说明供试材料间二者亲缘关系最远；武威珍珠绿和珍珠绿之间的遗传相似系数最大（０．９３４０），遗
７２１第２１卷第３期 草业学报２０１２年
传距离最小（０．０５９２ｃｍ），说明供试材料间二者亲缘关系最近。在７３份豌豆材料中来自于相同或相近地理位置
的材料间遗传相似系数值较大，亲缘关系较近，而地理位置或生境相差较大的材料遗传距离值较大，亲缘关系较
远。整体看来，豌豆种质资源间的遗传基础相对较宽，存在较大的遗传变异性。
表３　７３份豌豆材料犐犛犛犚标记扩增结果
犜犪犫犾犲３　犜犺犲狉犲狊狌犾狋狅犳犐犛犛犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳７３狆犲犪
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
扩增条带
Ｂａｎｄｎｕｍｂｅｒ
多态性条带
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄ
ｎｕｍｂｅｒ
条带大小
Ｂａｎｄｓｉｚｅ
（ｂｐ）
多态性比率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄ（％）
Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数
Ｓｈａｎｎｏｎｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｉｎｄｅｘ（犐）
有效等位基因数
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｏｆ
ａｌｅｌｅｓ（犖犲）
ＵＢＣ８１２ １２ １０ ２００～１５００ ８３．３ ０．３８５６ １．３５９８
ＵＢＣ８１８ １２ １２ ２００～２０００ １００．０ ０．２２７９ １．４０５２
ＵＢＣ８２５ ６ ６ ２５０～１０００ １００．０ ０．５３３１ １．４９３６
ＵＢＣ８３４ ９ ７ ２５０～１５００ ７７．８ ０．４５８４ １．３２６３
ＵＢＣ８３６ ７ ７ ２５０～１０００ １００．０ ０．５１０４ １．５５２７
ＵＢＣ８４０ ２ ２ ２５０～７５０ １００．０ ０．４１１９ １．４８５２
ＵＢＣ８４２ １２ １０ ２００～１５００ ８３．３ ０．２８３７ １．３６０６
ＵＢＣ８４５ ９ ７ ２５０～１０００ ７７．８ ０．６４３７ １．５７７９
ＵＢＣ８５５ ６ ４ ２５０～１０００ ６６．７ ０．３９２８ １．４４７６
ＵＢＣ８５６ １１ ９ ２００～１５００ ８１．８ ０．３４３１ １．５８９８
ＵＢＣ８５７ ５ ４ ２５０～１０００ ８０．０ ０．４３１６ １．３７１１
总数 Ｔｏｔａｌ ９１ ７８ ２００～２０００
平均 Ａｖｅｒａｇｅ ８．２ ７ ８６．４ ０．４２０２ １．４５１８
图１　引物犝犅犆８４２对部分豌豆材料基因组犇犖犃的犘犆犚扩增结果
犉犻犵．１　犚犲狊狌犾狋狅犳犘犆犚犪犿狆犾犻犮犪狋犻狅狀狌狊犻狀犵狆狉犻犿犲狉犝犅犆８４２狅犳狆犲犪
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ标记，材料编号同表１。Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ，ｍａｔｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｗａｓｓｈｏｗｅｄｉｎｔａｂｌｅ１．
８２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３
２．４　豌豆品种间的ＩＳＳＲ聚类分析
利用ＵＰＧＭＡ法对７３份豌豆材料进行ＵＰＧＭＡ聚类分析，绘出树状聚类图（图２）。在ＧＳ≈０．５２处，可以
把７３份豌豆品种划分为５类：第１类共８份材料，其中包括来自新西兰的３份材料和国内的５份材料；第２类共
１３份材料，主要是来自加拿大等地的６份国外材料和７份国内材料；第３类包含的种质资源最多，共３７份材料，
其中绝大部分是来自我国西北和华北的豌豆种质资源；１７号（Ｘ９００２）与其余材料差异明显，单独聚为１类（第４
类）；第５类的１４份材料包括１３份来自我国长江中下游及西南地区和１份来自荷兰的豌豆种质资源。从聚类结
果可以看出，材料地理来源对系统聚类结果影响较大，各来源地材料在聚类图中既有区别又有交叉，说明材料间
形态性状变异有一定的连续性。具有相同生长习性且地理来源相近的豌豆种质资源聚为一类，聚类结果与豌豆
地理来源、生长习性和生态分布密切关联。
图２　基于犐犛犛犚标记的７３份豌豆材料聚类图
犉犻犵．２　犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳犮犾狌狊狋犲狉犪狀犪犾狔狊犻狊犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚狅犳７３狆犲犪
９２１第２１卷第３期 草业学报２０１２年
３　讨论
本研究采用ＩＳＳＲ标记对来自国内外的豌豆属植物资源进行了综合分析，获得了较为满意的结果。由于ＩＳ
ＳＲ标记具有无需预知基因组背景信息、信息量丰富、操作简单、重复性好等诸多优点，因而已被广泛应用于植物
遗传多样性的研究中。胡盨等［１１］采用正交设计直观分析法对影响三角紫叶酢浆草（犗狓犪犾犻狊狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊）ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应较大的５个因素在５个水平上进行了优化，并由此建立了适合三角紫叶酢浆草的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体
系。冯亮亮等［１２］在对甘肃地区红砂（犚犲犪狌犿狌狉犻犪狊狅狅狀犵狅狉犻犮犪）遗传多样性的ＩＳＳＲ分析表明，１２条引物检测到６９
个位点，其中多态性位点６０个，多态位点比率达到８６．９６％，说明ＩＳＳＲ标记具有较高的多态性检测水平。李鸿
雁等［１３］应用ＩＳＳＲ分子标记对分布于内蒙古不同地区的扁蓿豆（犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪）进行了遗传多样性研究，结
果表明，１５个引物共扩增出３６３个位点，聚类结果显示，生态地理条件相似的种群优先聚类。王照兰等［１４］对扁蓿
豆４个不同品系的ＩＳＳＲ遗传多样性分析表明，７个有效引物共扩增出７３个位点，平均每条引物检测出１０．４个
位点，多态位点百分率达到９４．５％。耿立格等［１５］对河北省的绿子叶黑豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）种质资源的ＩＳＳＲ遗传
多样性分析表明，７个ＩＳＳＲ引物共检测出６０个等位变异，平均每个位点８．６个变异，变异幅度为５～１７个，聚类
结果显示，类群与品种来源地无关。卢萍等［１６］应用ＩＳＳＲ标记对小花棘豆（犗狓狔狋狉狅狆犻狊犵犾犪犫狉犪）的６个地理种群进
行的遗传多样性分析表明，１４个引物共扩增出３２７个位点，多态位点比率在７０％左右。从前人的研究结果可以
看出，ＩＳＳＲ分子标记技术是有效揭示品种遗传多样性的一种手段。
宗绪晓等［１７］对１０３份豌豆品种的ＳＳＲ标记遗传多样性分析的结果表明，平均每对引物可以扩增出４．９５个
等位变异，多态性比率为６５．５６％，ＵＰＧＭＡ聚类将供试豌豆聚成３类，生境和表型相近的种群基本聚为一类。
陈永霞等［１８］利用ＥＳＴ－ＳＳＲ标记对西南扁穗牛鞭草（犎犲犿犪狉狋犺狉犻犪犮狅犿狆狉犲狊狊犪）的遗传多样性分析表明，２３对引
物共扩增出３２３条带，多态性比率８０．４％，聚类分析显示，各供试材料间的聚类与其地理来源及形态特征具有一
定的相关性。王海飞等［１９］利用ＩＳＳＲ标记对５２７份蚕豆资源的遗传多样性分析表明，平均每对引物扩增条带数
为２５，多态性比率为９６％，聚类结果表明，生态地理条件相似的种群优先聚集。本研究通过ＩＳＳＲ标记对豌豆进
行遗传多样性分析表明，１１条ＩＳＳＲ引物共扩增出９１条条带，多态性比率为８６．４％，这与后者的研究结果较相
近，其引物扩增的条带数和多态性比率都高于用ＳＳＲ分析的结果，说明ＩＳＳＲ标记对豌豆种质资源遗传多样性的
分析更精确和可靠。聚类分析结果与前人研究结果相似，基本符合地理来源相近的居群聚为一类。
材料间遗传差异、遗传关系和遗传多样性评价对育种具有十分重要的意义［２０，２１］。应用分子标记技术研究遗
传关系时，引物数目和标记位点数会对结果产生影响，一般来说，所用引物数目越多、检测的位点数越多，所提供
的信息就越可靠。但在实际应用中，由于受到生物自身情况和时间、经费等条件的制约，可供分析利用的引物数
目和位点数都是有限的。有研究表明，所分析的位点数与所能提供信息的可靠性之间具有明显的关系，当位点数
超过７０个时，所提供的信息可靠性趋于稳定［２２］。本试验所筛选出的１１个ＩＳＳＲ引物对７３份豌豆材料共检测到
９１个位点，其中多态性位点７８个，因此能提供可靠的信息。
从７３份豌豆材料的聚类图可以看出在ＧＳ约为０．５２处将７３份材料聚为５类，聚类基本符合地理来源相近
的居群聚为一类。但也有地理来源不同的品种被归入一类，产生这种结果的原因可能有２个方面：１）地理来源相
同的材料虽然来自于同一环境，但是由于选择方向的不同和选用育种材料的错综复杂，也可能形成遗传差异较大
的类型，因此出现地理来源相同的品种被归入不同类群；２）受环境饰变作用的影响，物种在长期适应环境的过程
中会出现某些性状趋同的现象，造成不同物种性状间的交叉。
４　结论
通过ＩＳＳＲ标记技术对７３份豌豆材料的遗传多样性分析表明，１００个ＩＳＳＲ引物中共筛选出１１个多态性明
显、条带清晰、反应稳定的引物，多态性比率为８６．４％。Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数平均为０．４２０２，品种间遗传相似系
数变幅范围为０．４０６５～０．９３４０，表现出丰富的遗传多样性。利用ＵＰＧＭＡ聚类分析，将７３份材料划分为５类，
聚类结果呈一定的地域性分布规律。
０３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３
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犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿犵犲狉犿狆犾犪狊犿狉犲狊狅狌狉犮犲狊犫狔犐犛犛犚
ＺＥＮＧＬｉａｎｇ１，ＬＩＭｉｎｑｕａｎ１，２，ＹＡＮＧＸｉａｏｍｉｎｇ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＡｃａｄｅｍｙｏｆＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅ７３ｍａｔｅｒｉａｌｓｏｆ犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿ｆｒｏｍｂｏｔｈａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄｗｅｒｅａｎａ
ｌｙｚｅｄｂｙＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ．１１ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ１００ｐｒｉｍｅｒｓｗｈｉｃｈｈａｖｅｔｈｅｃｌｅａｒｌｙａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ，ａｔｏｔａｌｏｆ９１ｂａｎｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ７３ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ７８ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｂａｎｄｓ．Ｏｎａｖｅｒａｇｅ，ｅａｃｈ
ｐｒｉｍｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｔｅｆｏｒ８．２ａｎｄｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｗａｓ８６．４％．Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｄｅｘｗａｓ０．４２０２
ｉｎａｖｅｒａｇｅａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｌｅｌｅｓｗａｓ１．４５１８，ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ
０．４０６５ｔｏ０．９３４０ａｎｄｓｈｏｗｓｒｉｃｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＵｓｅｇｒｏｕｐｓｂｙＵＰＧＭＡｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｔｏｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ０．５２ｆｏｒｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ，７３ｍａｔｅｒｉａｌｓａｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｖｅｔｙｐｅｓ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｂａｓｉｃａｃｃｏｒｄｗｉｔｈ
ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｏｒｉｇｉｎｏｆｃｌｏｓｅｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒａｃｌａｓｓｔｏｇｅｔｈｅｒ，ｈａｓａｃｅｒｔａｉｎｒｅｇｉｏｎａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿；ＩＳＳＲｍａｒｋ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ
１３１第２１卷第３期 草业学报２０１２年