全 文 ：书玉米品种真实性和纯度鉴定的犛犛犚
标记多重犘犆犚体系优化
常宏１，３，王汉宁１，２，张金文１，２，王威１，路则权１，李瑛１，王蒂１，２
（１．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，
甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃省种子管理总站，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：为了建立稳定可靠的玉米真实性和纯度鉴定ＳＳＲ标记，对ＤＮＡ提取方法、ＳＳＲ引物和多重ＰＣＲ反应程序进
行了优化。结果表明，用预热到７５℃以上的研钵和９５℃的１．５×ＣＴＡＢ提取缓冲液进行材料研磨，可得到纯度高、
完整性好的ＤＮＡ，并且提取成本较低。利用软件ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０和Ｏｌｉｇｏ６．７２对玉米指纹鉴定的ＳＳＲ核心引
物进行重新分析与设计，建立了２１对ＳＳＲ通用引物构成的８组多重ＰＣＲ复合扩增体系和３步法扩增程序，均能
在统一的ＰＣＲ扩增条件下进行，扩增片段之间不存在交叉现象，扩增条带清晰，扩增结果稳定，这一扩增体系检测
效率比单对ＳＳＲ引物提高２．６倍以上。
关键词：玉米；真实性；纯度；ＤＮＡ提取；ＳＳＲ引物；多重ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ５１３．０１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０２０２０４０８
　 玉米（犣犲犪犿犪狔狊）杂种优势的利用不仅为世界粮食安全做出了巨大贡献，同时也造就了种子行业的兴起，并
推动了饲料工业和畜牧业的发展［１，２］。玉米育种研究和种子生产经营正在向商业化转移，越来越多的企业投资
玉米种子产业。由于玉米杂交种种子生产蕴涵着巨大的经济利润，市场上经常出现侵权或违规经营的行为，不论
育种者、经营者或使用者都越来越重视种子质量和保护自身的合法权益。因此，品种的真实性和纯度检验对玉米
品种保护和生产具有重要作用。
作物品种真实性和纯度鉴定方法多依据形态特征、生理特性、同工酶、种子贮藏蛋白电泳等，而玉米种子真实
性和纯度检验主要采用形态学鉴定和种子贮藏蛋白电泳分析的方法。利用形态学差异鉴别品种的方法费时费
力，需要性状差异达到一定的清晰程度才能得出准确结果。同工酶、蛋白质是基因表达的产物，不能完全显示品
种间的多态性［３］，特别是我国玉米种质基础渐趋狭窄，生产上使用的亲本自交系较为集中［４］，难以鉴定那些关系
密切的杂交种。从２０世纪８０年代发展起来的直接从ＤＮＡ水平上揭示多态性的分子标记，具有准确可靠、成本
较低、不受环境因素影响等特点，便于实现鉴定自动化、商业化，促进了种质资源鉴定的发展［５］。ＳＳＲ（简单序列
重复，ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ）标记以其多态性丰富、检测技术简单、结果可靠和重复性好等优点，已被广泛应用
于基因定位、种群进化及遗传多样性研究［５８］，并在玉米种子纯度和品种真实性鉴定中得到广泛应用［９１４］。近年
来，针对玉米品种真实性和种子纯度鉴定时ＳＳＲ标记存在的ＤＮＡ提取步骤复杂、玉米ＳＳＲ引物数量庞大（２
０００多）及单引物鉴定纯度存在一定误差的问题，开发了玉米单粒种子ＤＮＡ快速提取法［１５］、多重ＰＣＲ（聚合酶
链式反应，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术［１６］，并筛选出通用ＳＳＲ核心引物［１７］；王凤格等［１８］按照统一的标准设
计并构建基于毛细管五色荧光检测系统的多重ＰＣＲ复合扩增体系，提高了检测效率。本研究按照王凤格等［１８］
筛选的通用引物和检测体系，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，在玉米自交系和杂交种真实性和纯度鉴定中进
行了验证，发现单粒种子ＤＮＡ快速提取法虽然速度较快，但提取的玉米ＤＮＡ质量极差，严重影响到ＳＳＲ标记
时的ＰＣＲ扩增稳定性；通用引物间的Ｔｍ相差较大，多重ＰＣＲ扩增效果较差；采用较高的退火温度和二步法扩
增，扩增效率极低甚至常发生无扩增现象。针对上述问题，有必要对该技术体系做进一步优化，以提高其稳定性
２０４－２１１
２０１０年４月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第１９卷　第２期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
 收稿日期：２００９１１２２；改回日期：２００９１２２５
基金项目：国家高新技术研究发展计划（８６３计划）项目（２００４ＡＡ２０７１４０）资助。
作者简介：常宏（１９６９），男，甘肃庆阳人，研究员，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｌ５５８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｗｚｈａｎｇ３０５＠１６３．ｃｏｍ
和可靠性。
１　材料与方法
１．１　材料
试验于２００８年进行，供试材料包括目前国内主要玉米骨干自交系、甘肃省种业新育成自交系和杂交种共７７
份，其中甘肃金苹果种业有限责任公司３４份、甘肃甘鑫种业有限责任公司１８份、甘肃金穗种业有限责任公司１７
份、甘肃富农高科技种业有限责任公司４份和甘肃金象农业发展有限责任公司４份。
１．２　玉米基因组ＤＮＡ提取
试验选用如下３种玉米基因组ＤＮＡ提取方法：
方法Ⅰ，标准的ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵，ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）提取法［１９，２０］。取
２５℃、暗培养发芽４ｄ的幼苗０．３ｇ，用液Ｎ２ 研成粉末，转到１．５ｍＬ离心管中（－２０℃预冷），加入预热到９５℃的
５００μＬ１．５×ＣＴＡＢ提取缓冲液［１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１．５％
（Ｗ／Ｖ）ＣＴＡＢ，使用前加入０．１％ （Ｖ／Ｖ）的β巯基乙醇］；置于６５℃水浴３０ｍｉｎ，每５ｍｉｎ上下颠倒１次；室温
下，１０７９０ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；吸取上清液约６００μＬ于１支灭菌的１．５ｍＬ离心管中，加入等体积（６００μＬ）氯仿／
异戊醇（２４∶１），上下颠倒数次，混匀；４℃，１０７９０ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；取４５０μＬ上清液，转入新的１．５ｍＬ离心管
中，加入１ｍＬ９５％乙醇和４５μＬ１０ｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ，混匀，室温放置１０ｍｉｎ；１０７９０ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清；
用７５％ 乙醇浸洗沉淀２遍，自然干燥约３０ｍｉｎ；加入５０μＬＴＥ（含１ｍｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡ），待ＤＮＡ溶解后，置于
３７℃水浴保温３０ｍｉｎ，以降解ＲＮＡ。
方法Ⅱ，单粒种子ＤＮＡ快速提取热碱法［１５］。用镊子和刀片将单粒种子切开，取出胚放入９６孔深孔板中，每
孔加入１５０μＬ提取液（０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ，０．０１％溴酚蓝），盖上封口膜，沸水浴中加热５ｍｉｎ，然后加入１５０μＬ
ＴＥ缓冲液（ｐＨ２．０），置于４℃冰箱保存备用。
方法Ⅲ，改进的ＣＴＡＢ法。对标准的ＣＴＡＢ方法程序加以改进，材料不用液Ｎ２ 研磨，而用预热到７５℃的研
钵、取发芽４ｄ的幼苗０．３ｇ，加入３００μＬ预热到９５℃的１．５×ＣＴＡＢ提取缓冲液，迅速研成匀浆，然后转到１．５
ｍＬ离心管中，再加入３００μＬ预热到９５℃的１．５×ＣＴＡＢ提取缓冲液。此后操作与方法Ⅰ相同。
用紫外分光光度计，分别测定不同方法提取的玉米ＤＮＡ样品ＯＤ２３０、ＯＤ２６０和ＯＤ２８０，并用０．８％琼脂糖凝胶
电泳鉴定ＤＮＡ的完整性。
１．３　引物重新设计及多重ＰＣＲ扩增程序优化
为了降低退火温度（Ｔｍ）和变２步法扩增程序为３步法扩增程序，使多重ＰＣＲ具有相似的扩增条件、高效扩
增、扩增产物清晰稳定且大小在期望的范围内，对王凤格等［１８］筛选的８组２０对通用ＳＳＲ多重ＰＣＲ引物进行重
新分析和设计。首先在 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、ＭａｉｚｅＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ）及
ＰｌａｎｔＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ）等网站上，用ＢＬＡＳＴ程序搜索２０对引物位点对应的原始基因组序列，
再利用２个常用的引物设计软件ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０和Ｏｌｉｇｏ６．７２对引物重新进行设计及评估，并将同一多态
性位点新设计的引物重新命名。此外，针对第８组多重ＰＣＲ的ＳＳＲ－ＰＣＲ引物扩增产物少的情况，适当增加引
物以便反映出较多的多态性信息。
ＰＣＲ扩增反应在ＰＴＣ２００ＰＣＲ仪上进行。每２０μＬ反应体积中含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ，０．００１％ Ｇｅｌａｔｉｎ，１单位ＴａｑＤＮＡ聚合酶，２．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ４ｄＮＴＰ，１０％甘油，０．２５
μｍｏｌ／ＬＳＳＲ引物对，２０ｎｇＤＮＡ模板。反应液上加盖１５μＬ矿物油（Ｓｉｇｍａ），防止反应过程中水分蒸发。采用
２种ＰＣＲ扩增反应程序，原２０对８组多重ＰＣＲ引物仍采用６８～９４℃二步法扩增程序（９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃
变性４０ｓ，６８℃退火８０ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ），新设计引物采用３步法扩增程序。扩增产物用１％琼脂
糖凝胶电泳，比较二者在扩增带型和扩增效果方面的变化。
１．４　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用ＪＹＣＸ２Ｂ型测序电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司制造，规格３３ｃｍ×４２ｃｍ×０．０４ｃｍ）进行变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳。配制４．５％聚丙烯酰胺凝胶８０ｍＬ，其中含有４０％丙烯酰胺母液（丙烯酰胺∶甲叉双丙
５０２第１９卷第２期 草业学报２０１０年
烯酰胺＝１９∶１）９．０ｍＬ，１×ＴＢＥ缓冲液（１．０８％Ｔｒｉｓ，０．５５％硼酸，０．０５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｄｄＨ２Ｏ）８ｍＬ，
ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′四甲基二乙胺，Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）８０μＬ／ｍＬ，２５％过硫酸胺
（ＡＰＳ，２５％ｗ／ｖ）８０μＬ。在加入ＴＥＭＥＤ和ＡＰＳ（过硫酸胺，ａｍｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）后，立即灌胶，约３０ｍｉｎ后胶
凝固。安装电泳槽，向正极槽中加入１×ＴＢＥ缓冲液６００ｍＬ，负极槽加入预热至６５℃的１×ＴＢＥ缓冲液６００
ｍＬ；拔出梳子后，用９０Ｗ恒功率预电泳１０～２０ｍｉｎ；然后，各点样孔上样５μＬ变性后的ＰＣＲ产物［６×ＤＮＡ电
泳载样缓冲液：０．２５％ 溴粉蓝，４０％（ｗ／ｖ）蔗糖］，在８０Ｗ 恒功率下电泳１ｈ。电泳结束后，附着凝胶的玻璃板
依次在１０％冰乙酸中浸泡３ｍｉｎ，水中漂洗１次，０．２％ＡｇＮＯ３ 溶液中染色５ｍｉｎ，用蒸馏水快速漂洗１次，在浓
度为３％ＮａＯＨ（ｗ／ｖ）和３ｍＬ／Ｌ甲醛中轻轻晃动至带纹出现并可以区分为止；在１０％冰醋酸溶液中定影５ｍｉｎ，
水漂洗１ｍｉｎ。显影后，在室温下自然风干或５０℃烘箱快速烘干凝胶后，置于方正Ｚ１０００扫描仪（Ａ３幅面）上进
行图像扫描并统计数据。
２　结果与分析
２．１　提取ＤＮＡ的质量和扩增效果
不同提取方法得到的玉米基因组ＤＮＡ质量和数量存在一定的差异（表１），其中方法Ⅲ提取样品的 Ａ２６０／
Ａ２８０和Ａ２６０／Ａ２３０分别为１．７８５和２．０７１，与标准的ＤＮＡ提取方法Ⅰ质量无差异（犘＞０．０５），但产量略高；方法Ⅱ
提取样品的 Ａ２６０／Ａ２８０和 Ａ２６０／Ａ２８０为０．８２１和１．５３８，说明提取的 ＤＮＡ中蛋白质和盐离子含量较高，且提取
ＤＮＡ量较高，是方法Ⅰ和方法Ⅲ所提ＤＮＡ的２倍左右。
表１　３种方法提取的玉米犇犖犃样品的紫外检测结果
犜犪犫犾犲１　犜犺犲犝犞狋犲狊狋狉犲狊狌犾狋狊狅犳犿犪犻狕犲犇犖犃狊犪犿狆犾犲狊狑犻狋犺３犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊
提取方法Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 材料 Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａ２６０ Ａ２６０／Ａ２８０ Ａ２６０／Ａ２３０ ＤＮＡ浓度ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）
方法Ⅰ ＭｅｔｈｏｄⅠ 幼苗Ｓｅｅｄｌｉｎｇ ０．１８３±０．０７３ｂ １．８９３ａ ２．１６３ａ ９．１５ｂ
方法Ⅱ ＭｅｔｈｏｄⅡ 干种子胚Ｅｍｂｒｙｏｏｆｄｒｙｓｅｅｄ０．４４２±０．１６５ａ ０．８２１ｂ １．５３８ｂ ２２．１０ａ
方法Ⅲ ＭｅｔｈｏｄⅢ 幼苗Ｓｅｅｄｌｉｎｇ ０．２３１±０．０９８ｂ １．７８５ａ ２．０７１ａ １１．５５ｂ
　为３个提取样品测定的平均值±标准误（ＳＥ）。同列字母不同者表示差异显著（犘≤０．０５）。
　Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ±ｓｔａｎｄａｒｄｅｒｒｏｒｓ（ＳＥ）．Ｖａｌｕｅｓｉｎｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｆｏｌｏｗｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘≤
０．０５）．
提取的样品电泳结果（图１）显示，方法Ⅲ和方法Ⅰ
图１　３种方法提取的玉米犇犖犃质量琼脂糖凝胶电泳比较
犉犻犵．１　犆狅犿狆犪狉犻狀犵犿犪犻狕犲犇犖犃狇狌犪犾犻狋狔犳狉狅犿３犲狓狋狉犪犮狋狊
狌狊犻狀犵犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
１－３泳道．方法Ⅰ提取的幼苗ＤＮＡ；４－６．方法Ⅱ提取的干种子胚
ＤＮＡ；７－９．方法Ⅲ提取的幼苗ＤＮＡＬａｎｅ１－３．ＭｅｔｈｏｄｓⅠ
ｅｘｔｒａｃｔｓ；Ｌａｎｅｓ４－６．ＭｅｔｈｏｄｓⅡｅｘｔｒａｃｔｓ；Ｌａｎｅｓ７－９．
ＭｅｔｈｏｄｓⅢｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄ
ｉｎ０．８％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｓ
提取的ＤＮＡ基本上无降解，主带一致、清晰，无拖尾
现象；方法Ⅱ提取的ＤＮＡ谱带不清晰，在点样孔和主
带所处位置以上亮度较高，在主带位置以下出现严重
的拖尾现象，说明提取的样品中含有较多的蛋白质以
及ＤＮＡ与蛋白的复合物，ＤＮＡ发生严重降解，说明
用郭景伦等［１５］开发的单粒种子ＤＮＡ热碱快速提取法
所提玉米ＤＮＡ质量很差。
为了进一步鉴定３种方法提取的ＤＮＡ 对ＰＣＲ
扩增效果的影响，用试验设计的２１对通用ＳＳＲ引物
（表２）进行ＰＣＲ扩增。结果表明，以方法Ⅰ和方法Ⅲ
提取的同一玉米材料ＤＮＡ作模版，都能得到较好的
扩增效果（图２Ａ和Ｃ），扩增条带清晰，谱带一致，而
以方法Ⅱ提取的ＤＮＡ作模版，只有个别ＳＳＲ引物组
合得到扩增，其余引物扩增产物呈弥散状（图２Ｂ），且
６０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
图２　不同方法提取的玉米犇犖犃为模板犛犛犚－犘犆犚扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
犉犻犵．２　犚犲狊狌犾狋狊狅犳犛犛犚－犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犇犖犃狋犲犿狆犾犪狋犲犲狓狋狉犪犮狋犲犱
犫狔犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲狋犺狅犱狊狌狊犻狀犵犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
Ａ．方法Ⅰ提取的ＤＮＡ为模板ＰＣＲ扩增产物；Ｂ．方法Ⅱ提取的ＤＮＡ作模板ＰＣＲ扩增产物；Ｃ．方法Ⅲ提取的ＤＮＡ作模板ＰＣＲ
扩增产物Ａ．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＭｅｔｈｏｄⅠａｎｄ２１ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ；Ｂ．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＭｅｔｈｏｄⅡａｎｄ２１ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ；Ｃ．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｕｓｉｎｇＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＭｅｔｈｏｄⅢａｎｄ２１ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ
因模板ＤＮＡ不纯净而在点样空有明显的ＤＮＡ－蛋白质复合物。由此说明，改进的ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ用于
ＳＳＲ－ＰＣＲ可得到特异扩增和稳定的扩增效果。
２．２　通用核心引物的重新设计
按照均匀分布的原则，每个染色体上均匀选取２对引物，其结合位点分别位于各染色体长臂和短臂之上，同
时在多重ＰＣＲ第８组引物中增加了扩增片段小于２００ｂｐ的引物ｐｈｉ０５３，累计２１对引物。通过引物重新设计及
试验验证，构建了８组多重ＰＣＲ的ＳＳＲ引物组合（表２），其中有３对引物采用王凤格等［１８］报道的序列，其余１８
对为新设计、更换和补充的引物。新设计的８组２１对引物之间具有相似的序列特征，特别是降低了变性温度
（Ｔｍ），不同引物对之间Ｔｍ相差０．１～１．６℃，所有引物对的适宜退火温度为５４～５５℃，此温度为常用的适宜退
火温度，有利于引物与模板之间稳定结合和引物３′端的延伸，这样就可以用３步ＰＣＲ扩增程序进行多重ＰＣＲ反应。
２．３　多重ＰＣＲ扩增效果及稳定性
试验以方法Ⅲ提取的玉米单粒种子幼苗ＤＮＡ为模版，退火温度（Ｔｍ）为５４℃，３步法扩增程序（９４℃预变性
５ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，５４℃退火４０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ），分别进行８组多重ＰＣＲ，用以
证明所设计引物及多重ＰＣＲ在鉴定玉米种子真实性和纯度方面的有效性。通过对甘肃金穗种业有限责任公司
提供的１份杂交种［金穗２号 （９７６０８９×Ｓ３５１０）］及其亲本自交系（９７６０８９和Ｓ３５１０）进行的测定，在变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳结果（图３）中显示出各反应中获得的扩增条带清晰、各条带之间未发生扩增片段范围交叉和重
叠的现象，并能够很好地区分杂交种和亲本，并且用同一亲本不同种子ＤＮＡ样品得到了相同的扩增结果（图３）。
本研究建立的鉴定体系与辛景树［１４］和王凤格等［１８］创立的玉米真实性和纯度鉴定的ＳＳＲ多重ＰＣＲ技术体
系相比，新引物在各项序列指标上均有了明显改善，不同引物之间具有了更加相似的序列特征，便于采用相同的
扩增条件进行扩增本研究；替换了个别引物（如将引物“ｐｈｉ１１６ｋ３”更换为“ｐｈｉ０８２ｊ１２”），并在第８组多重ＰＣＲ反
应中增加了引物“ｐｈｉ０５３”，使其信息量进一步增加；通过降低引物的变性温度，将退火温度由前人推介的６８℃降
７０２第１９卷第２期 草业学报２０１０年
表２　多重犘犆犚组合的犛犛犚引物序列及组合
犜犪犫犾犲２　犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊犪狀犱犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿狌犾狋犻狆犾犲狓犘犆犚
组合ａ）
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
王凤格等［１８］设计的引物
ＰｒｉｍｅｒｅｓｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙＷａｎｇ犲狋犪犾［１８］
染色体位点
Ｃｈｒｏｍ．ｌｏｃｕｓ
名称
Ｎａｍｅ
变性温度
Ｔｍ（℃）
新设计、更换和补充引物
Ｐｒｉｍｅｒｅｓｎｅｗｌｙｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｒｅｐｌａｃｅｄａｎｄａｄｄｅｄ
染色体位点
Ｃｈｒｏｍ．ｌｏｃｕｓ
名称ｂ）
Ｎａｍｅ
引物序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）
变性温度
Ｔｍ（℃）
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ（ｂｐ）
１－１ ４．０１ ｐｈｉ０７２ｋ４
７０．５
７２．１
４．０１ ｐｈｉ０７２ｊ１
ＧＣＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧ；
ＣＧＴＴＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴ
７０．５
７０．２
２０１～２５３
１－２ ５．０３ ｕｍｃ１７０５ｗ１
７０．５
７１．２
５．０３ ｕｍｃ１７０５ｊ２
ＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＧ；
ＣＡＣＧＴＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡ
７０．５
６９．９
３１９～３８５
１－３ ６．００ ｂｎｌｇ１６１ｋ８
７３．９
７１．５
６．００ ｂｎｌｇ１６１ｊ３
ＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣ；
ＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＴＧ
６８．０
６７．５
３２３～４２２
２－１ ９．０３ ｐｈｉ０６５ｋ９
７３．６
７２．１
９．０３ ｐｈｉ０６５ｊ４
ＧＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡ；
ＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＣＧＴＣＴＡＧＣ
７０．５
７０．８
２１９～３２７
２－２ ２．０３ ｂｎｌｇ１２５ｋ１
７３．３
７２．９
２．０３ ｂｎｌｇ１２５ｊ５
ＧＧＴＡＣＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧ；
ＧＣＡＴＣＴＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＧＡＧＣ
７０．０
７０．３
２１５
２－３ １０．０４ ｕｍｃ２１６３ｋ５
７０．７
６９．９
１０．０４ ｕｍｃ２１６３ｋ５
ＧＡＴＧＣＡＡＧＣＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣ；
ＣＧＡＣＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＴＣ
７０．７
６９．９
１４５
３－１ １．０３ ｂｎｌｇ４３９ｗ１
７２．３
７３．５
１．０３ ｂｎｌｇ４３９ｊ６
ＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＧＡ；
ＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＴＴＧＴＣ
７０．２
７０．４
１４２～１６２
３－２ ７．０２ ｂｎｌｇ１７９２ｋ８
６９．５
７０．０
７．０２ ｂｎｌｇ１７９２ｋ８
ＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣ；
ＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＴＧ
６９．５
７０．０
４１３～４３３
４－１ ８．０８ ｐｈｉ０８０ｋ１５
７１．１
７１．１
８．０８ ｐｈｉ０８０ｊ７
ＧＡＡＣＣＡＣＣＣＧＡＴＧＣＡＡＣＴＴＧ；
ＴＧＡＴＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＧＴＣ
６８．１
６９．５
５７～１１４
４－２ ３．０９ ｂｎｌｇ１７５４ｗ３
７２．０
７２．４
３．０９ ｂｎｌｇ１７５４ｊ９
ＧＡＣＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧ；
ＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＴＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣ
６８．２
６８．６
２７３～３３０
５－１ １．１１ ｂｎｌｇ２３３１ｋ１
７３．３
７３．１
１．１１ ｂｎｌｇ２３３１ｊ１０
ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＧＧＴＴＡＧＧＣＡＡＣＡＧ；
ＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＡＧ
７０．３
６９．９
１２９～１８５
５－２ ３．００ ｕｍｃ２１０５ｋ３
７２．９
７２．６
３．００ ｕｍｃ２１０５ｊ１１
ＡＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧ；
ＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＣＧＡＣＴＴＧＴＡＣＣ
６８．３
６８．０
１５２～２０８
５－３ ７．０６ ｐｈｉ１１６ｋ３
７１．７
７３．８
７．０５ ｐｈｉ０８２ｊ１２
ＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＣＧＡＧＡ；
ＧＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣＡＣ
７０．９
７０．４
１３２
６－１ ２．０８ ｂｎｌｇ１９４０ｋ９
７４．９
７２．５
２．０８ ｂｎｌｇ１９４０ｊ１３
ＧＣＴＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＴＴＧ；
ＧＣＡＣＴＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧ
６８．４
６８．７
１９２～２５０
６－２ ５．０７ ｂｎｌｇ２３０５ｋ４
７０．６
７０．７
５．０７ ｂｎｌｇ２３０５ｋ４
ＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧ；
ＣＧＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＧＴＧＴＧ
７０．６
７０．７
２４３～２７３
６－３ ９．０１ ｕｍｃ２０８４ｗ２
７１．９
７２．１
９．０１ ｕｍｃ２０８４ｊ１４
ＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＣ；
ＣＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣ
６８．３
６７．３
２０３～２３３
７－１ １０．０７ ｂｎｌｇ１４５０ｋ２
７２．１
７１．７
１０．０７ ｂｎｌｇ１４５０ｊ１５
ＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＧ；
ＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧ
６８．５
７０．４
１３２～１５３
７－２ ８．０３ ｕｍｃ１７４１ｋ７
７２．３
７０．４
８．０３ ｕｍｃ１７４１ｊ１６
ＣＧＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣ；
ＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣ
６８．８
７０．４
３９９～４１９
８－１ ４．０６ ｂｎｌｇ２２９１ｋ４
７１．８
６８．７
４．０６ ｂｎｌｇ２２９１ｊ１７
ＣＡＣＡＣＣＣＧＴＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧ；
ＡＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣ
６８．３
６９．３
１４５
８－２ ６．０５ ｂｎｌｇ１７０２ｋ１
７１．２
６８．７
６．０５ ｂｎｌｇ１７０２ｊ１８
ＡＴＣＣＧＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＣ；
ＡＧＧＡＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡ
６９．３
６８．７
１５４
８－３ ３．０５ ｐｈｉ０５３
ＣＴＧＣＣＴＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＡＣ；
ＡＡＣＣＣＡＡＣＧＴＡＣＴＣＣＧＧＣＡＧ
６８．８
６９．５
１６８～１９５
　ａ）包括８套多重组合；ｂ）新设计引物的命名为“原引物名称＋设计者代号＋序号”；为更换和添加的引物。
　ａ）Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ８ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆｍｕｔｐｌｅｘＰＣＲ；ｂ）Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆｎｅｗｌｙｄｅｓｉｇｎｅｄｐｒｉｍｅｒｗａｓ‘ｐｒｉｍａｒｙｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ＋ｃｏｄｅｎａｍｅｏｆｃｏｎｓｔｒｕｃｔｏｒ＋
ｓｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒ’；Ｓｕｐｅｒｓｅｄｅｏｒａｄｄｉｔｉｏｎａｐｒｉｍｅｒｓ．
８０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
图３　多重犛犛犚－犘犆犚对玉米自交系和杂交种的扩增结果
犉犻犵．３　犕狌犾狋犻狆犾犲狓犘犆犚狉犲狊狌犾狋狊狅犳犿犪犻狕犲犻狀犫狉犲犱犾犻狀犲狊犪狀犱犺狔犫狉犻犱狊
泳道１－８．分别为８组多重ＳＳＲ引物ＰＣＲ扩增的结果；Ｍ．ＤＮＡ标准分子量标记物ＬａｎｅＮｏ．１－８ｗｅｒｅ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｏｆ８ｇｒｏｕｐｓＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ；Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ
到５４℃，改２步法扩增程序为３步法，其多重ＰＣＲ反应及扩增结果变得更加稳定。此外，这一技术体系与单一
ＳＳＲ引物扩增相比，能够提高检测效率２．６倍。这一检测效率并不是上限，在保证多重ＰＣＲ中各引物扩增出的
片段之间不存在重叠的前提下，各组多重ＰＣＲ中还可增加引物对数，通过适度增加变性聚丙烯酰胺凝胶的浓度
以提高分辨率，就能够将不同长度的扩增片段进行区分。
３　讨论与结论
３．１　植物基因组提取方法
ＤＮＡ提取是植物分子遗传学及基因工程研究的前提，获得完整、纯度高的基因组ＤＮＡ对研究的成功起着
十分重要的作用。目前，用于植物ＤＮＡ提取的方法主要有ＳＤＳ（十二烷基硫酸钠，ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）法、高
盐低ｐＨ法和ＣＴＡＢ法［２１２６］。标准的ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法多以幼芽或幼嫩叶片为材料，存在操作步骤多、程序复
杂、周期长等缺点，虽然前人对这２种方法进行了不少改进，但仍然离不开液氮、人工研磨、用β巯基乙醇和水浴
进行抽提，如雷开荣等［２６］报道的不用液氮、人工机械研磨和柴建芳等［２７］报道的不用β巯基乙醇的ＤＮＡ快速提
取法，但这些方法提取ＤＮＡ的成本仍然较高。郭景伦等［１５］开发了单粒种子ＤＮＡ快速提取的热碱法，此方法被
引用在农业部行业标准《玉米品种鉴定ＤＮＡ指纹方法（ＮＹ／Ｔ１４３２２００７）》中。在玉米种子真实性鉴定中发现，
单粒种子ＤＮＡ快速提取的热碱法提取的ＤＮＡ条带完整性差，杂质含量较多，严重影响到ＰＣＲ扩增的稳定性、
特异性和扩增效率。据此认为，对于作物种子真实性和纯度检验来讲，方法的可靠性比速度更为重要。通过改进
ＤＮＡ提取方法，以热ＣＴＡＢ提取液提取发芽种子的ＤＮＡ，得到的ＤＮＡ样品质量完全符合种子真实性和纯度检
验的要求，而且省却了耗费大量的液氮，降低了试验成本。
３．２　多重ＰＣＲ组合的优化
许多研究者针对所研究的物种各自提出了ＳＳＲ引物选择标准，综合起来基本包括４点，即多态性高、扩增质
量高、在全基因组上均匀分布、复合扩增的潜力。在玉米上，已报道了许多ＳＳＲ引物多重ＰＣＲ组合的研究结
果［１６１８］。由于玉米数据库上已公布的ＳＳＲ引物是由不同研究单位设计的，设计者采用的设计标准不完全相同，
因此，设计的ＳＳＲ引物质量存在差异，适宜的扩增条件各不相同，基于这些引物进行多重ＰＣＲ组合时限制较大：
９０２第１９卷第２期 草业学报２０１０年
引物的Ｔｍ值差别较大，最适退火温度不同；引物扩增产物大小范围比较集中，较难选择到合适的多重组合方式；
即使已满足了上述２个条件，部分引物组合还会出现引物间较强的相互作用。王凤格等［１８］借助毛细管电泳自动
荧光检测仪，筛选出了２套１０重ＰＣＲ反应的ＳＳＲ引物，但经过验证发现，该体系主要考虑了引物扩增片段范围
及引物间相互作用，部分引物多态性较低，而且退火温度过高，采用２步ＰＣＲ扩增程序得到的结果稳定性很差。
考虑到基层研究单位和种业公司并不具备毛细管电泳自动荧光检测设备，本研究将多态性与稳定性一并考虑，将
引物的设计与多重ＰＣＲ组合结合进行，通过引物重新设计，建立了２～３重、８组多重ＰＣＲ组合，采取３步ＰＣＲ
扩增程序和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，既保证了检测的高通量和结果的可靠性，一般科研单位和玉米种业公
司都可以采用。因此，本研究建立的对玉米种子真实性和纯度鉴定的ＳＳＲ多重ＰＣＲ鉴定体系将会得到广泛的
应用。
致谢：甘肃金苹果种业有限责任公司陈荣贤经理、甘鑫种业有限责任公司何雁龄、万廷文经理、甘肃金象农业发展
股份有限公司陈学君经理和甘肃高科技种业有限责任公司石建国经理提供了试验材料，在此一并表示致谢。
参考文献：
［１］　ＣｒｏｗＪＦ．９０ｙｅａｒｓａｇｏ：Ｔｈｅｂｅｇｉｎｎｉｎｇｏｆｈｙｂｒｉｄｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９８，１４８：９２３９２８．
［２］　刘纪麟．玉米育种学（第二版）［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００２：１４１２００．
［３］　ＳｍｉｔｈＪＳＣ，ＲｅｇｉｓｔｅｒＭＪＣ．Ｇｅｎｅｔｉｃｐｕｒｉｔｙａｎｄｔｅｓｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｆｏｒｓｅｅｄｑｕａｌｉｔｙ：Ａｃｏｍｐａｎｙｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ［Ｊ］．ＳｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅ
Ｒｅｓｅａｃｈ，１９９８，８：２８５２９３．
［４］　曾三省．中国玉米杂交种的种质基础［Ｊ］．中国农业科学，１９９０，２３（４）：１９．
［５］　方宣钧，吴为人，唐纪良．作物ＤＮＡ标记辅助育种［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１：２２３３．
［６］　魏臻武．利用ＳＳＲ、ＩＳＳＲ和ＲＡＰＤ技术构建苜蓿基因组ＤＮＡ指纹图谱［Ｊ］．草业学报，２００４，１３（３）：６２６７．
［７］　严学兵，王，周禾，等．不同来源ＳＳＲ标记在我国披碱草属植物的通用性和效率评价［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（６）：１１２
１２０．
［８］　郭海林，刘建秀，高鹤，等．结缕草属优良品系ＳＳＲ指纹图谱的构建［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（２）：５３５９．
［９］　ＳｍｉｔｈＪＳＣ，ＣｈｉｎＥＣＬ，ＳｈｕＨ，犲狋犪犾．ＡｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｕｔｉｌｉｔｙｏｆＳＳＲｌｏｃｉａｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｉｎｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊Ｌ．）：
ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｄａｔａｆｒｏｍＲＦＬＰｓａｎｄｐｅｄｉｇｒｅｅ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，（９５）：１６３１７３．
［１０］　袁力行，傅骏骅，ＷａｒｂｕｒｔｏｎＭ，等．利用ＲＦＬＰ、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ和ＲＡＰＤ标记分析玉米自交系遗传多样性的比较研究［Ｊ］．遗
传学报，２０００，２７（８）：７２５７３３．
［１１］　李新海，傅骏骅，张世煌，等．利用ＳＳＲ标记研究玉米自交系的遗传变异［Ｊ］．中国农业科学，２０００，３３（２）：１９．
［１２］　袁力行，傅骏骅，张世煌，等．利用ＲＦＬＰ和ＳＳＲ划分玉米自交系杂种优势群的研究［Ｊ］．作物学报，２００１，２７（２）：１４９
１５６．
［１３］　李晓辉，李新海，李文华，等．ＳＳＲ标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用［Ｊ］．作物学报，２００３，２９（１）：６３６８．
［１４］　辛景树．杂交玉米品种ＤＮＡ指纹图谱［Ｍ］．北京：中国农业科学技术出版社，２００５：１９３１９６．
［１５］　郭景伦，赵久然，王凤格．适用于ＳＳＲ分子标记的玉米单粒种子ＤＮＡ快速提取新方法［Ｊ］．玉米科学，２００５，１３（２）：１６１７，
２５．
［１６］　王凤格，赵久然，佘花娣，等．中国玉米新品种ＤＮＡ指纹库建立系列研究Ⅲ．多重ＰＣＲ技术在玉米ＳＳＲ引物扩增中的应
用［Ｊ］．玉米科学，２００３，１１（４）：３６．
［１７］　赵久然，王风格，郭景伦，等．中国玉米新品种ＤＮＡ指纹库建立系列研究Ⅱ．适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的
ＳＳＲ核心引物的确定［Ｊ］．玉米科学，２００３，１１（２）：３５，８．
［１８］　王凤格，赵久然，戴景瑞，等．玉米通用ＳＳＲ核心引物筛选及高通量多重 ＰＣＲ复合扩增体系建立［Ｊ］．科学通报，２００６，
５１（２３）：２７３８２７４６．
［１９］　王关林，方宏筠．植物基因工程（第二版）［Ｍ］．北京：科学技术出版社，２００２：７４２７４４．
［２０］　陈宏，易自立，张金文．基因工程原理与应用［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００４：８４９７．
［２１］　ＳｔｅｉｎｅｒＪＪ，ＰｏｋｌｅｍｂａＣＪ，ＦｊｅｌｓｔｒｏｍＲＧ，犲狋犪犾．ＡｒａｐｉｄｏｎｅｔｕｂｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
０１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
ｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３（１３）：２５６９２５７０．
［２２］　ＨｏｌｄｅｎＭＪ，ＢｌａｓｉｃＪＲ，ＢｕｓｓｊａｅｇｅｒＬ，犲狋犪犾．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓｆｏｒｃｏｒｎｋｅｒｎｅｌ（犣犲犪犿犪狔狊）ＤＮＡｆｏｒｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｃｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｄｅｒｉｖｅｄＤＮＡ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，５１（９）：２４６８
２４７４．
［２３］　ＰｅａｎｏＣ，ＳａｍｓｏｎＭＣ，ＰａｌｍｉｅｒｉＬ，犲狋犪犾．ＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＧＭＯ
ａｎｄｎｏｎＧＭＯｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓｗｉｔｈｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，
５２（２３）：６９６２６９６８．
［２４］　ＤｉＢｅｒｎａｒｄｏＧ，ＤｅｌＧａｕｄｉｏＳ，ＧａｌｄｅｒｉｓｉＵ，犲狋犪犾．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｒｏｍｆｏｏｄ
ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２００７，２３（２）：２９７３０１．
［２５］　卢振宇，李明顺，谢传晓，等．玉米叶片ＤＮＡ快速提取方法改进研究［Ｊ］．玉米科学，２００８，１６（２）：５０５３，５５．
［２６］　雷开荣，李明顺，李新海，等．一种玉米叶片基因组ＤＮＡ快速提取新方法的初步研究［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（２）：
１０１２．
［２７］　柴建芳，刘旭，贾继增．一种适于ＰＣＲ扩增的小麦基因组ＤＮＡ快速提取法［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００６，７（２）：２４６２４８．
犗狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅狀犿狌犾狋犻狆犾犲狓犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿狅犳犛犛犚犿犪狉犽犲狉犳狅狉
犪狌狋犺犲狀狋犻犮犻狋狔犪狀犱狆狌狉犻狋狔犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犿犪犻狕犲狏犪狉犻犲狋犻犲狊
ＣＨＡＮＧＨｏｎｇ１，３，ＷＡＮＧＨａｎｎｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧＪｉｎｗｅｎ１，２，ＷＡＮＧＷｅｉ１，
ＬＵＺｅｑｕａｎ１，ＬＩＹｉｎ１，ＷＡＮＧＤｉ１，２
（１．ＡｇｒｏｎｏｍｙＣｏｌｅｇｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＧａｎｓｕＫｅｙ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｎ＆ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
３．ＧａｎｓｕＰｌａｎｔＳｅｅｄＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅＳｔａｔｉｏｎ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｉｚｅａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙａｎｄｐｕｒｉｔｙｏｆｔｈｅＳＳＲ
ｍａｒｋｅｒｓ，ｇｅｎｅｔｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙａｎｄｇｏｏｄｉｎｔｅｇｒｉｔｙｏｆＤＮＡｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇａｂｏｖｅ７５℃ｐｒｅｈｅａｔｉｎｇ
ｍｏｒｔａｒａｎｄ９５℃ｏｆ１．５×ＣＴＡＢｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｔｏｇｒｉｎｄｍａｔｅｒｉａｌ．Ｒｅｄｅｓｉｇｎａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｕｓｉｎｇｔｈｅｓｏｆｔｗａｒｅＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０ａｎｄＯｌｉｇｏ６．７２，ｅｉｇｈｔｓｅｔｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ
ｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ２１ｐａｉｒｓｏｆｕｎｉｖｅｒｓａｌＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄａｔｈｒｅｅｓｔｅｐｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｗｅｒｅｗｉｔｈｕｎｉｆｏｒｍｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，
ｎｏｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎａｍｏｎｇｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ａｍｐｌｉｆｉｅｄｂａｎｄｓｃｌｅａｒａｎｄｓｔａｂｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｅｔｅｓ
ｔｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｃｒｅａｓｅｄ２．６ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎａｓｉｎｇｌｅｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓＳＳＲ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊）；ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ；ｐｕｒｉｔｙ；ＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＳＳＲｐｒｉｍｅｒ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
１１２第１９卷第２期 草业学报２０１０年