全 文 ：书多花黑麦草品种间杂交犉２代分子标记遗传分析
杨文轩，马啸，张新全，黄琳凯，苗佳敏
（四川农业大学草业科学系，四川 雅安６２５０１４）
摘要：运用序列相关扩增多态性（ＳＲＡＰ）和微卫星标记（ＳＳＲ）技术对６个多花黑麦草亲本品种及其９个杂交Ｆ２ 代
组合８０份材料进行遗传分析。筛选出具有多态性的１５对ＳＲＡＰ引物、１６对ＳＳＲ引物，ＳＲＡＰ标记平均每对引物
扩增出１６．７条带，多态性位点百分率为６８．８８％。ＳＳＲ标记平均每对引物扩增出１４．７５条带，多态性位点百分率
为５８．０５％。通过聚类树状图分析得出结论，杂交Ｆ２ 代内同一组合基本聚为一类，长江２号×剑宝和长江２号×
阿伯德组合除外；父本和母本与其杂交Ｆ２ 代遗传距离与聚类结果基本一致。同时还发现ＳＲＡＰ标记对杂交Ｆ２ 代
及亲代聚类分析可靠性高于ＳＳＲ标记。
关键词：多花黑麦草；杂交Ｆ２ 代；遗传关系；ＳＲＡＰ；ＳＳＲ
中图分类号：Ｓ５４３＋．６０３．５１；Ｑ９４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１２５０９
　　多花黑麦草（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）产量高，适应性强，适口性好，家畜喜采食，在我国南方地区广为种植［１］。
我国黑麦草育种工作起步较晚，新品种缺乏，所需品种基本从国外引进，国内育成品种仅有“长江２号”。杂交育
种（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成新品种的方法。
杂交可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生
在该性状上超过亲本的类型。多花黑麦草为异花授粉植物、遗传背景相对复杂，杂交育种过程相对缓慢是黑麦草
育种的主要难点之一［２］。在品种间杂交Ｆ１ 代基础上进一步通过混合选择法筛选得到了优异Ｆ２ 代材料。利用分
子标记是鉴定和分析杂交群体后代的有效方法。相关序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）是一种新型的基于ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）的标记，由Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［３］于２００１年在研究芸
薹属（犅狉犪狊狊犻犮犪）植物中开发的。标记采用长１７～１８ｂｐ的引物进行扩增，因不同物种的内含子、启动子与间隔长
度不等而产生多态性。由于ＳＲＡＰ技术简便、快速、扩增稳定、不需预知物种的序列信息等优点，故而迅速在植
物遗传多样性分析、杂种鉴定等方面得到广泛应用［４１２］。简单重复序列（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ），又称微卫
星ＤＮＡ，是指由１～６个核苷酸组成的短序列经过首尾相连重复多次构成的长达几十甚至几百的一段ＤＮＡ，长
度一般在２００ｂｐ以下，相同座位上的重复序列由于重复次数不同而产生了等位基因的多态性。ＳＳＲ位点广泛地
存在于植物的基因组中并以共显性的孟德尔方式遗传，具有较多的可检测等位基因，已被广泛的用于植物遗传多
样性、连锁图谱构建、杂种鉴定等领域。但由于ＳＳＲ引物开发难度大、耗时长、成本高，限制了其使用范围。目
前，已经开发出大量多年生黑麦草（犔．狆犲狉犲狀狀犲）ＳＳＲ引物［１３］，由于ＳＳＲ引物一般在近缘种属上具有较高的通用
性，可以在多花黑麦草的遗传研究上加以利用。本研究通过ＳＲＡＰ和ＳＳＲ分子标记对不同杂交组合的Ｆ２ 代单
株进行分析，揭示杂交Ｆ２ 代不同组合之间以及Ｆ２ 代与亲代之间的遗传关系，以期为今后黑麦草杂交育种品种的
系谱来源提供分子佐证。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料为多花黑麦草的６个亲本品种（长江２号、杰威、剑宝、沃土、阿伯德、邦德）杂交得到９个Ｆ２ 杂交组
合。Ｆ２ 代是由２００８年杂交Ｆ１ 代并经过ＳＲＡＰ分子标记检验真假杂种后筛选出的１０个组合［１４］，２００９年通过株
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１２５－１３３
２０１２年８月
收稿日期：２０１１０８１０；改回日期：２０１１０９２６
基金项目：国家科技支撑计划（编号：２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０３）和国家现代牧草产业技术体系（编号：ＣＡＲＳ３５）资助。
作者简介：杨文轩（１９８５），男，四川成都人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙｗｅｎｘｕａｎ２００９＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｑ＠ｓｉｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
系单株选择法选出的９个组合８０个单株。按照每个单株播种１个株行，同一个株行为一个株系。９个杂交组合
在开花期用筛网隔离。亲本来源见表１，Ｆ２ 代杂交组合及其后代见表２。
１．２　ＤＮＡ提取
２０１０年选取杂交亲本品种和杂交Ｆ２ 代多花黑麦草健康幼叶（亲本品种选取２０～３０个单株混合提取ＤＮＡ，
杂交Ｆ２ 代选择一个株系内１０个单株幼叶混合提取），用ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵）法［１５］提取基因组
ＤＮＡ，具体参照邹喻苹等［１６］的方法。通过采用０．８％琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测ＤＮＡ纯度和浓度，合格
的ＤＮＡ样品于－２０℃冰箱内保存备用。
１．３　ＳＲＡＰ及ＳＳＲ反应体系
选取经电泳检测质量较高且田间试验性状差异较大的材料ＤＮＡ作模板，从１００对ＳＲＡＰ和１００对ＳＳＲ引
物中筛选出多态性高的引物，再对全部材料进行ＰＣＲ扩增。ＳＲＡＰ反应体系及ＰＣＲ程序参照Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［３］的
方法，ＳＳＲ反应体系及ＰＣＲ程序参照Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ等［１７］的方法。扩增产物在６％聚丙烯酰胺凝胶上进行检测。先
在电泳仪上进行２００Ｖ恒定电压下３０ｍｉｎ的预电泳，再在样孔中每样品点样８到１０μＬ，以Ｄ２０００Ｍａｒｋｅｒ
（ＴＡＫＡＲＡ公司）为分子量标准，然后在４００Ｖ恒定电压下电泳２ｈ，银染参照许绍斌等［１８］的方法。
表１　亲本及其来源
犜犪犫犾犲１　犜犺犲狊狅狌狉犮犲狊狅犳狆犪狉犲狀狋狊
序号Ｎｏ．中文名称Ｃｈｉｎｅｓｅｎａｍｅ 材料来源 Ｍａｔｅｒｉａｌｓｒｅｓｏｕｒｃｅ 品种主要优良特征Ｅｘｃｅｌｅｎｔｔｒａｉｔｓｏｆｐａｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ
１ 长江 ２ 号 Ｃｈａｎｇｊｉａｎｇ
Ｎｏ．２
四川农业大学ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
冬春季生长速度快、植株高大、种子产量高 Ｇｒｏｗｉｎｇｆａｓｔｉｎｗｉｎｔｅｒ
ａｎｄｓｐｒｉｎｇ，ｔａｌｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔａｎｄｈｉｇｈｓｅｅｄｙｉｅｌｄ
２ 杰威Ｓｐｌｅｎｄｏｒ 四川金种燎原公司 ＳｉｃｈｕａｎＬｉａｏｙｕａｎ
Ｇｏｌｄｅｎｓｅｅｄｃｏ．，ｌｔｄ
耐刈割能力强 Ｈｉｇｈｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｃｕｔｔｉｎｇ
３ 剑宝Ｊｕｍｂｏ 百绿公司ＢａｒｅｎｂｒｕｇＧｒｏｕｐ，Ｃｈｉｎａ 草产量高、植株高大 Ｈｉｇｈｈａｙｙｉｅｌｄａｎｄｔａｌｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔ
４ 沃土Ｂａｒｗｏｌｔｒａ 百绿公司ＢａｒｅｎｂｒｕｇＧｒｏｕｐ，Ｃｈｉｎａ 抗倒伏性好、叶片直立生长性能好 Ｈｉｇｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｌｏｄｇｉｎｇ，ｅｒｅｃｔ
ｈａｂｉｔｏｆｇｒｏｗｔｈ
５ 阿伯德Ａｕｂａｄｅ 四川金种燎原公司 ＳｉｃｈｕａｎＬｉａｏｙｕａｎ
Ｇｏｌｄｅｎｓｅｅｄｃｏ．，ｌｔｄ
营养价值好、适口性好 Ｈｉｇｈｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｖａｌｕｅ，ｇｏｏｄｐａｌａｔａｂｉｌｉｔｙ
６ 邦德 Ａｂｕｎｄａｎｔ 丹农公司ＤＬＦＧｒｏｕｐ，Ｃｈｉｎａ 晚熟型多 花 黑 麦 草、生 育 期 长、抗 病 性 强 Ｌａｔｅｍａｔｕｒｉｎｇｔｙｐｅ
ｒｙｅｇｒａｓｓ，ｌｏｎｇｂｒｅｅｄｉｎｇｐｅｒｉｏｄ，ｈｉｇｈｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
表２　犉２ 代杂交组合及材料
犜犪犫犾犲２　犉２犺狔犫狉犻犱犻狕犲犱犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀犪狀犱狆狉狅犵犲狀犻犲狊
组合 （♀×♂）
Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
Ｆ２代数目
ＮｕｍｂｅｒｏｆＦ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
Ｆ２代编号
ＣｏｄｅｏｆＦ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
剑宝×沃土Ｊｕｍｂｏ×Ｂａｒｗｏｌｔｒａ ６ １１，１２，１３，１４，１５，１６
阿伯德×长江２号Ａｕｂａｄｅ×ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２ １０ ２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，２１０
长江２号×剑宝ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２×Ｊｕｍｂｏ １０ ３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，３１０
邦德×长江２号Ａｂｕｎｄａｎｔ×ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２ ９ ４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９
长江２号×阿伯德ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２×Ａｕｂａｄｅ ９ ５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９
沃土×长江２号Ｂａｒｗｏｌｔｒａ×ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２ １０ ６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，６１０
剑宝×长江２号Ｊｕｍｂｏ×ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２ １０ ７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，７１０
阿伯德×剑宝Ａｕｂａｄｅ×Ｊｕｍｂｏ ８ ８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８
杰威×长江２号Ｓｐｌｅｎｄｏｒ×ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２ ８ ９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８
６２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
１．４　数据统计
对获得的清晰可重复的ＤＮＡ条带进行统计，只
对清晰可辩的扩增条带进行统计，排除弱带和弥散带。
每个ＳＲＡＰ和ＳＳＲ位点等位变异的有无分别用数字
１和０表示，形成原始的二元数据矩阵。根据材料间
的ＳＭ相似系数（ｓｉｍｐｌｅｍａｔｃｈｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ），简单匹配
系数以非加权类平均数（ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析，建
立树状聚类图［１９］，计算材料遗传相似矩阵与聚类树协
表征系数（ｃｏｐｈｅｎｅｔｉｃｖａｌｕｅｓ）矩阵的 Ｍａｎｔｅｌ相关系
数，检测聚类结果的可靠性。同时，为比较ＳＲＡＰ和
ＳＳＲ标记所估算的遗传相似性之异同，将基于ＳＲＡＰ
和ＳＳＲ标记数据计算的遗传相似系数进行 Ｍａｎｔｅｌ相
关性比较。
２　结果与分析
２．１　筛选引物及ＳＲＡＰ扩增多态性
从１００对引物中筛选出１５对扩增稳定、多态性好
并且亲本及杂交Ｆ２ 代间具有多态性的引物组合（表
３），共得到２４１条清晰可辨条带。其中多态性条带
１６６条，多态性位点百分率为６８．８８％，平均每对引物
扩增出１６．０７条带，其中１１．０７条具有多态性（表４），
表明ＳＲＡＰ能检测出较多的遗传位点，能获得多态性
较好的ＰＣＲ结果。并利用这１５对引物对杂交Ｆ２ 群
体进行多态性分析，６８．８８％多态性位点说明ＳＲＡＰ
标记能很好的应用于多花黑麦草研究。
２．２　筛选引物及ＳＳＲ扩增多态性
从１００对多花黑麦草ＳＳＲ专有引物中筛选出１６
对扩增稳定、多态性好并且亲本及杂交Ｆ２ 代间具有多
态性的引物组合共得到２３６条清晰可辨条带（表５）。
其中多态性条带 １３７ 条，多态性位点 百 分 率 为
５８．０５％。平均每对引物扩增出１４．７５条带，其中８．５６
条具有多态性，表明ＳＳＲ能检测出较多的遗传位点，
能获得多态性较好的ＰＣＲ结果（图１）。并利用这１６
对引物对杂交Ｆ２ 群体进行多态性分析。从扩增总条
带数和多态性角度上，ＳＳＲ标记的多态性扩增低于
ＳＲＡＰ标记。
表３　用于多花黑麦草犛犚犃犘分析的引物序列
犜犪犫犾犲３　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犛犚犃犘
犪狀犪犾狔狊犲狊狅犳犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
正向引物
Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ（５′３′）
反向引物
Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ（５′３′）
ｍｅ３：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇａａｔ ｅｍ１：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔａａｔ
ｍｅ４：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇａｃｃ ｅｍ２：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔｔｇｃ
ｍｅ５：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇａａｇ ｅｍ３：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔｇａｃ
ｍｅ６：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇｔａａ ｅｍ４：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔｔｇａ
ｍｅ７：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇｔｃｃ ｅｍ５：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔａａｃ
ｍｅ８：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇｔｇｃ ｅｍ７：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔｃａａ
ｍｅ９：ｔｇａｇｔｃｃａａａｃｃｇｇｔａｇ ｅｍ８：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔｃｔｇ
ｅｍ９：ｇａｃｔｇｃｇｔａｃｇａａｔｔｃｇａ
表４　多花黑麦草犛犚犃犘标记的多态性
犜犪犫犾犲４　犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊犳狉狅犿犛犚犃犘１５狆狉犻犿犲狉
犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊狅狀犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
引物对
Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ
扩增总条带数
ＴｏｔａｌＮｏ．
ｏｆｂａｎｄｓ
多态性条带数
Ｎｏ．ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
ｍｅ３ｅｍ５ １４．００ ８．００ ５７．１４
ｍｅ４ｅｍ２ １３．００ ７．００ ５３．８５
ｍｅ４ｅｍ５ ２２．００ １９．００ ８６．３６
ｍｅ５ｅｍ４ １７．００ １２．００ ７０．５９
ｍｅ５ｅｍ１０ ２０．００ １４．００ ７０．００
ｍｅ６ｅｍ１ ２２．００ １８．００ ８１．８２
ｍｅ６ｅｍ５ １９．００ １２．００ ６３．１６
ｍｅ６ｅｍ１０ １９．００ １４．００ ７３．６８
ｍｅ７ｅｍ２ １５．００ ９．００ ６０．００
ｍｅ７ｅｍ３ １３．００ ８．００ ６１．５４
ｍｅ７ｅｍ８ ９．００ ７．００ ７７．７８
ｍｅ７ｅｍ９ １４．００ １０．００ ７１．４３
ｍｅ８ｅｍ３ １５．００ １２．００ ８０．００
ｍｅ８ｅｍ７ １６．００ ９．００ ５６．２５
ｍｅ９ｅｍ５ １３．００ ７．００ ５３．８５
总和Ｓｕｍ ２４１．００ １６６．００
平均Ａｖｅｒａｇｅ １６．０７ １１．０７ ６８．８８
２．３　亲本特征条带
根据杂交亲本及杂交Ｆ２ 代的电泳图谱，对Ｆ２ 代杂交种进行杂交分析。分别找出父母本各自特异性条带，再
观察和记录对应的杂交Ｆ２ 代后代上是否有这条特异条带的材料，在Ｆ２ 代中特异性条带难度较大。ＳＳＲ标记筛
选出的１６个引物只有７对引物可筛选出５个单独亲本的特异性条带，ＳＲＡＰ引物筛选出１５个引物中只有１０对
引物扩增出单个亲本的特异性条带，并且在试验过程中发现非亲本的特征条带也可能出现在子代中，例如亲本长
江２号的特异性条带出现在剑宝×沃土中（图２），ＳＳＲ标记同样发现非亲本的特征条带出现在子代中。从而说
明用鉴定杂种Ｆ１ 的方法来鉴定Ｆ２ 不太合适。
７２１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
表５　用于多花黑麦草犛犛犚分析的引物序列和多态性
犜犪犫犾犲５　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊犪狀犱犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊犳狉狅犿犛犛犚犪狀犪犾狔狊犲狊狅犳犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｄｅ
正向引物
Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅ
（５′３′）
反向引物
Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ
（５′３′）
扩增总条带数
ＴｏｔａｌＮｏ．
ｏｆｂａｎｄｓ
多态性条带数
Ｎｏ．ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
ＬＭｇＳＳＲ０１０８Ｈ ａｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃａｃａｃｃａｇ ｇｃａｔｇｇｃｔａｃａｔｃｃｔｔｃｃａｇ ２１ １１ ５２．３８
ＬＭｇＳＳＲ０１０７Ｇ ａｇａａｔｇｔｇｃｇａｃｔｇｇｃｇｔｔｇ ｇｔｇａｔｃｃｃｇａｔｃａｃａｃｇｃａｃ １４ ７ ５０．００
ＬＭｇＳＳＲ０００１Ａ ｃｇａｔｇａｔｃｔｃａｔｔｃｇａａｃｇｇｔｇ ａｇａａｃｇｃｔｃｃｃｔｃａｔｇｔｃｇｃ ２２ ８ ３６．３６
ＬＭｇＳＳＲ０１１１Ｇ ａｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｃｃｔｃｔｃｇａｇａａｃｃ ｔａｃｃｇａｔｃｔｇａａｔｃｇａｔｃｃｔｃｃａｔ １４ ５ ３５．７１
ＬＭｇＳＳＲ０２０５Ｄ ａｃｔｇｃｃｔｇｃａｃｔｇｇｔｇｃｔｔｇ ｇｃｔｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇａｃａｃｔｇｔｔｔｔａｃａ １３ ６ ４６．１５
ＬＭｇＳＳＲ０３０４Ｆ ｃａｇａｔｇｇｇｃａｇｔｔｇｃｃａｃｔｇ ｇｔａｔｔｇｔａｃａｃａｃａａｇｃａｔａｔｔｇｇｃｇ １７ １１ ６４．７１
ＬＭｇＳＳＲ０３１１Ｂ ｇｇｃａａｇｔｇｃａａａｔｃｃａｔｔｇｃ ｃｃａａａｇｔｇｇｇｃｔｔｃｃｃａａｇａ ２０ １３ ６５．００
ＬＭｇＳＳＲ０４０９Ｂ ｔｃｃｔｔｃｃｔｇａａｔｇａｇａｇａｇｔｇａｔｇ ｔｇｔｃｔｇｃａｔｔｔｔｔａｔｇｃｇｔｇｔｇ ９ ７ ７７．７８
ＬＭｇＳＳＲ０４０９Ｄ ｇｃａａｇｃａａｔｔｇｃａｔｇｃａｇ ｔｃｔｇｃａｇｇｇａｇｃａｃｔｇｔｔｔ １２ ７ ５８．３３
ＬＭｇＳＳＲ０４０９Ｆ ａｔｃｇｇａｃａｃｔｇｇｔｔｃｃｇｃａｔ ｔｔｇｔｔｇｔｔｇｃｃｇｇｃｔｔｃｇｔａ １４ １２ ８５．７１
ＬＭｇＳＳＲ０７０７Ｇ ｃａａｃｃａｇａｇｃａｃｇｃｃｃｔａｃａ ｇｃａｃａｔｔｇｃｃｔｔｃｃｇｔｇａｔｇ １２ ８ ６６．６７
ＬＭｇＳＳＲ０８０５Ｄ ｔｇｔｃａｃｇｃｃａｇｔｔａｇｇｃｃａｇ ｃｔｇａｔｔｔｃｃａｃｔｇｔｔｔｔｃｔａａａｃｇｇ ７ ６ ８５．７１
ＬＭｇＳＳＲ０８１０Ｇ ｔｃｇａｃｇａｃａｃａｃｇｇｃｔｔｃｔｃ ａｃｔｃｃｔｇｔｇｃｇｔｃｔｇｃｔｇｔａｔｇ ２０ １１ ５５．００
ＬＭｇＳＳＲ１２１０Ｆ ａａｔｔｃａａｃｃａｔｇｃａａｇｇａｇｇ ｇｃｇｇｃａｔｔａｇｃａａｃａａｇｃ １０ ４ ４０．００
ＬＭｇＳＳＲ１６０４Ｆ ｇｔｇｃｔｇａｔｃｔａａｔｃｃｃｃａｃａｇｃ ｇｇｃａｃｇｃｃａａｔｔｃａｔａｃｇａｇ １９ １２ ６３．１６
ＬＭｇＳＳＲ１７１０Ｄ ｃｔｔｔｃｇｃｔｃｔａｇｃｔｔｇａｔｇｔｃｔｃｃ ａａｔｃａｔｔａｔｇｇａａｃａｔｃｇｔｇａｔｔａｇｔｇ １２ ９ ７０．００
总和Ｓｕｍ ２３６ １３７
平均Ａｖｅｒａｇｅ １４．７５ ８．５６ ５８．０５
图１　犔犕犵犛犛犚０８０５犇引物对供试材料扩增效果
犉犻犵．１　犛犛犚犪犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狊狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉犖狅．０８０５犇
　１：长江２号ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２；２：杰威Ｓｐｌｅｎｄｏｒ；３：剑宝Ｊｕｍｂｏ；４：沃土Ｂａｒｗｏｌｔｒａ；５：阿伯德Ａｕｂａｄｅ；６：邦德Ａｂｕｎｄａｎｔ；７～９：长江２号×阿
伯德的Ｆ２代Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｃｒｏｓｓｂｅｔｗｅｅｎＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２ａｎｄＡｕｂａｄｅ；１０～１１：剑宝×沃土的Ｆ２代Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｃｒｏｓｓｂｅｔｗｅｅｎＪｕｍ
ｂｏａｎｄＢａｒｗｏｌｔｒａ；１２～１３：杰威×长江２号的Ｆ２代Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｃｒｏｓｓｂｅｔｗｅｅｎＳｐｌｅｎｄｏｒａｎｄＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２．
２．４　分子标记聚类分析
２．４．１　ＳＲＡＰ聚类分析　利用ＮＴＳＹＳ计算多花黑麦草杂交Ｆ２ 代及其亲本的株系和单株共８６个材料的遗传
相似系数并绘制 ＵＰＧＭＡ聚类图（图３）。利用ＳＲＡＰ标记遗传相似矩阵与聚类树协表征系数矩阵的 Ｍａｎｔｅｌ相
关系数狉＝０．９４４（狋＝３１．５９，狆＝１．０），说明基于ＳＲＡＰ标记对多花黑麦草Ｆ２ 代杂交及亲本的遗传聚类分析可靠
程度很高。
８２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
图２　犛犚犃犘犿犲８犲犿３引物对供试材料扩增效果
犉犻犵．２　犛犚犃犘犪犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狊狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉犖狅．犿犲８犲犿３
　１：长江２号ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２；２：杰威Ｓｐｌｅｎｄｏｒ；３：剑宝Ｊｕｍｂｏ；４：沃土Ｂａｒｗｏｌｔｒａ；５：阿伯德Ａｕｂａｄｅ；６：邦德Ａｂｕｎｄａｎｔ；７～１２：剑宝×沃土
的Ｆ２代Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｃｒｏｓｓｂｅｔｗｅｅｎＪｕｍｂｏａｎｄＢａｒｗｏｌｔｒａ；１３～２０：阿伯德×长江２号的Ｆ２代Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｃｒｏｓｓｂｅｔｗｅｅｎＡｕｂａｄｅａｎｄ
ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２．
在遗传相似系数为０．８４的位置上，可将所有材料划分为１６类，其中６个亲本各自分为一类。从聚类图可以
清晰看到在１６类中，大多数杂交Ｆ２ 组合内所有材料都聚在一起，例如沃土×剑宝（１１到１６）；阿伯德×长江２
号（２１到２１０）；邦德×长江２号（４１到４９）；沃土×长江２号（６１到６１０）；阿伯德×剑宝（８１到８８）；杰威×
长江２号（９１到９８）。剩下的没有聚为同类的杂交组合，长江２号×剑宝杂交组合材料３１，３２，３３，３４，３５聚
为一类，剩下与长江２号×阿伯德５１，５２，５３聚为一类。长江２号×阿伯德５４，５５，５６，５７，５８，５９和沃土×
长江２号的杂交材料聚为一类。
２．４．２　ＳＳＲ聚类分析　利用ＳＳＲ标记遗传相似矩阵与聚类树协表征系数（ｃｏｐｈｅｎｅｔｉｃｖａｌｕｅｓ）矩阵的 Ｍａｎｔｅｌ相
关系数狉＝０．６０１，（狋＝１４．７２１０，狆＝１．００００）。说明基于ＳＳＲ分子标记对多花黑麦草Ｆ２ 代杂交及亲本的遗传聚
类分析可靠程度较低（聚类图略）。
２．４．３　ＳＲＡＰ和ＳＳＲ综合聚类分析　由于ＳＲＡＰ聚类图与ＳＳＲ聚类图的结果有所差异，ＳＲＡＰ的可靠率高，
ＳＳＲ可靠率低，可能ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记所估算的遗传相似性存在差异。基于２种标记数据计算的遗传相似系数
的 Ｍａｎｔｅｌ相关系数狉＝０．３９３（狋＝１０．９１４，狆＝１．０），说明２标记的相关性很低。可以将２个标记的二元数据矩
阵相结合，得出２个标记结合的遗传相似系数矩阵并进行聚类。利用ＳＲＡＰ＋ＳＳＲ标记遗传相似矩阵与聚类树
协表征系数矩阵的Ｍａｎｔｅｌ相关系数狉＝０．９２７（狋＝２９．３，狆＝１．０）。说明基于ＳＲＡＰ＋ＳＳＲ两种标记对多花黑麦
草Ｆ２ 代杂交及亲本的遗传聚类分析可靠程度很高。
根据ＳＲＡＰ＋ＳＳＲ遗传相似系数（ＳＭ系数），计算出每个组合材料与其亲本的遗传距离平均值，所有杂交后
代与亲本的相似系数都在０．７０４～０．８０８，可见杂交Ｆ２ 代各个组合群体遗传变异是相对稳定的，与父本和母本的
相似度总体上较一致。
ＳＲＡＰ＋ＳＳＲ聚类树状图如图４，树状图与ＳＲＡＰ的极为相似。在遗传相似系数０．８１５处，可将所有材料分
为１８类，６个亲本仍然各自聚成一类。杂交组合长江２号×剑宝被分为２类，长江２号×剑宝３１、３２、３３、３４、
３５单独聚为一类；长江２号×剑宝３６、３７、３８、３９、３１０与长江２号×阿伯德材料５１、５２、５３聚为一类。杰
威×长江２号和阿伯德×剑宝所有材料被聚为一类，但这类的内部，２个组合材料还是各自保持更高的相似度。
其他所有杂交组合都各自聚成一类。
３　讨论
本试验首次尝试运用筛选父母特异性条带的方法对杂交Ｆ２ 代做遗传分析。近年来针对异花授粉禾草杂种
分子标记鉴定［８，１０，１４］的研究都认为，应该结合多对引物进行鉴定，有些引物虽然有父本特征带，但在后代中不显
示，无法判定亲本来源，而应该结合多对引物进行鉴定，提高鉴定的准确性。本研究中ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记在亲本
与Ｆ２ 代亲子关系鉴定中难度较大，原因可能有以下几点：１）一般Ｆ１ 代杂交遗传或鉴定，亲本是单株。异花授粉
单株的基因是杂合型，即使同一品种的不同单株都会有差异。２）多花黑麦草为一年生牧草，杂交育种一般需选育
多年，杂交单株亲本在第１年后已死亡，难以保存，难以用原始杂交亲本单株与杂种后代进行比较分析。３）杂交
Ｆ１ 代只需要扩增其父本特异带，Ｆ２ 代需要扩增出双亲互补带，异花授粉植物后代的变异性较大，杂交后代的双
９２１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图３　犛犚犃犘标记多花黑麦草杂交犉２ 代和亲代聚类图
犉犻犵．３　犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿犫犪狊犲犱狅狀狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狊犳狅狉犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿犉２狆狉狅犵犲狀犻犲狊犪狀犱狆犪狉犲狀狋犪犾犮狌犾狋犻狏犪狉狊犫狔犛犚犃犘
亲互补带既有可能带谱消失或者出现新条带。４）本试验通过观察扩增出的特异条带发现，非亲本子代也可能具
有特异条带，说明各不同组合材料之间在隔离的情况下仍有串粉的可能，因为多花黑麦草是高度异花传粉牧草。
在聚类树状图中杂交组合Ｆ２ 代材料未能与亲本材料全部聚在同一类，可能有以下几点原因：１）本次试验的
Ｆ１ 代杂交选用的是品种单株，异花授粉植物单株与品种群体有一定差异。２）多花黑麦草属于高度异交植物，主
要是通过风媒和虫媒传粉，有可能在Ｆ１ 代繁种选育过程中的隔离措施还不够，杂交组合间可能出现再次杂交。
０３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
图４　犛犚犃犘＋犛犛犚标记多花黑麦草杂交犉２ 代和亲代聚类图
犉犻犵．４　犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿犫犪狊犲犱狅狀狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狊犳狅狉犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿犉２狆狉狅犵犲狀犻犲狊狆犪狉犲狀狋犪犾犮狌犾狋犻狏犪狉狊犫狔犛犚犃犘＋犛犛犚
３）多花黑麦草杂交后代变异丰富，经过杂交后新群体与杂交亲本的群体会有明显差异。
ＳＲＡＰ标记具有操作简便、稳定、中等产率、广泛适用和便于克隆目标片断等优点，广泛应用于草类植物的遗
传分析［１１］。从扩增条带数和多态性，到聚类图的可靠性检验，ＳＲＡＰ的表现都优于ＳＳＲ。原因可能是：１）在分析
多样性和遗传相似系数上，ＳＳＲ标记的共显性优势未能发挥出来，其效率不如ＳＲＡＰ高。２）ＳＳＲ筛选的引物不
够，２个标记都筛选了１００对引物，可能ＳＳＲ需要筛选更多的引物，这样效果也许更好。３）试验材料的针对性，虽
然本试验ＳＳＲ引物是黑麦草专有引物，但可能在相似度比较高的材料中效果不如ＳＲＡＰ。
４　结论
本试验是在多花黑麦草杂交Ｆ１ 代已被鉴定为真杂种的基础上，对前一段育种材料进一步研究。通过简单匹
１３１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
配系数，进行３次聚类分析。其中ＳＲＡＰ和ＳＲＡＰ＋ＳＳＲ的聚类树状图可靠性程度高。聚类图中，亲本都独立聚
成一类，大多数杂交组合都能各自聚成一类。仅长江２号×剑宝、长江２号×阿伯德这２个组合各自被分为２
类，表明不同杂交组合间变异较大，同一杂交组合后代植株间变异相对较小。
各个杂交组合与其亲本的遗传相似系数表明，所有杂交后代与亲本的相似系数都在０．７０４～０．８０８。可见杂
交Ｆ２ 代各个组合群体遗传变异是相对稳定的，父母本及其Ｆ２ 代遗传距离与聚类结果基本一致。
在多花黑麦草的分子育种鉴定或杂种后代分析中，ＳＲＡＰ标记效率准确性较高。ＳＲＡＰ引物属于植物中通
用的标记，更易获得。ＳＲＡＰ扩增的多态性和聚类的可靠性更高，该标记有望在其他同类草种杂种后代鉴定和选
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２３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
犃狊狋狌犱狔狅狀犵犲狀犲狋犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犉２犺狔犫犻狉犱狆狉狅犵犲狀犻犲狊犫狔犿狅犾犲犮狌犾犪狉犿犪狉犽犲狉狊
犻狀犪狀狀狌犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）
ＹＡＮＧＷｅｎｘｕａｎ，ＭＡＸｉａｏ，ＺＨＡＮＧＸｉｎｑｕａｎ，ＨＵＡＮＧＬｉｎｋａｉ，ＭＩＡＯＪｉａｍｉｎ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｉｘｐａｒｅｎｔａｌｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆ犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿ａｎｄｅｉｇｈｔｙＦ２ｐｒｏｇｅｎｉｅｓｏｆｎｉｎｅｃｒｏｓｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｅｒｅ
ｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ＳＲＡＰａｎｄＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆ８６犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿ａｃ
ｃｅｓｓｉｏｎｓ．１５ａｎｄ１６ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙＳＲＡＰａｎｄＳＳＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１６．７ｂａｎｄｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｅｒ
ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｏｎａｖｅｒａｇｅａｎｄｐｅｒｃｅｎｔｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓ６８．８８％ｉｎＳＲＡＰａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｂａｎｄｓｐｅｒｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｗａｓ１４．７５ａｎｄｐｅｒｃｅｎｔｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓ５８．０５％ｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅｃｏｎ
ｃｌｕｓｉｏｎｏｆａｎａｌｙｚｅｂｙｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｔｒｅｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｒｏｇｅｎｉｅｓｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅＦ２ｃｒｏｓｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｃｌｕｓｔｅｒｅｄｔｏ
ｇｅｔｈｅｒ，ｅｘｃｅｐｔｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２×Ｊｕｍｂｏ，ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２×Ａｕｂａｄｅ；ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ
ｆｒｏｍＦ２ｐｒｏｇｅｎｉｅｓｔｏｍａｌｅｐａｒｅｎｔｏｒｆｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔｗａｓｓｏａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＵＰＧＭＡ
ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｆｏｒ犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿Ｆ２ｐｒｏｇｅｎｉｅｓａｎｄｐａｒｅｎｔａｌｃｕｌｔｉｖａｒｓｂｙＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＳＳＲ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿；Ｆ２ｈｙｂｒｉｄｐｒｏｇｅｎｉｅｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ；ＳＲＡＰ；ＳＳＲ
３３１第２１卷第４期 草业学报２０１２年