全 文 ：书野生大豆盐胁迫响应基因犌狊犘犐犘的
克隆及其序列分析
王希１，李勇，柏锡，才华，纪巍，朱延明
（东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨１５００３０）
摘要：盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素，野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料，是天然的优质
抗性基因库。本研究以耐盐东北野生大豆为试材，利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交
结果，对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫ＥＳＴ数据库中各ＥＳＴ在胁迫下的表达情况进行了分析，从中
选出了１个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的３′ＥＳＴ，序列分析表明该ＥＳＴ编码质膜结合蛋白（ｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＩＰ），属于主嵌入蛋白（ｍａｊｏｒｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＩＰ）家族；通过电子克隆和改进的５′
ＲＡＣＥ获得了基因完整的编码区；其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为９０％，将该基因命名为犌狊犘犐犘。
犌狊犘犐犘基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域，无信号肽，与已发现的植物ＰＩＰ蛋白一致。本
研究获得的基因具有自主知识产权，通过进一步的功能分析，可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源，并为植
物耐渗透胁迫机理研究提供依据。
关键词：野生大豆；盐胁迫；主嵌入蛋白（ＭＩＰ）；犌狊犘犐犘；５′ＲＡＣＥ
中图分类号：Ｓ５６５．１０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０１３１０９
高盐等非生物胁迫会限制植物生长，影响植物的产量和品质［１３］。通过基因工程手段改良植物的耐胁迫能力
已成为一种高效的途径［４，５］。寻找胁迫抗性基因是植物耐胁迫基因工程的首要任务。东北野生大豆（犌犾狔犮犻狀犲狊狅
犼犪）具有丰富的耐逆基因资源，其中的大部分基因尚未被克隆和分析，是克隆耐胁迫基因的理想材料。
主嵌入蛋白（ｍａｊｏｒｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＩＰ）旧称水通道蛋白（ｗａｔｅｒｃｈａｎｎｅｌｐｒｏｔｅｉｎ或ａｑｕａｐｏｒｉｎ，ＡＱＰ），主
要包括液泡膜结合蛋白（ｔｏｎｏｐｌａｓｔｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＴＩＰ）和质膜结合蛋白（ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，
ＰＩＰ）两大类。其中，ＰＩＰ控制着质膜内外的水分运输，从而参与植物的生长发育、形态保持、水分调节等多种过
程。目前，在多种植物中都已发现了 ＭＩＰ家族基因。植物的 ＭＩＰ控制着水分在膜上的快速运输，并可透过其他
小分子，在胁迫反应中有可能参与细胞的水分状态调节过程，以及某些小分子物质的区隔化过程［６１３］。
虽然关于 ＭＩＰ类蛋白质对植物的耐胁迫能力影响的研究较少，ＭＩＰ在植物胁迫反应中的具体功能尚不是很
清楚，但已有一些研究证明 ＭＩＰ基因在渗透胁迫后表达量上调，表明它们很可能参与植物的胁迫反应。Ｊａｎｇ
等［１４］对拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的研究结果显示，多个 ＭＩＰ基因都在胁迫后上调表达。Ｈｕ等［１５］从苹果
（犕犪犾狌狊狆狌犿犻犾犪）中分离了２个ＰＩＰ基因，其表达量在渗透胁迫下的茎中上调，可能在胁迫条件下水分动态平衡
的保持中起重要作用。Ｇｕｏ等［１６］分离了若干水稻ＰＩＰ基因，超量表达水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）ＰＩＰ基因的转基因拟
南芥对干旱胁迫和中等强度的盐胁迫的耐性有所提高。Ｊａｎｇ等［１７］将拟南芥ＰＩＰ基因转入拟南芥及烟草（犖犻犮
狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿），转基因植株对不同胁迫的反应发生了不同的变化。
东北农业大学植物生物工程研究室前期已建立了耐盐东北野生大豆的表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔａｇ，ＥＳＴ）库，并借助大豆基因表达分析芯片获得了该品种野生大豆在高盐、低温、干旱早期的基因表达谱［１８］。
本研究从中发现了１个在多种胁迫早期上调表达的ＰＩＰ类３′ＥＳＴ，通过电子延伸和５′ＲＡＣＥ克隆了其全长序
列，并通过生物信息学手段对获得的序列进行了分析，表明该基因与已知的ＰＩＰ基因在序列上有一定的差异，是
第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１３１－１３９
２０１１年２月
收稿日期：２０１００２１０；改回日期：２０１００５２４
基金项目：国家科技部重大基础研究前期研究专项（２００３ＣＣＡ０３５００），国家自然科学基金项目（３０４７１０５９）和国家高技术研究发展计划
（２００７ＡＡ１０Ｚ１９３）资助。
作者简介：王希（１９８４），女，黑龙江黑河人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｌａｇｏｗ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｍｚｈｕ２００１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
一个全新基因，具有潜在的抗性功能；通过后续的研究，分析基因在植物耐渗透胁迫反应中的作用及其调控机制，
将丰富耐胁迫分子育种的基因资源，并为植物耐胁迫机理的研究奠定理论基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
野生大豆品种为耐盐材料５０１０９。野生大豆盐胁迫ＥＳＴ数据库由东北农业大学植物生物工程研究室构建；
野生大豆在胁迫下的基因表达量通过与Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ大豆基因表达分析芯片杂交获得［１８］。大肠杆菌为ＤＨ５α。
常规化学试剂购自北京益利公司，分子生物学试剂购自Ｔａｋａｒａ公司，ＳＭＡＲＴ逆转录酶Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ购自Ｔａｋａ
ｒａＢＤ公司。
模板转换引物ＳＭＡＲＴⅣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ序列：
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＧ
根据模板转换引物设计的５′锚定引物（５′ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒｓ，５′ＡＰ）：
５′ＡＰ１：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ
５′ＡＰ２：ＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣ
５′ＡＰ３：ＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＧ
１．２ 渗透胁迫应答 ＭＩＰ类ＥＳＴ的筛选
利用Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ大豆芯片分析野生大豆ＥＳＴ在不同胁迫早期的表达变化情况，初步确定野生大豆中胁迫
早期（１ｈ）应答的ＥＳＴｓ；根据芯片探针的注释信息，对这些ＥＳＴ进行初步筛选，确定可能属于膜结合蛋白的
ＥＳＴｓ；再利用 ＴｒＥＭＢＬ／ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ和 ＧｅｎＢａｎｋ数据库，将这些ＥＳＴ序列在美国国立生物信息中心（Ｔｈｅ
ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）网站上利用“ＢｌａｓｔＸ”程序进行相似性比对，进一步推断
ＥＳＴ功能，确定候选的ＰＩＰ类ＥＳＴｓ。芯片杂交及ＥＳＴ库构建完成于２００５年［１８］，目的ＥＳＴ的筛选完成于２００６
年。
１．３ 目的基因／ＥＳＴ的序列分析
用目的序列利用“ＢｌａｓｔＸ”程序进行相似性比对，推断ＥＳＴ所代表基因的功能，并根据比对结果判断编码区
（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＤＳ）完整性。对于断定已包含完整ＣＤＳ的序列，用“ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ”程序再次分析开放读码框
（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）的完整性。
１．４ ＥＳＴ的电子延伸
用目的ＥＳＴ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的野生大豆ＥＳＴ利用ＢｌａｓｔＮ程序进行相似性比对，下载与之匹配的序列，
用ＤＮＡｍａｎ（Ｖｅｒ．６．０．４０，ＬｙｎｎｏｎＢｉｏｓｏｆｔ公司开发）的“ｓｅｑｕｅｎｃｅａｓｓｅｍｂｌｙ”工具进行序列拼接，导出拼接结
果，通过ＢｌａｓｔＸ程序进行相似性比对以判断ＣＤＳ完整性，若不完整，则再用最靠近ＣＤＳ末端的匹配序列与野生
大豆ＥＳＴｓ利用ＢｌａｓｔＮ程序再次比对，重复比对和拼接过程，直至不再有可延伸的匹配序列。按１．６所述方法
通过聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）及测序验证电子延伸的正确性。
１．５ ＲＡＣＥ及全长序列的获得
用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取经低温、高盐、干旱处理的野生大豆幼苗叶片总ＲＮＡ，通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测
ＲＮＡ质量。
根据目的基因已知序列设计基因特异引物（ｇｅｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ，ＧＳＰ），其中１条用于逆转录（称为ＧＳＰ
ＲＴ），２～４条用于巢式ＰＣＲ。引物设计位置应尽量靠近未知部分，但要保证ＲＡＣＥ所得片段中有足够长的已知
序列，以保证序列拼接的正确性。由于无法得知目的基因未知部分是否有引物的非特异性结合位点，因此通过预
备试验筛选出不发生严重单引物扩增的５′ＡＰ和ＧＳＰ。
以ＧＳＰＲＴ起始逆转录并在ｃＤＮＡ第一链上添加模板转换引物，再将各ＧＳＰ与不同的５′ＡＰ搭配，进行巢
式ＰＣＲ，扩增基因的未知片段。
从琼脂糖凝胶中回收ＰＣＲ产物条带，将回收产物与Ｔ载体连接，采用ＣａＣｌ２ 法［１９］制备并转化大肠杆菌感受
态细胞，用碱裂解法［１９］提取质粒ＤＮＡ，将重组质粒酶切鉴定结果正确的转化子菌液送交北京华大基因公司测
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序。每段序列至少测３个转化子，并进行双向测序。
根据ＲＡＣＥ所得片段的测序峰图，手动校正测序结果序列，并去除测序低质量区，用ＤＮＡｍａｎ将目的基因
已知部分与ＲＡＣＥ所得序列进行拼接，导出拼接结果。利用１．３所述方法分析测序结果中ＣＤＳ的完整性。通
过ＰＣＲ及测序验证拼接结果。
１．６ 通用模板的制备及序列拼接结果的ＰＣＲ验证
将野生大豆总ＲＮＡ以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物进行逆转录，在逆转录产物两端添加锚定引物序列，再用锚定引物
对逆转录产物进行长距离ＰＣＲ（ｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅＰＣＲ，ＬＤＰＣＲ）扩增，则产物包含样品中所有ｍＲＮＡ对应的全长
ｃＤＮＡ。将产物稀释１００倍作为通用模板ｃＤＮＡ （ｕｎｉｖｅｒｓａｌｃＤＮＡ），此通用模板用于对各步序列拼接结果进行
验证。
在拼接所得序列两端设计验证引物，对通用模板进行ＰＣＲ扩增，回收目的送交测序，每段序列至少测３个转
化子，并进行双向测序。利用１．３所述方法分析测序结果，以验证拼接结果、分析拼接所得序列中ＣＤＳ的完整
性、获得目的片段的确切序列。
以上各步骤涉及的具体操作方法参见文献［１９］。全长基因的克隆完成于２００９年。
１．７ 基因产物的生物信息学分析
利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ软件（Ｖｅｒ．５．０，ＰｒｅｍｉｅｒＢｉｏｓｏｆｔ开发）将目的基因ＣＤＳ翻译成蛋白质。
用目的基因氨基酸序列利用“ＢｌａｓｔＰ”程序进行相似性比对，下载与之匹配的氨基酸序列，用ＣｌｕｓｔａｌＸ软件
（Ｖｅｒ．１．８１，ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ开发）进行多重比对，用进化树表示目的基因编码产物与已知同
类蛋白质的序列相似性。
用ＤＮＡｍａｎ预测基因产物长度、分子量、等电点、亲／疏水性、跨膜结构域。
利用ＥＢＩ提供的整合了多个数据库的ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ工具，分析基因产物的保守结构域。
２ 结果与分析
２．１ 目的ＥＳＴ的确定及其电子克隆
２．１．１ ＰＴＥ１０２３的电子延伸 根据野生大豆ＥＳＴ的表达信息、相应芯片探针的注释信息，从野生大豆盐胁迫
ＥＳＴ库中筛选出了１个在低温、高盐和干旱３种胁迫下表达量均上调的ＥＳＴ，ＰＴＥ１０２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＴ０８４４１７．１），
相似性比对结果显示，该ＥＳＴ编码ＰＩＰ基因，包含基因ＣＤＳ的３′末端。目的基因可命名为犌狊犘犐犘。
为获得目的基因ＣＤＳ５′一侧的未知序列，以ＰＴＥ１０２３为种子序列进行了电子延伸。电子延伸在２轮后终
止，结果见图１。
经过电子延伸，获得了８６４ｂｐ的目的基因片段犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ。该片段与原ＥＳＴ序列相比，在３′端增加
了约９０ｂｐ，在５′端增加了约３５０ｂｐ，但仍未到达目的基因ＣＤＳ的５′末端。
图１ 犘犜犈１０２３的电子延伸结果
犉犻犵．１ 犐狀狊犻犾犻犮狅犲犾狅狀犵犪狋犻狅狀狅犳犘犜犈１０２３
Ｓ１：ｇｉ１２４９６７８８；Ｓ２：ｇｉ１８７２９８８１；Ｓ３：ｇｉ１８７２９７８５；Ｓ４：ｇｉ１２４８８８５９；Ｓ５：ｇｉ１８７２８６３１；Ｓ６：ＰＴＥ１０２３；Ｓ７：ｇｉ１２４９０７２５；Ｓ８：ｇｉ２６００４０１０
３３１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
２．１．２ 电子延伸结果的ＰＣＲ验证 为验证电子延伸
图２ 犌狊犘犐犘犈犆狅狀狋犻犵的犘犆犚验证结果
犉犻犵．２ 犞犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犌狊犘犐犘犈犆狅狀狋犻犵狑犻狋犺犘犆犚
Ｍ：ＤＬ２０００分子量标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：模板为水 Ｈ２Ｏａｓ
ｔｅｍｐｌａｔｅ；２：模板为通用模板ＵｎｉｖｅｒｓａｌｃＤＮＡａｓｔｅｍｐｌａｔｅ
结果的可靠性，根据犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ设计了验证引
物，扩增产物约为７５０ｂｐ。
用犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ的验证引物扩增通用模板，
得到了约７５０ｂｐ的目的条带，如图２所示。回收目的
条带并测序，将测序结果与原ＥＳＴ及犌狊犘犐犘ＥＣｏｎ
ｔｉｇ序列进行比对，结果见图３。
测序结果与电子延伸所得序列基本一致，仅有若
干处单碱基替换。表明电子延伸结果犌狊犘犐犘ＥＣｏｎ
ｔｉｇ确为野生大豆中真实存在的序列，且通过ＰＣＲ及
测序获得了其确切序列。犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ未到达目
的基因ＣＤＳ的５′末端，距５′末端约４２０ｂｐ，需要进行
５′ＲＡＣＥ以获得目的基因的全长编码区。
图３ 犌狊犘犐犘犈犆狅狀狋犻犵验证测序产物与犘犜犈１０２３的比对结果
犉犻犵．３ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犌狊犘犐犘犈犆狅狀狋犻犵狏犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犘犜犈１０２３
Ｓ１：犌狊犘犐犘Ｅｃｏｎｔｉｇ验证ＰＣＲｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犌狊犘犐犘Ｅｃｏｎｔｉｇ；Ｓ２：犌狊犘犐犘Ｅｃｏｎｔｉｇ；Ｓ３：上游验证引物
ＳｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒｏｆＰＣＲ；Ｓ４：下游验证引物ＡｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒｏｆＰＣＲ；Ｓ５：ＰＴＥ１０２３
２．２ 犌狊犘犐犘全长序列的获得
图４ 犌狊犘犐犘５′犚犃犆犈各轮半巢式犘犆犚结果
犉犻犵．４ 犚犲狊狌犾狋狊狅犳狀犲狊狋犲犱犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀狊狅犳犌狊犘犐犘５′犚犃犆犈
Ｍ：ＤＬ２０００分子量标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：引物为５′ＡＰ３５′ＡＰ３ａｓ
ｐｒｉｍｅｒ；２：引物为ＧＳＰ１ＧＳＰ１ａｓｐｒｉｍｅｒ；３：引物为ＧＳＰ１＋５′ＡＰ３
ＧＳＰ１＋５′ＡＰ３ａｓｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ；４：引物为ＧＳＰ２＋５′ＡＰ３ＧＳＰ２＋
５′ＡＰ３ａｓｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ；５：引物为ＧＳＰ４＋５′ＡＰ３ＧＳＰ４＋
５′ＡＰ３ａｓｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ
２．２．１ 通过５′ＲＡＣＥ获得未知部分序列 根据
犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ序 列 可 靠 部 分，设 计 了 用 于 ５′
ＲＡＣＥ的ＧＳＰ共５条，其中ＧＳＰＲＴ１条，用于巢式
ＰＣＲ的ＧＳＰ４条，按其结合位点距ＣＤＳ５′末端距离
由远到近，依次称为ＧＳＰ１～ＧＳＰ４。通过预备试验淘
汰了５′ＡＰ１、５′ＡＰ２和 ＧＳＰ３，将５′ＡＰ３与 ＧＳＰ１、
ＧＳＰ２、ＧＳＰ４搭配，通过半巢式ＰＣＲ进行了目的基因
的５′ＲＡＣＥ，各轮ＰＣＲ结果见图４。
根据引物设计位置及犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ序列分析
结果，从各轮ＰＣＲ所得条带长度上推断，各轮ＰＣＲ所
得的主带均为目的片段，且各对引物扩增所得的条带
已到达目的ＯＲＦ的５′末端。为得到较长序列以便于
ＲＡＣＥ后的序列拼接，回收了ＧＳＰ１＋５′ＡＰ３的扩增
产物送交测序。
２．２．２ 犌狊犘犐犘 全长序列的获得 犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ
序列与ＲＡＣＥ所得序列的拼接结果见图５，用拼接所
得序列进行相似性比对，结果见图６。
４３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
图５ 犌狊犘犐犘犚犃犆犈所得序列与电子克隆所得序列的拼接结果
犉犻犵．５ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狊狅犳犌狊犘犐犘犚犃犆犈狉犲狊狌犾狋犪狀犱犌狊犘犐犘犈犆狅狀狋犻犵
Ｓ１：犌狊犘犐犘ＥＣｏｎｔｉｇ验证结果Ｖｅｒｉｆｉｅｄ犌狊犘犐犘Ｅｃｏｎｔｉｇ；Ｓ２：ＲＡＣＥ所得序列ＲＡＣＥｒｅｓｕｌｔ；
Ｐ１：ＧＳＰ１；Ｐ２：ＧＳＰ２；Ｐ３：ＧＳＰ３；Ｐ４：ＧＳＰ４；Ｐ５：５′ＡＰ３
图６ 犌狊犘犐犘拼接所得序列的相似性比对结果
犉犻犵．６ 犜犺犲犅犾犪狊狋犡狉犲狊狌犾狋狊狅犳犌狊犘犐犘犪狊狊犲犿犫犾犲犱
相似性比对结果表明拼接所得序列包含目的基因
图７ 犌狊犘犐犘全长验证犘犆犚结果
犉犻犵．７ 犉狌犾犾犲狀犵狋犺狏犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犌狊犘犐犘狑犻狋犺犘犆犚
Ｍ：ＤＬ２０００分子量标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：模板为水 Ｈ２Ｏａｓ
ｔｅｍｐｌａｔｅ；２：模板为通用模板ＵｎｉｖｅｒｓａｌｃＤＮＡａｓｔｅｍｐｌａｔｅ
的完整ＣＤＳ，将该基因命名为犌狊犘犐犘。
在所预测的ＣＤＳ两端设计全长验证引物，通过
ＰＣＲ验证了ＲＡＣＥ结果的可靠性，扩增结果见图７。
回收了约１０００ｂｐ的目的条带，送交测序。
用犌狊犘犐犘全长验证ＰＣＲ产物的测序结果进行相
似性比对及开放读码框分析，结果见图８和９，表明经
电子延伸、５′ＲＡＣＥ和序列拼接已得到了犌狊犘犐犘 基
因的完整编码区序列，并通过全长验证ＰＣＲ获得了基
因的完整编码区片段及其确切序列。犌狊犘犐犘 基因编
码区序列的ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＦＪ８２５７６６。该基因编
码产物与已知的ＰＩＰ类基因所编码的氨基酸序列相
似度不超过９０％，是一个全新的基因。
２．３ 犌狊犘犐犘蛋白产物的生物信息学分析
将所得的犌狊犘犐犘ＯＲＦ序列翻译成蛋白质，对其
进行生物信息学分析，以分析蛋白产物ＧｓＰＩＰ的性质。
２．３．１ ＧｓＰＩＰ与已知 ＭＩＰ的比较 按１．７所述方法分析了ＧｓＰＩＰ与已知各 ＭＩＰ序列的相似性（图１０）。与
ＧｓＰＩＰ相似的ＰＩＰ大都属于ＰＩＰ２类，其中，相似性最高的３个序列均为豆科植物的ＰＩＰ，而相似性相对最低的是
玉米中的ＰＩＰ。
５３１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
图８ 犌狊犘犐犘全长验证所得序列的相似性比对结果
犉犻犵．８ 犅犾犪狊狋犡狅犳犌狊犘犐犘犳狌犾犾犲狀犵狋犺狏犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀
图９ 犌狊犘犐犘全长验证所得序列的开放读码框分析结果
犉犻犵．９ 犗犚犉犳犻狀犱犻狀犵狅犳犌狊犘犐犘犳狌犾犾犲狀犵狋犺狏犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀
２．３．２ ＧｓＰＩＰ蛋白的物理性质分析 根据ＤＮＡｍａｎ的分析结果，ＧｓＰＩＰ蛋白长度为２８４ａａ，分子量约３０３９４．６
Ｄａ，预测等电点为８．３１，具有６段高度疏水的跨膜区域。已发现的植物ＰＩＰ类基因的编码产物等电点大都在９
左右，只有水稻中的ＯｓＰＩＰ２２等电点约７．４９，大豆ＰＩＰ的等电点约８．２９。等电点的差异有可能使ＧｓＰＩＰ与其
他ＰＩＰ在功能或调控上存在差异。
２．３．３ ＧｓＰＩＰ保守结构域预测 利用ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ工具分析ＧｓＰＩＰ的结构域，结果见图１１。ＧｓＰＩＰ具有 ＭＩＰ
家族的保守结构域———６段跨膜结构（图中第２行），以及 ＭＩＰ保守序列ＮＰＡ盒（图中第６行），且不含信号肽，
均与已报道的ＰＩＰ类基因一致。
３ 讨论
近年来分子生物学与植物基因工程迅速发展，技术也日趋成熟，通过分子育种提高作物的胁迫耐性成为培育
耐逆作物品种的一种越来越有效的手段。然而，可用于作物耐胁迫基因工程的基因资源比较缺乏。获得充足的、
具有独立知识产权的基因资源，是进行作物分子育种的重要前提。植物对胁迫的耐受反应分子机制比较复杂，且
研究基础并不丰富，已知的能提高植物胁迫耐受性的基因种类非常有限，如何从大量的转录本中筛选出与胁迫关
系比较密切的基因，是基因资源挖掘中的一个关键问题。
本研究以具有丰富耐逆基因资源、且已有基因信息较少的耐盐东北野生大豆为试材，利用野生大豆与栽培大
豆进化上和序列上的同源性，借助商品化的大豆表达分析芯片分析野生大豆ＥＳＴ的表达情况，并选择在胁迫早
期表达量上调的ＰＩＰ基因进行了克隆和研究。本研究所获得的ＰＩＰ基因是一个全新的基因，具有独立知识产
权，且基因与胁迫有较密切的关系，很有可能提高转基因植物对胁迫的耐性。
３．１ ＧｓＰＩＰ在 ＭＩＰ蛋白家族中的地位
根据ＧｓＰＩＰ的ＥＳＴ序列及完整编码序列的相似性比对（ＢｌａｓｔＸ）结果，以及ＧｓＰＩＰ氨基酸序列的相似性比
对（ＢｌａｓｔＰ）结果，可确定编码产物属于 ＭＩＰ家族的ＰＩＰ类，即结合于原生质膜的水通道蛋白类。
ＧｓＰＩＰ与豆科植物ＰＩＰ氨基酸序列的相似性高于与禾本科植物ＰＩＰ的相似性，可见物种间该基因／蛋白质
序列的相似性与物种间的进化关系有一定的相关性。
６３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
图１０ 犌狊犘犐犘与已知 犕犐犘蛋白的进化树
犉犻犵．１０ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犌狊犘犐犘犪狀犱狅狋犺犲狉犕犐犘狊
ＧｍＡＱＰ：大豆水通道蛋白 犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓ｐｕｔａｔｉｖｅｗａｔｅｒｃｈａｎｎｅｌｐｒｏｔｅｉｎ；ＳｓＡＱＰ２：雨树 ＡＱＰ２犛犪犿犪狀犲犪狊犪犿犪狀ａｑｕａｐｏｒｉｎ；ＭｐＰＩＰ２；３：含羞草
ＰＩＰ２；３犕犻犿狅狊犪狆狌犱犻犮犪ＰＩＰ２；３；ＰｃＰＩＰ２２：西洋梨ＰＩＰ２２犘狔狉狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊ＰＩＰ２２；ＡｔＰＩＰ２；５：拟南芥ＰＩＰ２；５犃．狋犺犪犾犻犪狀犪ＰＩＰ２；５；ＶｖＰＩＰ２；４：葡萄
ＰＩＰ２；４犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪ＰＩＰ２；４；ＭｃＭｉｐＣ：冰叶午时花 ＭｉｐＣ犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿 ＭｉｐＣ；ＲｃＰＩＰ２１：山杜鹃 ＰＩＰ２１犚犺狅犱狅犱犲狀犱狉狅狀
犮犪狋犪狑犫犻犲狀狊犲ＰＩＰ２１；ＰｃＰＩＰ２１：西洋梨ＰＩＰ２１犘．犮狅犿犿狌狀犻狊ＰＩＰ２１；ＡｍＰＩＰ：黄芪ＰＩＰ犃狊狋狉犪犵犪犾狌狊犿犲犿犫狉犪狀犪犮犲狌狊ＰＩＰ；ＶｖＰＩＰ２；３：葡萄ＰＩＰ２；３犞．
狏犻狀犻犳犲狉犪ＰＩＰ２；３；ＭｔＭＩＰ：蒺藜苜蓿 ＭＩＰ犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪 ＭＩＰ；ＧｈＰＩＰ２：棉花ＰＩＰ２犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿 ＰＩＰ２；ＡｔＰＩＰ２Ａ：拟南芥ＰＩＰ２Ａ犃．
狋犺犪犾犻犪狀犪ＰＩＰ２Ａ；ＲｓＰＡＱ２：萝卜质膜水通道蛋白２犚犪狆犺犪狀狌狊狊犪狋犻狏狌狊ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅａｑｕａｐｏｒｉｎ２；ＢｎＰＩＰ１：油菜ＰＩＰ１犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊ＰＩＰ１；
ＲｓＰＩＰ２ｂ：萝卜ＰＩＰ２ｂ犚．狊犪狋犻狏狌狊ＰＩＰ２ｂ；ＲｓＰＩＰ２ｃ：萝卜ＰＩＰ２ｃ犚．狊犪狋犻狏狌狊ＰＩＰ２ｃ；ＢｎＰＩＰ２：油菜ＰＩＰ２犅．狀犪狆狌狊ＰＩＰ２；ＡｔＰＩＰ２Ｂ：拟南芥ＰＩＰ２Ｂ犃．
狋犺犪犾犻犪狀犪ＰＩＰ２Ｂ；ＡｔＰＩＰ２Ｃ：拟南芥ＰＩＰ２Ｃ犃．狋犺犪犾犻犪狀犪ＰＩＰ２Ｃ；ＮｇＰＩＰ２：粉蓝烟草ＰＩＰ２犖．犵犾犪狌犮犪ＰＩＰ２；ＭｃＭｉｐＨ：冰叶午时花ＭｉｐＨ犕．犮狉狔狊狋犪犾犾犻
狀狌犿 ＭｉｐＨ；ＡｃＡＱＰ２：桐花树ＡＱＰ２犃犲犵犻犮犲狉犪狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌犿 ＡＱＰ２；ＳｒＡＱＰ：甜叶菊ＡＱＰ犛狋犲狏犻犪狉犲犫犪狌犱犻犪狀犪ＡＱＰ；ＯｅＰＩＰ：橄榄ＰＩＰ犗犾犲犪犲狌狉狅狆犪犲犪
ＰＩＰ；ＶｖＰＩＰ２：葡萄ＰＩＰ２犞．狏犻狀犻犳犲狉犪ＰＩＰ２；ＪｒＰＩＰ２；２：胡桃ＰＩＰ２；２犑狌犵犾犪狀狊狉犲犵犻犪ＰＩＰ２；２；ＪｒＰＩＰ２；１：胡桃ＰＩＰ２；１犑．狉犲犵犻犪ＰＩＰ２；１；ＺｍＰＩＰ２１：玉
米ＰＩＰ２１犣．犿犪狔狊ＰＩＰ２１；ＺｍＰＩＰ２２：玉米ＰＩＰ２２犣．犿犪狔狊ＰＩＰ２２；ＺｍＰＩＰ２４：玉米ＰＩＰ２４犣．犿犪狔狊ＰＩＰ２４；ＺｍＰＩＰ２３：玉米ＰＩＰ２３犣．犿犪狔狊
ＰＩＰ２３
在许多植物中都存在不止一种ＰＩＰ，形成一个蛋白质亚家族；对于氨基酸序列相似性比对结果中的匹配序
列，不同的ＰＩＰ成员与ＧｓＰＩＰ均有一定相似性，且各成员与ＧｓＰＩＰ的相似程度差异并不大，又因物种而异。但
是，由于相似性最高的序列均属于豆科植物的ＰＩＰ２，因此可以初步断定本研究所获得的基因编码产物ＧｓＰＩＰ属
于ＰＩＰ亚家族中的ＰＩＰ２类。
３．２ 犌狊犘犐犘翻译产物的结构及物理性质
犌狊犘犐犘翻译产物ＧｓＰＩＰ具有ＭＩＰ家族的保守序列以及ＭＩＰ特征性的跨膜结构域，并且具有ＭＩＰ高度疏水
的性质。与同家族其他成员不同的是，ＧｓＰＩＰ的等电点比大部分已发现的植物ＰＩＰ蛋白偏低。ｐＨ会影响蛋白
质的构象和功能，且有研究表明水通道的开关受细胞内ｐＨ值的调节［２０］，因此等电点的差异表明，ＧｓＰＩＰ与其他
植物的ＰＩＰ在蛋白稳定性、功能或者调控方式上有可能有所差异。
７３１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
图１１ 犌狊犘犐犘的结构域分析结果
犉犻犵．１１ 犇狅犿犪犻狀狊狅犳犌狊犘犐犘狆狉犲犱犻犮狋犲犱犫狔犐狀狋犲狉犘狉狅犛犮犪狀
３．３ ＧｓＰＩＰ在耐胁迫分子育种及理论研究方面的应用前景
本研究所获得的基因编码产物ＧｓＰＩＰ属于 ＭＩＰ家族，该家族在水分的跨膜快速运输中起着重要作用，参与
植物的生长发育、形态保持、水分调节等多种过程［６１３］。
本研究所得基因为耐盐野生大豆中的胁迫诱导基因，且其编码产物本身的功能也与胁迫反应有相关性，因此
基因产物很可能会影响植物对胁迫的耐性。目前也有少数研究分析了 ＭＩＰ类基因对植物胁迫耐性的影响，不同
来源、不同类型的 ＭＩＰ基因，对植物在不同胁迫下反应的影响也不尽相同［１４１７］。野生大豆中功能已知的胁迫相
关基因数量非常有限，分析该基因对植物胁迫耐性的影响，有望为耐逆分子育种提供新的基因资源。
目前，植物的胁迫反应机制也尚未明确，胁迫的感知、传导、调控过程都有待研究。本研究所得基因的表达受
盐胁迫以及低温、干旱胁迫诱导，分析其上游序列有希望挖掘到对某种或多种渗透胁迫响应较快的启动子或顺式
作用元件。通过在体内瞬时表达，或分离蛋白进行体外试验，分析基因产物所受的修饰、降解等调控，有希望发现
参与胁迫响应过程的调控蛋白。进一步寻找与这些元件或蛋白互作的蛋白质，则可推断出一部分胁迫信号传导
通路，为植物胁迫反应的分子机理研究提供理论基础。
此外，还可借助这些调控序列及元件构建植物表达载体卡盒，使耐胁迫基因在转基因植物受到胁迫的早期即
迅速表达，以培育胁迫耐性较强的转基因植物品种（系），有助于植物耐渗透胁迫基因工程的研究。
４ 结论
本研究通过电子延伸和改进的５′ＲＡＣＥ，从耐盐东北野生大豆中获得了一个响应胁迫的质膜结合蛋白基因
犌狊犘犐犘，基因编码产物与已知的ＰＩＰ类蛋白的氨基酸序列相似度不超过９０％。基因的翻译产物具有 ＭＩＰ家族
特征性的跨膜结构域和疏水性质，无信号肽，与已发现的植物ＰＩＰ蛋白一致。生物信息学分析结果表明ＧｓＰＩＰ
蛋白长度为２８４ａａ，分子量约３０３９４．６Ｄａ，等电点约８．３１。ＧｓＰＩＰ是一个全新的基因，通过进一步的功能分析，
可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源，并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据。
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ｅｘｃｅｌｅｎｔｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｓｅｖｅｒａｌｋｉｎｄｓｏｆｓｔｒｅｓ
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ｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｇｅｎｅｃｈｉｐａｓｓａｙ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌ犌．狊狅犼犪ＥＳＴｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ，ａｎｄｏｎｅ３′ＥＳＴｉｎ
ｄｕｃｅｄｂｙｃｏｌｄ，ｈｉｇｈｓａｌｔａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｗａｓｃｈｏｓｅｎ．ＴｈｉｓＥＳＴｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓａｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏ
ｔｅｉｎ（ＰＩＰ）ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｍａｊｏｒｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＩＰ）ｆａｍｉｌｙ．ＡｃｏｍｐｌｅｔｅＣＤＳｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｓｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｗｉｔｈ５′ＲＡＣＥ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅｈａｓ９０％
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈａＰＩＰｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭｉｍｏｓａｐｕｄｉｃａａｎｄｗａｓｎａｍｅｄ犌狊犘犐犘．Ｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｈａｄｔｈｅｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｓｔｉｃｄｏｍａｉｎｏｆＭＩＰｂｕｔｈａｓｎｏｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ：ＴｈｉｓｉｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈＰＩＰｓｏｆｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ．Ｗｅｉｓｏｌａｔｅｄｔｈｅ
犌狊犘犐犘ｇｅｎｅｏｎｏｕｒｏｗｎａｎｄｗｅｈａｖｅａｌｉｎｔｅｌｅｃｔｕａｌｐｒｏｐｅｒｔｙｒｉｇｈｔｓ．Ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｃｏｍｅａｎｅｗｇｅｎｅｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ
ｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｆｕｒｔｈｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｗｏｕｌｄａｓｓｉｓｔｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｏｓ
ｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犌犾狔犮犻狀犲狊狅犼犪；ｓａｌｔｙｓｔｒｅｓｓ；ｍａｊｏｒｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＩＰ）；犌狊犘犐犘；５′ＲＡＣＥ
９３１第２０卷第１期 草业学报２０１１年