全 文 ：书两个高羊茅无性系的营养器官组织
培养及再生体系的建立
赵智燕，潘俊松，何亚丽，王琛，闫军辉
（上海交通大学农业与生物学院，上海２００２４０）
摘要：以２个高羊茅无性系上农矮生高羊茅（ＳＡＣＤ）和９８１９的幼穗、叶尖、幼茎和幼节等营养器官作为外植体，在
ＭＳ培养基上分别添加不同浓度的２，４二氯苯氧乙酸（２，４Ｄ），探索其对愈伤组织的诱导、继代和分化的最佳浓度，
以建立高羊茅无性系的高效再生体系。结果表明，幼穗是诱导愈伤组织的最好的营养器官外植体，出愈率最高达
９４％，而幼叶尖、幼茎、幼节则未能诱导出愈伤组织；不同浓度２，４Ｄ诱导愈伤组织的出愈率存在显著差异，最佳诱
导浓度范围为７～９ｍｇ／Ｌ，出愈率可以达８３％～９４％；２个无性系愈伤诱导率间有显著差异，但与２，４Ｄ浓度之间
的互作不显著；继代培养基以 ＭＳ加入２，４Ｄ４ｍｇ／Ｌ的处理方案最好，胚性愈伤组织出愈率和绿色芽点诱导率最
高，分别达到９８％和７８％，所得的胚性愈伤组织在 ＭＳ＋２，４Ｄ２ｍｇ／Ｌ＋６苄氨基嘌呤（６ＢＡ）１ｍｇ／Ｌ分化培养基
中的绿苗分化率较高，为５７％；生根培养基采用１／２ＭＳ＋α萘乙酸（ＮＡＡ）０．５ｍｇ／Ｌ，生根率达１００％。
关键词：高羊茅；无性系；营养器官；组织培养；再生体系
中图分类号：Ｑ９４５．３９；Ｓ５４３＋．９０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０５０１６８０８
高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）是一种多年生冷季型草坪草，具有耐寒、耐热、耐践踏、抗病力较强、夏季不休
眠等特点，在世界各国广泛应用。在我国长江中下游地区，如果管理得当，高羊茅能够建植周年常绿草坪。为了
改良高羊茅生长迅速需要频繁修剪，质地粗糙形态不美的不良特性，开展了形态育种，选得２个矮生、质地细腻的
无性系“上农矮生高羊茅（ＳＡＣＤ）”［１］和９８１９［２］。但是矮生品种（系）往往抗逆性不如普通类型品种，如果能通过
转抗病基因或与抗病相关的基因育种提高抗病性，则有可能解决矮生和质地细腻与抗性较弱的矛盾。高羊茅是
异花授粉植物，采用单株选择和优良单株混合繁殖的常规育种方法培育的品种易发生生物学混杂，新品种自推出
后使用５年左右即会被市场上新的品种淘汰。采用把优良单株扩大成无性系，多个形态相近而抗逆性不同的无
性系间自由授粉制种，得到的种子群体用于建植草坪，这种群体理论上不容易混杂退化，可以使用较长年限［２］。
如果把抗病基因或与抗病相关的基因转入矮生高羊茅无性系中，则有可能通过上述“无性系育种法”培育出抗性
得以提高的矮生高羊茅新品种。而要进行高羊茅无性系的遗传转化育种，首先需要建立高羊茅再生体系。
高羊茅组织培养方面的研究开始于２０世纪８０年代，最初的研究大多只是诱导获得愈伤组织，而未再生出植
株［３，４］。Ｄａｌｅ［５］从高羊茅的分生组织顶端培育出小植株。Ｌｏｗｅ和Ｃｏｎｇｅｒ［６］１９７９年从高羊茅成熟种子胚成功地
诱导出愈伤组织并得到再生植株。此后，随着研究的逐步深入，各种植株再生体系相继建立。已有的高羊茅再生
体系大多以种子为外植体建立［７，８］，但得到的最佳诱导愈伤组织的浓度随基因型、外植体和试验体系中处理浓度
的不同而异。也有研究以成熟胚［９］、幼胚［１０］、幼穗［１１，１２］、下胚轴［１３］、花梗组织［１４］或叶片基部切片［１５］为外植体，进
行再生体系的建立，有的已经得到转基因植株。支大英等［１３］用高羊茅下胚轴进行再生体系的建立，其愈伤组织
诱导率和分化率都很高；支月娥等［１１］以高羊茅幼穗为外植体进行愈伤诱导，并未得到再生植株。要保持无性系
的基因型与优良形态特征，必须采用其无性器官建立再生体系。鉴于此，本研究以自育的２个无性系的营养器官
为外植体材料，探索其高效再生体系的建立方法，为“无性系”的细胞突变体筛选和遗传转化奠定基础。
１６８－１７５
２００９年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第５期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
收稿日期：２００８１２１５；改回日期：２００９０１１９
基金项目：上海市农业委员会科技兴农重点攻关项目［沪农科攻字（２００６）第４５号］和国家科技部“十一五”科技支撑计划（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９４
６）资助。
作者简介：赵智燕（１９８２），女，山东胶州人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｚｈｉｙａｎ００９＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｅｙａｌｉ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
上农矮生高羊茅（ＳＡＣＤ）和９８１９两个无性系的植株，由本课题组自育自繁。分别取其幼穗、叶尖、幼茎和幼
节作为外植体。
１．２ 培养基
１．２．１ 诱导培养基 以高羊茅种子作为外植体进行愈伤诱导，常用的２，４二氯苯氧乙酸（２，４Ｄ）浓度处理有２，
５，９ｍｇ／Ｌ，试验结果证实诱导愈伤组织的最佳浓度为９ｍｇ／Ｌ［１６～２０］。也有人以 ＭＳ中添加２，４，６，８，１０ｍｇ／Ｌ２，
４Ｄ为试验方案，得出８ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ为最佳的愈伤组织的诱导培养基［２１］。不同基因型愈伤诱导的适宜２，４Ｄ浓
度不同［１０］。那么高于９ｍｇ／Ｌ的２，４Ｄ对愈伤组织的诱导效应又如何？本研究要进行遗传转化育种的对象
“ＳＡＣＤ”和 “９８１９”两个无性系不同外植体愈伤诱导的适宜２，４Ｄ浓度又是多少？为了回答这个问题，以水平间
距为１ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ，设计了在 ＭＳ培养基中添加０，１，…，１１ｍｇ／Ｌ的２，４Ｄ浓度共１２个处理，以求证诱导愈伤
组织的最佳２，４Ｄ浓度。
１．２．２ 继代培养基 在对高羊茅种子诱导的愈伤组织的继代培养试验中，根据前人对香根草组织培养试验中设
置的处理和结果［２２］，对处理的设置作了改进，采用２，４Ｄ３个浓度（２．０，４．５，９．０ｍｇ／Ｌ）和６苄氨基嘌呤（６ＢＡ）
３个浓度（０，１，２ｍｇ／Ｌ）的均衡搭配和全面实施的９个处理组合，试验筛选出以２，４Ｄ４．５ｍｇ／Ｌ和６ＢＡ０ｍｇ／Ｌ
的处理组合所得胚性愈伤组织最多。以此为基础，在对幼穗诱导的愈伤组织继代时，进一步细化２，４Ｄ浓度处
理，以４．５ｍｇ／Ｌ为中心水平，以０．５ｍｇ／Ｌ为水平间距，设置了２，４Ｄ５个浓度（３．５，４．０，４．５，５．０，５．５ｍｇ／Ｌ）处
理，从中筛选最佳的继代培养基中的２，４Ｄ浓度。
１．２．３ 分化培养基 在对高羊茅种子诱导的愈伤组织的继代培养试验（见１．２．２）中还发现 ＭＳ中添加２，４Ｄ２
ｍｇ／Ｌ和６ＢＡ１ｍｇ／Ｌ的处理上出苗率最高，故本试验中以此作为分化培养基。
１．２．４ 生根培养基 采用已报道［１６］的配方：１／２ＭＳ培养基＋α萘乙酸（ＮＡＡ）０．５ｍｇ／Ｌ。
１．３ 试验方法
１．３．１ 材料消毒 ２００８年３月２０日至４月１５日期间，从田间取回的孕穗期植株中剥出幼茎和幼穗，去离子水
浸泡０．５ｈ，饱和次氯酸钠消毒１０ｍｉｎ，７０％乙醇消毒１～２ｍｉｎ，无菌水冲洗５～６次，在超净工作台上晾干备用。
１．３．２ 愈伤组织诱导 将晾干的高羊茅幼穗切成０．５ｃｍ左右的小段，接种在各处理的诱导培养基上。接入每
个锥形瓶外植体数为２０个。试验１以“ＳＡＣＤ”和“９８１９”两个无性系的幼穗为外植体材料，每处理组合重复２
次，完全随机试验设计。试验２以“ＳＡＣＤ”的幼穗为外植体材料，每处理重复２次，随机完全区组试验设计。接
种后置于特制的组培架上，于（２５±２）℃下暗培养２８ｄ后，转入继代培养基前统计出愈率。
１．３．３ 愈伤组织继代 以“ＳＡＣＤ”幼穗外植体诱导出的愈伤组织为材料，在其诱导约２８ｄ后，待愈伤组织长到
直径２～３ｍｍ，及时剥离愈伤组织，转到含有不同浓度２，４Ｄ的继代培养基上。每瓶随机接种愈伤组织１５～２５
块，每处理重复３次，随机完全区组试验设计。于４０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）光合有效辐射（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｙａｃｔｉｖｅｒａ
ｄｉａｔｉｏｎ，ＰＡＲ）１０ｈ／ｄ和２５℃下继代培养约２８ｄ后，转入分化培养基前统计胚性愈伤出愈率和绿芽点（图１）诱导
率。
１．３．４ 愈伤组织分化 继代培养约２８ｄ后待愈伤组织呈结构致密、颗粒状、淡黄色的时候，按继代处理分别转
入同一种分化培养基上。每继代处理接种６瓶（重复６次），每瓶接种５块，随机完全区组试验设计。在与继代培
养相同的条件下培养１４ｄ后出现绿芽，培养３０～３５ｄ形成无根幼苗（图２），统计分化率。
１．３．５ 生根和移栽 将幼苗转移至生根培养基培养２０～３０ｄ后有大量不定根产生，打开瓶盖炼苗３ｄ后移栽
到装有营养土的盆钵中，置于温室内栽培３０ｄ后，移栽到大田。
１．４ 数据统计与分析
诱导率＝长出愈伤组织的外植体数÷进行愈伤组织诱导的外植体数×１００％
胚性愈伤组织出愈率＝形成胚性愈伤的愈伤块数÷进行继代的愈伤组织块数×１００％
绿色芽点的诱导率＝形成绿色芽点的愈伤块数÷进行继代的愈伤块数×１００％
分化率＝出苗的愈伤组织块数÷进行分化的愈伤组织块数×１００％
生根率＝生根的苗数÷进行生根试验的苗数×１００％
９６１第１８卷第５期 草业学报２００９年
对于上述属于二项分布的所有试验数据的百分
图１ 在 犕犛＋２，４犇４犿犵／犔继代培养基上
产生绿色芽点的愈伤组织
犉犻犵．１ 犌狉犲犲狀犫狌犱狊狆狅狋狊狅狀狊狌犫犮狌犾狋狌狉犲犿犲犱犻狌犿
狅犳犕犛＋２，４犇４犿犵／犔
图２ ２，４犇５．５犿犵／犔继代培养基上诱导的愈伤组织在
分化培养基 （犕犛＋２，４犇２犿犵／犔＋６犅犃１犿犵／犔）
上分化的绿苗
犉犻犵．２ 犌狉犲犲狀狆犾犪狀狋犾犲狋狊犵犲狀犲狉犪狋犲犱犳狉狅犿犲犿犫狉狔狅犵犲狀犻犮犮犪犾狌狊犻狀犱狌犮犲犱
狅狀狊狌犫犮狌犾狋狌狉犲犿犲犱犻狌犿狅犳犕犛＋２，４犇５．５犿犵／犔狅狀狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀
犿犲犱犻狌犿狅犳犕犛＋２，４犇２犿犵／犔＋６犅犃１犿犵／犔
率（ｐ）资料，因原始数据中有＜３０％和＞７０％的观察
值，根据方差分析的基本假定与数据转换方法，采用
了反正弦数据转换［ａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２］［２３］。采用转换后
数据进行方差分析和平均数的最小显著差数（ＬＳＤ）
法多重比较。最后将各处理的反正弦转换数据的平
均数再转回百分率数据，便于阅读理解。
２ 结果与分析
２．１ ２，４Ｄ浓度对愈伤组织诱导率的影响
试验１，以２个无性系的幼穗为外植体分别在
ＭＳ中添加了０，１，…，１１ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ（１２个不同浓
度）的培养基中进行愈伤组织的诱导。方差分析结
果表明，不同２，４Ｄ浓度间和不同无性系之间出愈
率存在显著差异，但无性系与２，４Ｄ浓度之间的互
作不显著。ＳＡＣＤ 无性系的愈伤诱导率平均为
７１％，比９８１９无性系的平均出愈率显著高出１３％。
对不同２，４Ｄ浓度处理的愈伤组织诱导率间进行差
异显著性检验结果（图３Ａ）表明，不添加外源激素
（２，４Ｄ０ｍｇ／Ｌ）的ＭＳ基本培养基上没有愈伤组织
的生成，随着２，４Ｄ浓度从１ｍｇ／Ｌ增加至８ｍｇ／
Ｌ，出愈率不断提高，从９ｍｇ／Ｌ开始出愈率逐渐下
降，而在４～１０ｍｇ／Ｌ的浓度处理间并没有显著差
异，２无性系的平均愈伤诱导率为７０％～８７％。
试验２仅以ＳＡＣＤ无性系的幼穗为外植体材
料，进一步验证最佳的２，４Ｄ浓度。结果也表明，不
同２，４Ｄ浓度处理之间存在显著差异，处理平均数
的多重比较结果（图３Ｂ）表明从７～９ｍｇ／Ｌ都属于
较好的浓度处理，愈伤组织诱导率为９０％～９４％，
相互之间没有显著差异，其中８ｍｇ／Ｌ的处理愈伤
组织诱导率最高为９４％。
结合试验１和试验２的分析结果（图３）可知
ＳＡＣＤ和９８１９两个无性系幼穗最佳的诱导愈伤组
织的２，４Ｄ浓度是在 ＭＳ培养基中添加７～９ｍｇ／Ｌ，愈伤组织诱导率为８３％～９４％。
以２个无性系的叶尖、幼茎、和幼节等营养组织或器官作为外植体，采用上述的诱导培养基和培养条件，未能
获得愈伤组织。
２．２ 不同２，４Ｄ浓度对继代培养中胚性愈伤组织出愈率和绿芽点诱导率的影响
将ＳＡＣＤ的幼穗诱导所得的愈伤组织，转移到含有不同浓度２，４Ｄ的 ＭＳ继代培养基上，光照条件下培养
２８ｄ后统计其胚性愈伤组织的出愈率。方差分析结果表明不同处理之间存在显著差异。平均数的比较结果（图
４Ａ）表明３．５与４．０ｍｇ／Ｌ的处理所得胚性愈伤组织出愈率分别达到８５％和９８％，彼此间没有显著差异，二者都
显著高于４．５ｍｇ／Ｌ及以上浓度的处理。愈伤组织在继代过程中，除了形成胚性愈伤组织之外，也会生出一些绿
色的芽点（图１），这些芽点以后会长成绿色植株。对不同浓度２，４Ｄ继代过程中生成的芽点进行了统计分析，方
差分析表明不同处理之间存在显著差异。平均数的比较结果（图４Ｂ）表明４ｍｇ／Ｌ的处理所得绿芽点诱导率最
高，可以达到７８％，其余处理之间的绿芽点诱导率没有显著差异，从２９％～３９％不等。
０７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
图３ 高羊茅２个无性系（犛犃犆犇犪狀犱９８１９）（犃）与１个无性系（犛犃犆犇）（犅）幼穗外植体在 犕犛培养基中
不同的２，４犇浓度下愈伤诱导率（狆）的反正弦转换值平均数的差异显著性
犉犻犵．３ 犛犻犵狀犻犳犻犮犪狀犮犲狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀犮犲狅犳犿犲犪狀狊狅犳犪狉犮狊犻狀（狆）１／２狅犳犮犪犾狌狊犻狀犱狌犮狋犻狅狀狉犪狋犲（狆）犪狏犲狉犪犵犲犱犻狀狋狑狅犮犾狅狀犲狊
（犛犃犆犇犪狀犱９８１９）（犃）犪狀犱狅狀犲犮犾狅狀犲（犛犃犆犇）（犅）犻狀犕犛犿犲犱犻狌犿狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋
２，４犇犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狌狊犻狀犵犻犿犿犪狋狌狉犲犻狀犳犾狅狉犲狊犮犲狀犮犲犪狊犲狓狆犾犪狀狋狊
无性系与２，４Ｄ浓度间互作效应不显著（Ａ）；图内的线条长度为最小显著差数ＬＳＤ０．０５；不同字母标记的平均数间有显著差异；曲线下方的数据为
反正弦转换值平均数的返回尺度———愈伤诱导百分率Ｔｈｅｒｅｉｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃｌｏｎｅｓａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ２，４Ｄ（Ａ）；ｔｈｅｂａｒｒｅ
ｐｒｅｓｅｎｔｓＬＳＤ０．０５；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｍｅａｎｓｏｆａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２ｏｆ２，４Ｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ；Ｄａｔａｕｎｄｅｒｔｈｅｃｕｒｖｅｓａｒｅｐｅｒｃｅｎｔａ
ｇｅｓｏｆｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍｍｅａｎｓｏｆａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２
图４ 犛犃犆犇无性系愈伤组织在添加不同浓度２，４犇的 犕犛培养基中继代胚性愈伤组织
诱导率（狆）（犃）和绿色芽点的诱导率（狆）（犅）反正弦转换值平均数的差异显著性
犉犻犵．４ 犛犻犵狀犻犳犻犮犪狀犮犲狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀犮犲狅犳犿犲犪狀狊狅犳犪狉犮狊犻狀（狆）１／２狅犳犲犿犫狉狔狅犵犲狀犻犮犮犪犾狌狊犻狀犱狌犮狋犻狅狀狉犪狋犲（狆）（犃）犪狀犱
犵狉犲犲狀犫狌犱狊狆狅狋狊犻狀犱狌犮狋犻狅狀狉犪狋犲（狆）（犅）犻狀犕犛犿犲犱犻狌犿狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊
狅犳２，４犇犳狅狉犮犪犾狌狊狊狌犫犮狌犾狋狌狉犲犻狀犆犾狅狀犲犛犃犆犇
图内的线条长度为最小显著差数ＬＳＤ０．０５；不同字母标记的反正弦转换平均数间有显著差异；柱中的数据为反正弦转换值平均数的返回尺度胚性
愈伤组织诱导百分率（Ａ）和绿色芽点的诱导百分率（Ｂ）ＴｈｅｂａｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＬＳＤ０．０５；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｍｅａｎｓｏｆａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２ｏｆ２，４Ｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ；Ｄａｔａｉｎｃｏｌｕｍｎｓａｒｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（Ａ）ａｎｄｇｒｅｅｎｂｕｄｓｐｏｔｓ（Ｂ）ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍ
ｍｅａｎｓｏｆａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２
２．３ 不同浓度２，４Ｄ继代后对在分化培养基上绿苗和白苗分化率的影响
把不同继代培养基上培养的胚性愈伤组织转入分化培养基（ＭＳ＋２，４Ｄ２ｍｇ／Ｌ＋６ＢＡ１ｍｇ／Ｌ），光照培养
１７１第１８卷第５期 草业学报２００９年
２８ｄ后，考察幼苗的分化率。方差分析结果表明，不同继代培养基上所得的胚性愈伤组织在同一种分化培养基
上的绿苗（图２）与白化苗的分化率之间仍然有着显著差异。平均数的比较结果表明，继代培养基中含２，４Ｄ５．５
ｍｇ／Ｌ的处理上形成的胚性愈伤组织在分化培养基中的绿苗分化率最高（图５Ａ），达到６８％，显著高于３．５，４．５，
５．０ｍｇ／Ｌ的２，４Ｄ处理，但与４ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ浓度间又未见有显著差异；３．５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ浓度下的白化苗分化
比例最高，显著高于４．０，４．５，５．５ｍｇ／Ｌ的处理，但与５ｍｇ／Ｌ处理间又没有了显著差异（图５Ｂ）。综合图５结果
可见：４ｍｇ／Ｌ的２，４Ｄ处理有较高的绿苗分化率（５７％），其与最高的绿苗分化率间显著不差异（图５Ａ），同时它
也具有较低的白苗分化率（６％），显著低于５．０和３．５ｍｇ／Ｌ的２，４Ｄ处理（图５Ｂ）；似乎在继代培养基中较高浓
度（５．５ｍｇ／Ｌ）２，４Ｄ下诱导的胚性愈伤组织在分化培养基上易分化正常绿苗，而继代培养基中较低浓度（３．５
ｍｇ／Ｌ）２，４Ｄ下诱导的胚性愈伤组织在分化培养基上易分化成不正常的白苗。由于本试验中绿苗、白苗分化率
没能与继代培养基中２，４Ｄ浓度梯度间形成协同变异的趋势规律，还有待进一步的试验加以验证。
图５ 犛犃犆犇无性系在含有不同浓度２，４犇的 犕犛培养基中继代培养产生的胚性愈伤组织在“犕犛＋２，４犇２犿犵／犔＋
６犅犃１犿犵／犔”分化培养基上的绿苗分化率（狆）（犃）和白苗分化率（狆）（犅）反正弦转换值平均数的差异显著性
犉犻犵．５ 犛犻犵狀犻犳犻犮犪狀犮犲狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀犮犲狅犳犿犲犪狀狊狅犳犪狉犮狊犻狀（狆）１／２狅犳犵狉犲犲狀狆犾犪狀狋狊狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狉犪狋犲（狆）（犃）犪狀犱犪犾犫犻狀狅
狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狉犪狋犲（狆）（犅）犳狅狉犲犿犫狉狔狅犵犲狀犻犮犮犪犾狌狊犻狀犱狌犮犲犱犻狀犕犛狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳２，４犇犱狌狉犻狀犵
犮犪犾狌狊狊狌犫犮狌犾狋狌狉犲犻狀狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犿犲犱犻狌犿狅犳“犕犛＋２，４犇２犿犵／犔＋６犅犃１犿犵／犔”犻狀犆犾狅狀犲犛犃犆犇
图内的线条长度为最小显著差数ＬＳＤ０．０５；不同字母标记的平均数间有显著差异；柱中数据为反正弦转换值平均数的返回尺度－绿苗分化百分率
（Ａ）和白苗分化百分率（Ｂ）ＴｈｅｂａｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＬＳＤ０．０５；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｍｅａｎｓｏｆａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２ｏｆ２，４Ｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｌｙ；Ｄａｔａｉｎｃｏｌｕｍｎｓａｒｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｏｆｇｒｅｅｎ（Ａ）ａｎｄａｌｂｉｎｏ（Ｂ）ｐｌａｎｔｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍｍｅａｎｏｆａｒｃｓｉｎ（ｐ）１／２
２．４ 生根培养
采用已报道的“１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ”生根培养基对分化的无根绿苗进行培养，生根率达到１００％，因此
没有必要再对生根培养基进行进一步的研究。
３ 讨论
３．１ 外植体
试验材料ＳＡＣＤ和９８１９是采用单株分株繁殖而来的矮生高羊茅无性系。为了进一步改良它们的抗病能
力，就要利用植株的营养组织或器官，建立高效再生体系，为后续遗传转化打好基础。对于双子叶植物，如菊花
（犇犲狀犱狉犪狀狋犺犲犿犪犿狅狉犻犳狅犾犻狌犿）的花蕾［２４］、野葛（犘狌犲狉犪狉犻犪犾狅犫犪狋犪）的子叶［２５］、芦荟（犃犾狅犲狏犲狉犪）的茎段［２６］或苹果
（犕犪犾狌狊狆狌犿犻犾犪）树的茎尖［２７］等都是人们在组织培养过程中常用的营养器官外植体，人们利用这些外植体都实现
了快繁的目的。本试验先后尝试了以幼穗、叶尖、幼茎和幼节作为外植体的再生体系的建立，但最终成功的只有
幼穗。这可能是由于幼穗处于细胞的快速生长和分化阶段，组织内有较高的激素含量，促进了细胞的分裂和生
长，有利于愈伤组织的生成。
２７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
虽然幼穗是很好的营养器官外植体材料，但在自然生长条件下孕穗至抽穗阶段的持续日较少（高羊茅为１５
～２０ｄ），因此取材培养工作十分紧张，不便于周年进行组培工作。虽然可以通过不同光照时数处理调节孕穗与
抽穗期，但要耗费较多的人力与物力。如何保存高羊茅孕穗期的幼穗活力，值得探索。
３．２ 诱导培养基
小麦幼穗组织培养的技术研究较多，分别从不同基因型［２８，２９］、添加不同激素种类和浓度［３０～３２］、以及不同蔗糖
浓度［３０］造成的影响等方面进行了研究。不同基因型的小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）幼穗愈伤组织诱导出愈率差异
不大，但是分化率却差异显著［２９］，４．５ｍｇ／Ｌ的２，４Ｄ诱导小麦幼穗的出愈率是１００％［３２］，而蔗糖浓度在２．５％～
５．５％的范围内，随着其浓度的增加，胚性愈伤组织的形成率也随之提高［３０］。高羊茅作为禾本科植物，其组织培
养难度较大。支月娥等［１１］以幼穗等作为外植体进行愈伤诱导，在４种培养基中进行筛选，得到最佳诱导培养基
为 ＭＳ＋２，４Ｄ２ｍｇ／Ｌ，幼穗的愈伤组织出愈率为４５％。本试验研究了２，４Ｄ在（０～１１ｍｇ／Ｌ）１２个不同浓度中
的出愈率，得到最佳浓度为７～９ｍｇ／Ｌ，出愈率达到８３％～９４％，比已报道［１１］的愈伤诱导率高出３８％～４９％；而
在同样的２，４Ｄ２ｍｇ／Ｌ中的出愈率，本研究的结果为６１％～６５％，比支月娥等［１１］在同样浓度下得到的愈伤诱导
率高出１６％～２０％。虽然对 ＭＳ中不同２，４Ｄ浓度对高羊茅幼穗的愈伤组织出愈率影响已经有了较全面的研
究，但诱导愈伤的培养基组分与继代培养基组分对于绿色芽点的诱导是否存在互作效应也还值得进一步的探索。
３．３ 继代培养基
对愈伤组织的继代培养的目的，除了要将愈伤组织扩繁外，还在于将非胚性愈伤转为胚性愈伤组织。余桂红
等［３３］将种子诱导得到的愈伤组织转移到继代基本培养基（ＭＳ＋２，４Ｄ５ｍｇ／Ｌ）上，以水晶洋菜３ｇ代替琼脂７
ｇ，愈伤组织可以生长很快，且经过３０ｄ培养可以转化为具有分化能力的胚性愈伤组织。有研究表明，在继代培
养过程中加入硫酸铜有利于胚性愈伤组织形成［１８，３４］。在继代培养基中添加硫酸铜２．５ｍｇ／Ｌ，所得的胚性愈伤
组织频率在继代５次后仍然可以达到１５．５％～３２．６％，不同品种间存在差异，但都显著高于同品种不添加硫酸
铜的处理方案［３４］。将蔗糖浓度增加到６０ｇ／Ｌ，不但有利于胚性愈伤组织形成，且可以继代５次后还具有较高的
继代频率（１３．３％～２７．９％）［３４］。本研究进行的最佳继代培养基的筛选，最终结果是继代培养基以２，４Ｄ４ｍｇ／Ｌ
为最佳继代培养基，胚性愈伤组织扩增率达９８％，绿芽点诱导率达７８％，其在分化培养基上分化的绿苗（５７％）和
白苗率（５％）与分化的最佳处理（继代培养基中添加２，４Ｄ５．５ｍｇ／Ｌ，绿苗分化率为６８％，白苗分化率为１％）之
间并未见显著差异。Ｃｈｏ等［３５］将由高羊茅种子诱导得到的胚性愈伤组织诱导产生的高频再生组织（具有多个淡
绿点的芽分生组织样的结构），培养４～５个月后作为受体，获得了转基因植株。因此认为本研究中的胚性愈伤组
织上的绿色芽点应该属于这种高频再生组织，有利于后续转化。
在本研究的继代培养基筛选过程只完成了由非胚性愈伤到胚性愈伤的转化及胚性愈伤组织的扩增，并没解
决可以将胚性愈伤组织长期保存而分化率基本不衰退的问题。这就要求进一步研究如何将胚性愈伤长时间保
存，而不影响其分化的频率，以便于后续转基因工作的准备与实施。
３．４ 分化培养基
在分化过程中有少量白化苗出现，这是高羊茅组培过程中比较普遍的一个问题。韩晓光等［３６］以下胚轴为外
植体做耐盐性筛选，最终得分化率仅为７．５％，其中６４．１％为白化苗。吕晓波等［３７］对水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）组织培
养得到的白化苗进行了电镜扫描，其结果是有质体形成，但内部结构不完整，说明造成白苗的直接原因是叶绿素
不能正常合成。白化苗由于不能进行正常光合作用，不能生长，开花，结实，所以建立再生体系时要尽量减少白化
苗的分化频率。本研究继代培养基中不同２，４Ｄ浓度下培养的胚性愈伤组织在分化培养基中的分化结果，似乎
继代培养基中较高浓度（５．５ｍｇ／Ｌ）２，４Ｄ下诱导的胚性愈伤组织在本研究特定的分化培养基上有利于分化正
常绿苗，而较低浓度（３．５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ）易分化成不正常的白苗。
本研究显示继代培养基中２，４Ｄ浓度与分化培养基中的组分与浓度似乎存在互作，有待进一步的研究加以
揭示。提高绿苗分化率和降低白苗分化率的组培技术也有待于进一步的探索。
３．５ 结论
高羊茅幼穗是营养组织与器官中最好的诱导愈伤组织外植体。ＭＳ培养基中添加７～９ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ对２个
３７１第１８卷第５期 草业学报２００９年
无性系幼穗诱导愈伤组织的效果最好，诱导率达到８３％～９４％。ＭＳ培养基中添加４ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ对愈伤组织继
代的效果较好，胚性愈伤组织的出愈率达到９８％，绿芽点的诱导率达７８％。继代培养基中２，４Ｄ浓度对在分化
培养基上绿苗与白苗的分化率有显著影响，仍以４ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ处理较好。
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犜犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱狆犾犪狀狋犾犲狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犳狉狅犿狏犲犵犲狋犪狋犻狏犲狅狉犵犪狀狊狅犳狋狑狅
犮犾狅狀犲狊狅犳狋犪犾犳犲狊犮狌犲（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）
ＺＨＡＯＺｈｉｙａｎ，ＰＡＮＪｕｎｓｏｎｇ，ＨＥＹａｌｉ，ＷＡＮＧＣｈｅｎ，ＹＡＮＪｕｎｈｕｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏＴｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎａｎｅｆｆｏｒｔｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆａｔａｌｆｅｓｃｕｅ（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ２，４Ｄｏｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｕｓｉｎｇｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ，ｌｅａｆ
ｔｉｐｓ，ｙｏｕｎｇｓｔｅｍｓ，ａｎｄｙｏｕｎｇｎｏｄｅｓａｓｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｔｗｏｃｌｏｎｅｓ（ＳＡＣＤａｎｄ９８１９），ｗｈｉｃｈａｒｅｓｅｌｆｂｒｅｄｄｗａｒｆ
ｃｌｏｎｅｓｏｆｔａｌｆｅｓｃｕｅｗｅｒｅｕｓｅｄ．Ｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｗｅｒｅｔｈｅｂｅｓｔｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｏｒｇａｎｆｏｒｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，
ｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ９４％．Ｆｏｒｔｉｐｓｏｆｌｅａｖｅｓ，ｓｔｅｍｓａｎｄｎｏｄｅｓ，ｔｈｅｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓ
０％；ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２，４Ｄｗａｓｆｒｏｍ７ｔｏ９ｍｇ／ＬｉｎＭＳｗｉｔｈａｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ８３％ｔｏ
９４％．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｅｓｔｅｄｃｌｏｎｅｓｂｕｔｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ２，４Ｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｃｌｏｎｅｓｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆ２，４Ｄ４ｍｇ／ＬｉｎＭＳｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅ（９８％），ｈｉｇｈｅｓｔｇｒｅｅｎｓｐｏｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅ（７８％）ｄｕｒｉｎｇｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，
ａｎｄｈｉｇｈｇｒｅｅｎｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅ（５７％）ｉｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｏｆ“ＭＳ＋２，４Ｄ２ｍｇ／Ｌ＋６ＢＡ１ｍｇ／Ｌ”．
Ｔｈｅｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍｕｓｅｄ（“１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ”），ｇａｖｅａｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅｏｆ１００％．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔａｌｆｅｓｃｕｅ；ｃｌｏｎｅ；ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｏｒｇａｎ；ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
５７１第１８卷第５期 草业学报２００９年