全 文 ：林业科学研究　２０１６，２９（３）：４１３ ４１７
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
　　文章编号：１００１１４９８（２０１６）０３０４１３０５
白蜡虫雄虫真蛹转录组分析
于淑惠，亓　倩，孙　涛，王雪庆，杨　璞，冯　颖
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明　６５０２２４）
收稿日期：２０１６０１１８
基金项目：云南省应用基础研究重点项目（２０１３ＦＡ０５２）；林业公益性行业科研专项（２０１３０４８０８、２０１５０４３０２）；国家自然科学基金
（３１５７２３３７）；国家８６３计划（２０１４ＡＡ０２１８０１）
作者简介：于淑惠（１９８４—），女，博士研究生，主要从事分子生物学、森林保护研究．
 通讯作者：杨　璞，副研究员．
摘要：［目的］蛹期对于白蜡虫雄虫发育和交配具有重要意义，但目前缺乏对于白蜡虫真蛹基因转录情况的分析，本
研究旨在获得白蜡虫真蛹转录组数据，了解其转录组特征。［方法］采用ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００进行高通量测序，并进
行生物信息学分析；采用荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）检测３个热激蛋白基因（ｈｓｐ）在不同虫态中的表达动态。［结果］
共获得６３９５７条ｕｎｉｇｅｎｅ、６３２７２个开放阅读框（ＯＲＦ）、９５６１个ＳＳＲ分子标记，ｕｎｉｇｅｎｅ平均长度６７４ｂｐ，共有１４３２７
条ｕｎｉｇｅｎｅ获得了注释，ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）注释和 ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）注释分析表明，
很多基因参与的功能与白蜡虫蛹期的生理特征吻合。［结论］该转录组数据为白蜡虫基因功能鉴定和蛋白组学分
析研究奠定了数据基础。
关键词：白蜡虫；蛹；转录组；ｕｎｉｇｅｎｅ；热激蛋白
中图分类号：Ｓ８９９１ 文献标识码：Ａ
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭａｌｅＷｈｉｔｅＷａｘＳｃａｌｅＰｕｐａｅ
ＹＵＳｈｕｈｕｉ，ＱＩＱｉａｎ，ＳＵＮＴａｏ，ＷＡＮＧＸｕｅｑｉｎｇ，ＹＡＮＧＰｕ，ＦＥＮＧＹｉｎｇ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
ＩｎｓｅｃｔｓｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２２４，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｄａｔａａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｐｕｐａｌｓｔａｇｅｏｆｍａｌｅ
ｗｈｉｔｅｗａｘｓｃａｌｅｉｎｓｅｃｔ，Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ
２０００，ａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｃａｒｉｅｄｏｕｔｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ．Ｔｈｒｅｅｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓ（ｈｓｐｓ）ｗｅｒｅｓｅ
ｌｅｃｔｅｄｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｃｒｏｓｓｄｉｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓｕｓｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ（ｑＲＴ
ＰＣＲ）．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｇｅｎｅｒａｔｅｄ６３９５７ｕｎｉｇｅｎｅｓ，６３２７２ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ），
ａｎｄ９５６１ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｕｎｉｇｅｎｅｓｗａｓ６７４ｂｐ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１４
３２７ｕｎｉｇｅｎｅｓｗｅｒｅａｎｎｏｔａｔｅｄｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｄａｔａｂａｓｅｓ．ＴｈｅＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）ａｎｄＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓ
ａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍａｎｙｇｅｎｅｓｃｏｉｎｃｉｄｅｄｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｕｐａｌｓｔａｇｅ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅｄａｔａａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｃｏｕｌｄｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒ
ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＥ．ｐｅｌａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ；ｐｕｐａｅ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ；ｕｎｉｇｅｎｅ；ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ
白蜡虫是我国特产资源昆虫，二龄雄虫所分泌
的白蜡是一种重要的工业原料。白蜡虫雌雄二型，
雌虫发育经历卵、幼虫、成虫３个阶段；雄虫发育经
历卵、幼虫、前蛹、真蛹、成虫等阶段。雄虫和雌虫
最主要的差别是雄虫有蛹期［１］。由于白蜡虫雄虫
幼虫活动能力很差，泌蜡特性又限制了雄虫的活
林　业　科　学　研　究 第２９卷
动，蛹期的出现使雄虫可以羽化成为具有飞行能力
的成虫，从而获得与雌虫交配的机会，那些具有较
强飞行能力和更多活动空间的雄虫将繁殖出更多
的后代。因此，蛹期对于白蜡虫的生存繁衍具有重
要意义。
作者前期分析了白蜡虫二龄雄虫泌蜡高峰期转
录组、雌雄虫发育过程差异表达基因、雄虫蛹期蛋白
质组，但是对于雄虫真蛹转录组特征缺少深入的分
析。研究表明，在昆虫的蛹期，发生了幼虫组织降
解，成虫组织在此基础上发育重建等重要事件，涉及
到细胞程序化死亡、细胞增殖、细胞分化等多种分子
过程［２－７］。本研究对白蜡虫雄虫真蛹转录组进行高
通量测序，对转录组进行注释分析，并采用ｑＲＴＰＣＲ
分析了３个 ｈｓｐ基因在不同虫态中的表达动态，为
进一步深入了解白蜡虫蛹期形成提供参考。
１　材料与方法
１．１　供试昆虫
所用白蜡虫为昆明种群，采自中国林业科学研
究院资源昆虫研究所（云南昆明）。
１．２　方法
１．２．１　ＲＮＡ提取及文库构建　从蜡花中挑选真蛹
期雄虫３０头，在解剖镜下检测，用灭菌双蒸水漂洗３
次，Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｓ．）匀浆。ＲＮＡ提取按照
Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明书操作，采用Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ
（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）检测提取 ＲＮＡ的质量。ｍＲ
ＮＡ分离、文库构建参考文献［１，８－９］。
１．２．２　高通量测序、基因注释和分析　采用 Ｉｌｕｍｉ
ｎａＨｉＳｅｑ２０００进行双末端（ｐａｉｒ－ｅｎｄｓ）测序。对获
得的原始 ｒｅａｄｓ进行过滤，去除接头和质量较差的
ｒｅａｄｓ。采用Ｔｒｉｎｉｔｙ软件进行序列组装，获得转录本
序列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ），在聚类单元中选取最主要的转录
本作为ｕｎｉｇｅｎｅ序列。
获得的 ｕｎｉｇｅｎｅ使用 Ｇｅｔｏｒｆ（ｈｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．
ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ａｐｐｓ／ｃｖｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｐｐｓ／ｇｅｔｏｒｆ．ｈｔｍｌ）
软件进行ＯＲＦ预测。对每个基因的长度、深度、ＲＰ
ＫＭ（ＲｅａｄｓＰｅｒＫｉｌｏｂａｓｅｐｅｒＭｉｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ）、
Ｍｕｌｔｉ（多位置）比对ｒｅａｄｓ数目等进行统计分析。
将ｕｎｉｇｅｎｅ序列用ＢＬＡＳＴ［１０］软件与ＮｏｎＲｅｄｕｎ
ｄａｎｔ（ＮＲ）［１１］、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ［１２］、ＧＯ［１３］、ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｏｒｔｈｏｌ
ｏｇｏｕｓｇｒｏｕｐｓ（ＣＯＧ）［１４］、ＫＥＧＧ［１５］数据库比对，获得
注释信息（Ｅｖａｌｕｅ≤ｅ５）。用 ＭＩＳＡ［１６］对１ｋｂ以上
的ｕｎｉｇｅｎｅ做ＳＳＲ分析，参数设置为单碱基的重复数
≥１６，双碱基的重复数≥６，三至六碱基的重复数≥５。
１．２．３　ｑＲＴＰＣＲ　由于在白蜡虫雄虫蛹期转录组
和蛋白组中均有大量热激蛋白（ｈｓｐ）表达，故选取３
个ｈｓｐ基因（ｈｓｐ４０、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ９０），以 βａｃｔｉｎ基因为
内参，采用相对定量的方法分析３个 ｈｓｐ基因在白
蜡虫雌雄虫不同虫态中的表达变化。所用引物和具
体方法参考文献［１７］，ｍＲＮＡ相对含量的计算采用
２－ΔΔＣｔ法［１８］。数据分析采用ＤＰＳ软件中的ＬＳＤ法进
行差异显著性分析（Ｐ＜０．０１）［１９］。
２　结果与分析
２．１　高通量测序和组装
获得２９０１４８０１条 ｒｅａｄｓ，总碱基数为５．８６Ｇ，
ＧＣ（碱基）含量为 ４１．３７％，Ｑ３０（碱基正确识别率
９９．９％）为８４．９１％。样品在当前的测序量条件下
均已达到饱和。共组装获得１０６８７４个转录本，进
一步获得 ６３９５７条 ｕｎｉｇｅｎｅ，ｕｎｉｇｅｎｅ平均长度 ６７４
ｂｐ，Ｎ５０长度为１２１０ｂｐ，长度在１ｋｂ以上的ｕｎｉｇｅｎｅ
有１０２４２条，占 ｕｎｉｇｅｎｅ总数的１６．０１％ （图１Ａ）。
共获得６３２７２个ｕｎｉｇｅｎｅ的ＯＲＦ（开放阅读框）。
２．２　转录组注释
共有１４３２７个 ｕｎｉｇｅｎｅ获得了注释，在 Ｎｒ数据
库中获得注释的ｕｎｉｇｅｎｅ数量最多，有１３９５１条（表
１），在Ｎｒ注释结果中，约一半的 ｕｎｉｇｅｎｅ的 Ｅ值小
于１Ｅ５０（图 １Ｂ），大多数 ｕｎｉｇｅｎｅ比对相似性在
５０％以上（图１Ｃ），在获得注释的序列中，注释为豌
豆蚜（ＡｃｙｔｈｏｓｉｐｈｏｎｐｉｓｕｍＨａｒｉｓ）基因的ｕｎｉｇｅｎｅ数目
高于其它物种（图１Ｄ）。
表１　ｕｎｉｇｅｎｅ注释统计
注释数据库 ｕｎｉｇｅｎｅ数目（比例／％）
ＣＯＧ ４５１７（３１．５３）
ＧＯ １０５０７（７３．３４）
ＫＥＧＧ ４５１７（３１．５３）
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ １１４４９（７９．９１）
Ｎｒ １３９５１（９７．３８）
２．３　ＧＯ、ＫＥＧＧ、ＣＯＧ注释结果
ＧＯ分析表明：属于结合（８７．１３％）、催化活性
（６９．９８％）、细 胞 过 程 （９０．２５％）、代 谢 过 程
（８３．３７％）、生物过程（７８．６９％）等分类的 ｕｎｉｇｅｎｅ
最多，还有很多 ｕｎｉｇｅｎｅ属于形态发生素活性
（０．０２％）、发 育 过 程 （７２．１８％）、细 胞 增 殖
（５．１２％）、位 置 建 立 （５０．５２％）、色 素 沉 积
（１．３８％）、表型转换（０．０６％）（图２）。
４１４
第３期 于淑惠，等：白蜡虫雄虫真蛹转录组分析
Ａ：长度分布；Ｂ：Ｅ值分布；Ｃ：相似性分布；Ｄ：物种分布
图１　ｕｎｉｇｅｎｅ长度分析及在Ｎｒ数据库中的注释情况
图２　ＧＯ注释分类图
　　 ＫＥＧＧ 注 释 结 果 表 明：参 与 ＲＮＡ 转 运
（５．２５％）、核糖体（３．８１％）、内质网上蛋白加工
（３．６５％）等通路的 ｕｎｉｇｅｎｅ最多，还有很多 ｕｎｉｇｅｎｅ
参与内吞作用（２．４８％）、泛素介导的蛋白降解
（２４８％）、Ｗｎｔ信号通路（２３２％）等。
ＣＯＧ注释结果表明：除 Ｇｅｎｅｒａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃ
ｔｉｏｎｏｎｌｙ之外，属于复制、重组和修复的 ｕｎｉｇｅｎｅ
最多。
２．４　ＳＳＲ分析
共获得ＳＳＲ分析标记９５６１个。单碱基重复的
最多，其次是三碱基重复（表２）。
２．５　基因表达分析
与卵期相比，ｈｓｐ４０、ｈｓｐ６０在雌虫的发育中有不
同程度地上调表达，在成虫期有明显上调表达；而
５１４
林　业　科　学　研　究 第２９卷
表２　ＳＳＲ分析结果统计
搜索项 数量（比例／％）
检测序列的总数目 １０２４２　　　　
鉴定到的ＳＳＲ总数目 ９５６１　　　　
含有ＳＳＲ的序列数目 ５１２０　　　　
含单碱基重复的序列数 ７７１１（７５．２９）
含双碱基重复的序列数 ５３８（５．２５）　
含三碱基重复的序列数 １１９０（１１．６２）
含四碱基重复的序列数 １１５（１．１２）　
含五碱基重复的序列数 ７（０．０７）　
ｈｓｐ９０在雌虫的各个阶段均表达很低（图３Ａ Ｃ）。
ｈｓｐ４０、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ９０在雄虫发育过程中均有不同
程度地上调表达，它们的 ｍＲＮＡ水平在二龄幼虫期
达到最大，而在之后的发育阶段（蛹和成虫）中下降
（图３Ｄ Ｆ）。
Ｅ：卵；♀Ｌ１：雌虫１龄幼虫；♀Ｌ２：雌虫２龄幼虫；♀Ａ１：雌虫成虫初
期；♀Ａ２：雌虫成虫中期；♀Ａ３：雌虫成虫后期；♂Ｌ１：雄虫１龄幼
虫；♂Ｌ２：雄虫２龄幼虫；♂Ｐ：雄虫真蛹；♂Ａ：雄虫成虫
图３　ｈｓｐ４０、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ９０在白蜡虫雌雄虫不同虫态中的表达变化
３　讨论
本研究共产生了 ５．８６Ｇ的数据量，共获得
６３９５７条ｕｎｉｇｅｎｅ，样品在当前的测序量条件下均已
达到饱和。获得的 ｕｎｉｇｅｎｅ数目多于白蜡虫２龄雄
虫转录组ｕｎｉｇｅｎｅ，但与雌成虫以及所有虫态混合的
转录结果相比，蛹期转录组获得的ｕｎｉｇｅｎｅ基因数目
略少，可能与白蜡虫在不同时期基因表达情况有关。
蛹期转录组ｕｎｉｇｅｎｅ在１ｋｂ以上的有１０２４２条，说
明组装效果很好［２０］。注释结果表明，１４３２７条 ｕｎｉ
ｇｅｎｅ在各个数据库中获得了注释，从另一方面间接
说明了ｕｎｉｇｅｎｅ的准确性。在 ＮＲ数据库获得注释
的ｕｎｉｇｅｎｅ中，２４．１４％的ｕｎｉｇｅｎｅ注释为豌豆蚜相应
的基因，在所注释物种中比例最高，可能是由于这２
个物种在进化关系上比较接近的缘故。
ＧＯ注释鉴定到的很多基因与蛹期生理活动相
关，如细胞增殖、色素沉积、表型转换等，在ＫＥＧＧ注
释中，发现很多基因参与蛋白降解、Ｗｎｔ信号通路
等。这些基因对于成虫特征的形成具有重要意义。
比如Ｗｎｔ信号通路在马利筋长蝽（Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓｆａｓｃｉａ
ｔｕｓＤａｌ）身体分节中具有保守作用，但对于附肢发育
并不起核心作用［１９］。同时还鉴定到很多基因参与
营养储存活性、繁殖，由于白蜡虫成虫期并不取食，
交配后死亡，这些基因可能为雄虫交配繁殖过程提
供营养［２１］。
ｑＲＴＰＣＲ检测表明，ｈｓｐ４０、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ９０在雄虫
发育过程中均有不同程度地上调表达，２龄幼虫期
达到最大，蛹期和成虫期又下降；而 ｈｓｐ９０在雌虫的
各个阶段均表达很低。已有研究表明，ｈｓｐ９０基因参
与昆虫的发育过程［２２－２６］，尤其是 ｈｓｐ９０对于蜕皮激
素受体 ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ复合物的激活具有关键作
用［２４，２６］。蛹期蛋白组中也鉴定大量ＨＳＰ蛋白，这些
ＨＳＰ在白蜡虫的发育过程可能起到不同的作用，但
它们的功能需要通过ＲＮＡ干涉等实验进行验证。
４　结论
白蜡虫雄虫真蛹转录组分析获得６３９５７条ｕｎｉ
ｇｅｎｅ，注释分析表明，一些 ｕｎｉｇｅｎｅ的生物学功能与
白蜡虫雄虫蛹期的生理活动可能相关，该转录组数
据为白蜡虫基因功能研究和蛋白组学分析研究奠定
了数据基础。
参考文献：
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（责任编辑：张　玲）
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