全 文 ：书农杆菌介导的药百合鳞片遗传转化体系的建立
储俊１，２，许娜１，张强１，王松华１，周正义１，金光明１
（１．安徽科技学院生命科学学院，安徽 凤阳２３３１００；２．中国科学技术大学生命科学学院，安徽 合肥２３００２７）
摘要：本试验以药百合鳞片高频再生体系为基础，研究了农杆菌介导的药百合鳞片遗传转化的几个影响因素。结
果表明，预培养５ｄ有利于转化；共培养３ｄ并且添加１００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮有利于提高转化频率并抑制了农杆
菌的过度生长；在侵染阶段添加１５０μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，农杆菌侵染液ｐＨ 值５．７、光吸收值０．８，侵染时间１０ｍｉｎ
为最佳遗传转化体系。再生植株经犵狌狊基因的瞬时表达检测及犺狆狋基因ＰＣＲ检测证明载体已成功整合到药百合
基因组中。
关键词：药百合；农杆菌；乙酰丁香酮；转化
中图分类号：Ｑ９４３；Ｓ５６７．０３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０６０１６４０６
中国是世界百合（犔犻犾犻狌犿）种质资源的分布中心，约有４７个种、１８个变种，占世界百合属总数的５０％以上［１］。
目前，一些分布地区窄或生态适应性弱的百合种的生存受到严重威胁。传统的百合繁殖方法主要采用常规分球、
分珠芽鳞片扦插、鳞片包埋等，但繁殖系数较小，特别是经多代分殖以后，常造成种性退化，甚至病毒积累，影响百
合的产量和质量。而利用遗传转化技术将外源的抗病毒基因整合到百合基因组上，能够提高百合对病毒的抗
性［２］，加快了百合的快繁速度。
农杆菌介导的遗传转化体系研究一般在双子叶植物中进行，传统观念认为单子叶植物不是农杆菌的有效寄
主。但自１９８７年利用农杆菌将外源基因玉米条纹病毒（ｍａｉｚｅｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ，ＭＳＶ）导入单子叶植物玉米（犣犲犪
犿犪狔狊）中以来，农杆菌介导的遗传转化研究在单子叶植物上有了很多研究成果。随着转基因技术的发展，许多功
能基因被转入资源植物中进行遗传改良以提升它们的品质［３５］。目前，国内对百合科植物遗传转化也有不少研
究，刘伟［６］将犐犘犐基因导入亚洲百合‘布耐罗’品种；陈莉等［７］将 ＭｎＳＯＤ基因导入麝香百合（犔犻犾犻狌犿犾狅狀犵犻犳犾狅
狉狌犿）中都获得了转基因百合植株；但以药百合（犔．狊狆犲犮犻狅狊狌犿）为材料的研究未见报道。本试验以安徽霍山县当
地栽培药百合品种为材料，在前期已建立的药百合再生体系的基础上［８］，研究影响药百合转化效率的各种因素，
以建立稳定高效的药百合遗传转化体系。为该栽培品种的抗病脱毒、种质资源的改良，以及获得优质药百合品种
打下良好的基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
药百合，安徽霍山县当地栽培品种。根癌农杆菌ＪＶ３１０１（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊），具有卡那霉素（ｋａ
ｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ），庆大霉素（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，Ｇｅｎ）抗性；植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，该质粒携带有转β葡萄糖醛酸
酶基因（βｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｇｅｎｅ，ｇｕｓｇｅｎｅ）和潮霉素磷酸转移酶基因（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ，ｈｐｔ
ｇｅｎｅ），本试验室保存。
预培养和共培养培养基 ＭＳ１：ＭＳ０（去除大量元素中ＮＨ４ＮＯ３ 的 ＭＳ）＋１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ；
筛选培养基 ＭＳ２：ＭＳ０＋１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋５０ｍｇ／Ｌ潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，Ｈｙｇ）＋５００ｍｇ／Ｌ
羧苄青霉素（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ，Ｃａｒｂ）；生根培养基 ＭＳ３：１／２ＭＳ＋０．４ｍｇ／ＬＩＢＡ＋５００ｍｇ／ＬＣａｒｂ。以上所用培养基
均附加３％蔗糖，琼脂６ｇ／Ｌ，ｐＨ５．７。工程菌 ＹＥＰ液体培养基：１０ｇ／Ｌ蛋白胨＋５ｇ／Ｌ酵母提取物＋５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．０。ＹＥＰ１：ＹＥＰ＋５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋５０ｍｇ／ＬＧｅｎ。
１６４－１６９
２０１１年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２０卷 第６期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１０１００８；改回日期：２０１０１２０２
基金项目：安徽省教育厅自然科研一般项目（ＫＪ２０１０Ｂ０５２，ＫＪ２０１０Ｂ２９４）资助。
作者简介：储俊（１９７９），男，安徽潜山人，在读博士，讲师。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｕｊｕｎ＠ｍａｉｌ．ｕｓｔｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．２ 试验方法
１．２．１ 农杆菌的培养 取激活后的农杆菌ＪＶ３１０１菌液２００μＬ，接入３ｍＬＹＥＰ１液体培养基，２８℃，１６０ｒ／ｍｉｎ
摇床培养２０～２５ｈ。将１ｍＬ菌液接入５０ｍＬＹＥＰ１液体培养基，２８℃，１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ。４℃，５０００
ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去上清液，沉淀用５０ｍＬＭＳ０重悬，２８℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养１～２ｈ，至对数生长期，备用。
１．２．２ 抗生素敏感性试验 取药百合再生组培苗鳞片，剪成约０．５ｃｍ２ 小鳞片，无菌水清洗，备用。处理１：小
鳞片接种于不同浓度Ｈｙｇ（０，１０，２０，３０，４０，５０，６０ｍｇ／Ｌ）的ＭＳ１。处理２：小鳞片经农杆菌侵染１０ｍｉｎ，接种于
不同浓度Ｃａｒｂ（０，１００，３００，５００，７００ｍｇ／Ｌ）的ＭＳ１。培养条件：光照强度１５００～２０００ｌｘ，光周期１２ｈ光照／１２
ｈ黑暗，温度（２５±２）℃。３０ｄ后观察 Ｈｙｇ、Ｃａｒｂ对外植体生长情况和诱导不定芽的影响。每处理２０块外植体，
重复３次。
１．２．３ 菌液浓度及侵染时间对转化的影响 预培养２ｄ的小鳞片，置农杆菌 ＭＳ０悬浮液侵染（５，１０，１５ｍｉｎ），
同时控制农杆菌浓度ＡＢＳ６００＝０．８，观察侵染时间对转化的影响；侵染菌液浓度设置６００ｎｍ处的吸收值为０．４，
０．８，１．２三个水平，同时控制侵染时间１０ｍｉｎ；观察其对转化的影响。每处理２０块外植体，重复３次。
１．２．４ 乙酰丁香酮（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，ＡＳ）浓度及添加方式对转化的影响 分别在侵染菌液 ＭＳ０，共培养基 ＭＳ１
中添加ＡＳ（０，１００，１５０，２００μｍｏｌ／Ｌ），研究ＡＳ添加浓度对转化的影响。ＡＳ的添加方式选择：侵染阶段添加、共
培养阶段添加、侵染和共培养阶段同时添加，研究其对转化的影响。每处理２０块外植体，重复３次。
１．２．５ 正交试验确定最优转化条件 选定预培养时间Ｐ（１，３，５ｄ）、共培养时间 Ｇ（１，３，５ｄ）、侵染液ｐＨ 值
（５．４，５．７，６．０）进行Ｌ９（３４）正交试验，以转化后再生抗性芽分化率为评定指标，观察各因素对转化的影响，确定
最优的转化条件。
１．２．６ 遗传转化 将经过５ｄ预培养的外植体浸在 ＭＳ０农杆菌液中侵染，后取出外植体用无菌滤纸吸干，在
ＭＳ１上共培养３ｄ，转接 ＭＳ２进行筛选和再生。再生后３０ｄ左右抗性芽移至 ＭＳ３上生根。２８ｄ左右生根良好
的小苗经闭瓶炼苗、开瓶炼苗、移栽，即可定植。
１．２．７ ＧＵＳ瞬时表达检测 转化频率以犵狌狊基因的瞬时表达率为指标来衡量。ＧＵＳ检测采用组织化学法加
以改进。将共培养后的材料浸泡于ＧＵＳ染色液中，３７℃恒温３ｈ，弃染色液；加入丙酮固定液１５ｍｉｎ；０．２ｍｏｌ／Ｌ
ＨＣｌ、２０％甲醇，５７℃保温１５～２０ｍｉｎ；７％ＮａＯＨ、６０％乙醇室温１５ｍｉｎ；复染水，４０％→２０％→１０％的乙醇各浸
泡５ｍｉｎ；渗透，５％乙醇、２５％甘油１５ｍｉｎ；５０％甘油压片。光学显微镜下观察，白色背景下蓝色即为ＧＵＳ表达
位点。犵狌狊基因的瞬时表达率＝（犵狌狊基因瞬时表达的外植体数／总外植体数）×１００％。
１．２．８ ＰＣＲ检测 运用改良的ＣＴＡＢ法［９１１］提取转化后药百合再生苗的基因组ＤＮＡ。犎犘犜 基因特异引物
（上海生工合成）ＨＰＴＵ：５′ＣＧＧＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧ３′；ＨＰＴＬ：５′ＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴ
ＴＴＧＴＧＴＡ３′。ＰＣＲ扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性６０ｓ，６１℃退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，循环３５次；
７２℃延伸１０ｍｉｎ。
２ 结果与分析
２．１ Ｈｙｇ对小鳞片再生的影响
Ｈｙｇ是普遍应用于单子叶植株的选择标记［１１］，其生物学功能是与７０Ｓ和８０Ｓ核糖体结合，抑制生物蛋白质
的合成，最终导致生物生长受到抑制。将药百合小鳞片接种于不同浓度的 Ｈｙｇ培养基中，观察小鳞片褐变及再
生情况。不加 Ｈｙｇ时小鳞片的再生频率达９８％，随着Ｈｙｇ的浓度增加，愈伤组织逐渐褐变，再生受到的抑制逐
渐加大（图１）；５０ｍｇ／Ｌ时，鳞片再生频率为１０％；当Ｈｙｇ达６０ｍｇ／Ｌ时外植体全部褐变死亡。在筛选质量浓度
时一般应略低于全致死浓度［１２］，因此，选择５０ｍｇ／ＬＨｙｇ作为小鳞片的筛选浓度。
２．２ Ｃａｒｂ对小鳞片再生的影响
随着Ｃａｒｂ浓度的升高，小鳞片再生频率出现了先下降再升高，又回落的现象（图２），同时观察到抑菌效果逐
渐显著，当Ｃａｒｂ在５００ｍｇ／Ｌ以上时能够完全抑制农杆菌的生长。为了减少Ｃａｒｂ对百合鳞片再生的伤害，同时
又能够有效地抑菌，选择Ｃａｒｂ筛选浓度５００ｍｇ／Ｌ。
５６１第２０卷第６期 草业学报２０１１年
图１ 药百合小鳞片犎狔犵敏感性试验
犉犻犵．１ 犜犺犲狊犲狀狊犻狋犻狏犲狋犲狊狋狅犳犎狔犵狅犳犔．狊狆犲犮犻狅狊狌犿狊犮犪犾犲犾犲犪犳
图２ 药百合小鳞片犆犪狉犫敏感性试验
犉犻犵．２ 犜犺犲狊犲狀狊犻狋犻狏犲狋犲狊狋狅犳犆犪狉犫狅犳犔．狊狆犲犮犻狅狊狌犿狊犮犪犾犲犾犲犪犳
２．３ 菌液浓度及侵染时间对转化的影响
在农杆菌介导的遗传转化中，菌液浓度过低或过
高，侵染时间过长或过短都会降低转化效率，超过１０
ｍｉｎ后，不定芽发生频率明显下降，并且发现有大量外
植体出现软腐症状，最终变黑死亡。而时间太短则外
植体多产生白化芽，不能正常生长，直至死亡。农杆菌
菌液浓度以ＡＢＳ６００＝０．８最佳（表１）。
２．４ ＡＳ浓度及添加方式对转化的影响
低浓度ＡＳ处理，抗性芽分化率随着 ＡＳ浓度的
增加而升高（图３），而当ＡＳ浓度继续升高，抗性芽分
化率达到最大后又下降。在共培养阶段１００μｍｏｌ／Ｌ
ＡＳ时，抗性芽生成率最高达１２．１％；在侵染阶段１５０
μｍｏｌ／ＬＡＳ时，抗性芽生成率最高达１０．０％。当ＡＳ
浓度为２００μｍｏｌ／Ｌ时，抗性芽分化率下降，同时筛选
培养基除菌困难，其原因可能是ＡＳ过度诱导狏犻狉基因
的表达，增强了农杆菌侵染活力，使转化植物细胞受农
杆菌毒害而无法出芽。本试验比较了ＡＳ在遗传转化
体系中３种添加方式（侵染阶段添加、共培养阶段添
加、共培养和侵染阶段同时添加）的不同，在共培养和
侵染阶段同时添加ＡＳ效果最佳（表２）。
表１ 菌液浓度及侵染时间对不定芽再生的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狅犳犫犪犮狋犲狉犻狌犿犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀犪狀犱
犻狀犳犲犮狋犻狅狀犱狌狉犪狋犻狅狀狅狀狊犺狅狅狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀
菌液浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｏｎｏｆ
犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿
（ＡＢＳ６００）
抗性芽分化率
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒａｔｅ
ｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｓｈｏｏｔ（％）
侵染时间
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｄｕｒａｔｉｏｎ
（ｍｉｎ）
抗性芽分化率
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｒａｔｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｓｈｏｏｔ（％）
０．４ ２．３ ５ ０．９５
０．８ ２０．５ １０ ３０．００
１．２ １１．８ １５ １７．７０
图３ 犃犛浓度对转化效率的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狅犳犃犛犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
２．５ Ｌ９（３４）正交试验对转化条件的优化
采用Ｌ９（３４）正交表，对影响遗传转化的Ｐ、Ｃ、ｐＨ
因素进行正交试验。对结果进行极差分析得最佳试验
方案是：Ｐ３Ｃ２Ｈ２，即预培养５ｄ，共培养３ｄ，侵染液
ｐＨ５．７。３个试验因素影响的主次是：Ｐ＞Ｃ＞Ｈ，预培养时间和共培养时间对转化有极显著影响（犘＜０．０１），侵
染液ｐＨ对转化有显著影响（犘＜０．０５）。
２．６ 转化外植体的检测
本试验菌株含有犵狌狊报告基因和潮霉素磷酸转移酶筛选基因犺狆狋，犵狌狊基因可以通过组织化学法直观的显示
６６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
转化的部位，并通过染色的深浅反应转化的强度。在
显微镜下可清晰地看到经农杆菌转化的百合鳞片呈明
显的蓝色，而非转化百合鳞片无任何颜色，呈透明状
（图４）。由此，可初步说明犵狌狊基因已在转化材料中
瞬时表达。
早期检测犵狌狊基因的瞬时表达并不能很好地说明
稳定转化的情况，而潮霉素的筛选则直接杀死未转化
的细胞，插入外源基因的组织由于犺狆狋基因的表达进
行解毒，可以在含有潮霉素的选择培养基上生长。为
了检测稳定表达，通过ＰＣＲ鉴定犺狆狋基因的表达。电
泳结果１～３泳道均在５００～７５０ｂｐ出现了单一条带
（图５），４泳道出现了多条非特异条带，可能是假阳性
植株，而５，６泳道野生型植株无扩增条带，说明犺狆狋基
因已在转化植株中表达，获得了转基因药百合植株（图
６）。
表２ 不同阶段添加犃犛对遗传转化的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狅犳狌狊犻狀犵犃犛犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋
狆犺犪狊犲狊狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
不同阶段
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈａｓｅｓ
抗性芽分化率Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｒａｔｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｈｏｏｔ（％）
侵染阶段Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １０．０
共培养阶段Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ １２．１
共培养和侵染阶段Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２５．８
图４ 百合鳞片的犵狌狊基因表达（４０犡）
犉犻犵．４ 犜犺犲犵狌狊犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀狋犺犲
犔．狊狆犲犮犻狅狊狌犿狊犮犪犾犲犾犲犪犳
ａ：转化鳞片Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｌｅａｆｓｌｉｃｅ；ｂ：未转化鳞片 Ｗｉｌｄｌｅａｆｓｌｉｃｅ．
图５ 转化植株犘犆犚检测
犉犻犵．５ 犘犆犚犪狊狊犪狔狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～４：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ；
５，６：野生型植株 Ｗｉｌｄｐｌａｎｔｓ
３ 讨论
在植物转化试验中，对选择性抗生素浓度的要求
是，不仅能有效地抑制非转化细胞生长，使之缓慢死
亡，而且不影响转化细胞的正常生长。当选择压过低
时，部分未转化的植物细胞由于产生耐受性而分化再
生成植株；当选择压过高时，阳性转化子由于不能承受
高选择压而同样被抑制，使转化效率降低。本试验结
果表明，５０ｍｇ／ＬＨｙｇ对药百合鳞片筛选最为适宜。
此结果与吴关庭等［１３］的研究结果一致。但与王爱菊
等［１４］，梁慧敏等［１５］的研究结果不同。王爱菊等［１４］认
为筛选最适宜浓度为４０ｍｇ／Ｌ，梁慧敏等［１５］认为筛选
最适宜浓度为１０ｍｇ／Ｌ，这种试验结果的差异可能是
由于不同种的百合科植物耐受 Ｈｙｇ的能力强弱不同
所致。
图６ 抗性植株筛选过程
犉犻犵．６ 犉犻犾狋狉犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狊狅犳狉犲狊犻狊狋犪狀犮犲狆犾犪狀狋狊
ａ：抗性芽Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｈｏｏｔ；ｂ：抗性芽增殖 Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｈｏｏｔ；ｃ：生根筛选Ｒｏｏｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｄ：转基因株系Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｐｌａｎｔｓ．
７６１第２０卷第６期 草业学报２０１１年
单子叶植物难于被农杆菌感染的主要原因是由于细胞内不能积累足够的酚类物质，从而难于激活农杆菌的
侵染能力。ＡＳ作为创伤信号或创伤诱导分子能诱导农杆菌狏犻狉基因的活化和表达［１６］，因此，ＡＳ常被加到农杆
菌的侵染液或共培养培养基中促进ＴＤＮＡ 转移到植物细胞。本试验表明，侵染液和共培养培养基中添加ＡＳ
可提高犵狌狊瞬间表达率，不经此处理的犵狌狊瞬时表达率很低，这说明ＡＳ在药百合的遗传转化中起重要作用，这
符合了前人论述的 ＡＳ对根癌农杆菌侵染的趋化作用［１７］。试验得到 ＡＳ的最适宜浓度为侵染液添加１５０
μｍｏｌ／Ｌ，共培养基添加１００μｍｏｌ／Ｌ。在低浓度时添加ＡＳ浓度与转化率呈正比，超过最适宜浓度后，添加ＡＳ浓
度与转化率呈反比。这一试验结果与孙艳香等［１８］，张国裕等［１９］，尹虹等［２０］的研究结果一致。添加高浓度ＡＳ鳞
片褐化死亡的原因：一方面可能是由于高浓度的酚类物质本身使外植体毒害致死。另一方面可能是由于农杆菌
介导的外源基因转化是农杆菌菌株与植物细胞之间相互作用的结果。植物细胞上的农杆菌结合位点是有限的，
高浓度的ＡＳ使得农杆菌高度活化造成对外植体的过度侵染致死。
本试验结果显示，适合药百合菌液最佳侵染时间是１０ｍｉｎ，这与陈莉等［７］的研究结果一致。本研究为通过
农杆菌介导的遗传转化方法来获得转基因药百合并进一步研究抗逆境生理相关基因在百合中的抗逆作用创造了
先期的条件，为百合的基因工程及抗性品种改良奠定了基础。
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犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｐｐｌｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，１９９３，１２：５５９５６３．
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８６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
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ＣＨＵＪｕｎ１，２，ＸＵＮａ１，ＺＨＡＮＧＱｉａｎｇ１，ＷＡＮＧＳｏｎｇｈｕａ１，ＺＨＯＵＺｈｅｎｇｙｉ１，ＪＩＮＧｕａｎｇｍｉｎｇ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｎｈｕｉＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｅｎｇｙａｎｇ
２３３１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＣｈｉｎａ，Ｈｅｆｅｉ２３００２７，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｅｖｅｒａｌｆａｃｔｏｒｓ，ａｆｆｅｃｔｉｎｇ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆｌｉｌｙｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｈｅｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｏｆ５ｄａｙｓｗａｓｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｆｏｒ
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９６１第２０卷第６期 草业学报２０１１年