全 文 ：书百里香染色体制片优化及核型分析
杨宁１，谈永霞１，２，李巧峡１，贾凌云１，陈锡莲１，刘效瑞３
（１．西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州７３００７０；２．兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州７３００７０；
３．定西市旱作农业科研推广中心，甘肃 定西７４３０００）
摘要：采用常规压片法，首次对甘肃康乐地产野生百里香染色体进行核型分析。结果表明，上午８：４５－９：１５取材，
０．０４％秋水仙素和０．００２ｍｏｌ／Ｌ８羟基喹啉溶液等体积混合液处理百里香芽尖２～３ｈ，改良石炭酸品红染色液染
色１ｈ效果最好；对百里香体细胞染色体数目进行统计，核型分析结果表明，百里香的细胞染色体数为２狀＝２４，其
中中部染色体（ｍ）为１０对，近中部着色点染色体（ｓｍ）２对，其核型公式为２狀＝２ｘ＝２４＝２０ｍ＋４ｓｍ，核型属２Ａ型，
核型不对称系数为５９．６３％。
关键词：百里香；染色体；核型分析
中图分类号：Ｑ９４３；Ｑ９４９．７７７．６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０１０１８４０６
　 百里香（犜犺狔犿狌狊犿狅狀犵狅犾犻犮狌狊），又名地姜、地椒、麝香草，为唇形科百里香属植物。百里香的株型奇特低矮，
花型小，花色艳丽，且全株芳香，喜凉爽气候，喜光，稍耐荫，耐寒耐旱，忌湿，耐贫瘠［１］。百里香属植物原产于地中
海沿岸，全球约有４００多个种，广泛分布在北非、欧洲和亚洲温带地区，经济栽培以南欧最多［２］。我国有１１种，２
个变种，分布于甘肃、新疆、青海、西藏及黄河流域及以北地区［３］。百里香属植物具有分布广泛、适应性强、种内多
型性较为普遍等特点，在温带干旱半干旱地区的荒漠化生境的植物群落组成及生态演替中发挥着重要的生态功
能［４，５］。作为一种颇具开发价值的多用途植物，近年来，百里香作为芳香蔬菜、药用植物、香料作物、蜜源植物、观
赏植被及干旱土壤的水土保持植物被大面积种植［６］。
形态学分类方法是最基本的植物分类方法，在植物分类研究中一直沿用。但是由于百里香属植物不同种之
间的形态差异较小，加之近年来国外品种的大量引进，所以，仅以形态学方法难以提供可靠的分类依据，亟需采用
多种方法来加强百里香属植物的分类研究［１］。随着分子生物学技术的发展，分子标记及基因序列的分析方法已
被广泛应用于物种的亲缘关系、遗传变异及系统演化的研究。由于分子的研究方法是基于染色体上的一段ＤＮＡ
序列，因此其结果有时不如用染色体组分析法直观［７］。染色体核型分析技术能明确识别各个染色体的特征，有
助于基因定位的研究，它是细胞遗传学的一项基本技术，也是染色体工程、细胞分类学和植物育种学的一个不可
缺少的手段。对染色体进行核型分析，不仅有助于了解生物的遗传组成、遗传变异规律和发育机制，而且对预测
鉴定种间杂交和多倍体育种的结果、了解性别遗传机理以及基因组数、物种起源、进化和种族关系的鉴定都具有
重要的参考价值［８，９］。通过对细胞核染色体核型稳定特征（染色体的数目、相对长度、着丝点位置、核型不对称系
数和随体的有无等）的分析，可以作为分类指标而被利用。因此，染色体核型分析技术可为研究生物的系统发育
和亲缘关系提供依据［１０］。
由于百里香属植物的染色体非常小，为１～２μｍ，一般较难观察，所以国内外对百里香属植物染色体数目、核
型分析的研究的相关报道极少，国内仅见权俊萍等［１１］对我国产４种２个变种百里香属植物进行了染色体数目及
核型分析研究，国外对百里香属植物的研究较为广泛和深入，并依据形态学差异及地理分布特点等将其分为 Ｍｉ
ｃａｎｔｅｓ，Ｍａｓｔｉｃｈｉｎａ，Ｐｉｐｅｒｅｌａ，Ｔｅｕｃｒｉｏｉｄｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｔｈｙｍｂｒａ，Ｔｈｙｍｕｓ，Ｈｙｐｈｏｄｒｏｍｉ和Ｓｅｒｐｙｌｕｍ等８个组，其中
分布于亚洲的种多存在Ｈｙｐｈｏｄｒｏｍｉ和Ｓｅｒｐｙｌｕｍ组中［１２］。然而对我国百里香属植物染色体的数目、核型分析
方面的特征、染色体数目在种（变种）间的差异及其在百里香属所在组等方面的基础植物学问题仍有许多不清楚。
１８４－１８９
２０１２年２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第１期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
 收稿日期：２０１０１１０１；改回日期：２０１０１２１５
基金项目：国家自然科学基金（３１１６００８７），甘肃省自然科学基金（０８０３ＲＪＺＡ０３８），甘肃省教育厅研究生导师项目（１１０１０６），甘肃省农牧厅
（ＧＹＣ０９１０）和西北师范大学科技与知识创新基金（ＮＷＮＵＫＪＣＸＧＣ０３５８）资助。
作者简介：杨宁（１９７３），女，山东青州人，副教授。Ｅｍａｉｌ：ｘｂｓｄｙｎ＠１６３．ｃｏｍ
笔者首次对甘肃康乐城郊百里香染色体制片技术进行了优化并对其染色体进行了核型分析，旨在积累其细胞学
资料，以期为甘肃地产野生百里香的系统分类、遗传进化及遗传育种提供一定的科学依据。
１　材料与方法
１．１　材料
采自甘肃康乐县城郊百里香种子，挑选粒大饱满的百里香种子放在垫有双层湿润滤纸的培养皿中，于２００９
年１１月置于２５℃恒温培养箱中萌发。
１．２　方法
百里香幼苗芽尖为材料，选取上午８：００－１０：００，
每隔１５ｍｉｎ取材１次，用０．０２％秋水仙素处理３ｈ，以
确定适宜的取材时间；以０．０１％～０．０４％秋水仙素附
加８羟基喹啉溶液作为预处理液，处理２～４ｈ，以确
定适宜的预处理液，预处理液及处理时间见表１。取
预处理后的材料，漂洗２～３次，置于卡诺固定液室温
下固定２４ｈ之后，用超纯水漂洗固定的材料２～３次，
于０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ中，６０℃水浴锅内恒温分别解离５
～２５ｍｉｎ，确定最适宜的解离时间；４５％冰醋酸软化
１０ｍｉｎ后用清水冲洗３～４次，切取百里香芽尖生长
点部分，置于载玻片中央，滤纸吸去多余液体，改良石
表１　预处理液及处理时间
犜犪犫犾犲１　犚犲犪犵犲狀狋犪狀犱狋犻犿犲犳狅狉狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊
编号
Ｎｏ．
预处理液种类及浓度
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅａｇｅｎｔｓ
ａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
处理时间
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｔｉｍｅｓ（ｈ）
１ ０．０１％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ ２～４
２ ０．０２％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ ２～４
３ ０．０４％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ ２～４
４ ０．０４％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ＋
０．００２ｍｏｌ／Ｌ８羟基喹啉溶液
８Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（１∶１）
２～４
炭酸品红染色液分别染色１０～８０ｍｉｎ，常规方法压片［１３］，之后镜检，对分散较好的染色体装片在１００倍显微镜及
图像分析系统下镜检并拍照。
核型分析采用李懋学等［１４，１５］提出的标准进行；根据Ｌｅｖａｎ等［１６］的命名法则，来确定染色体的着丝点位置；染
色体核型分类按照Ｓｔｅｂｂｉｎｓ［１７］提出的根据最长与最短染色体的比值和臂比值，来区分核型对称和不对称程度；
染色体相对长度指数（Ｉ．Ｒ．Ｌ）参考Ｋｕｏ［１８］提出的方法计算；核型不对称系数（Ａｓ．Ｋ）参考Ａｒａｎｏ［１９］的方法计算。
相关公式为：
臂比（ｒ）＝长臂（Ｓ）／短臂（Ｌ）
染色体相对长度（％）＝染色体长度／染色体组总长度×１００％
染色体相对长度指数（Ｉ．Ｒ．Ｌ）＝染色体长度／全组染色体平均长度
核型不对称系数（Ａｓ．ｋ，％）＝长臂总长／全组染色体总长×１００％
２　结果与分析
２．１　制片
图１　不同取材时间内百里香中期细胞的百分比
犉犻犵．１　犜犺犲狆犲狉犮犲狀狋犪犵犲狅犳狋犺犲犱犻狏犻狊犻狅狀犮犲犾狊犻狀
犿犻狋狅狊犻狊犿犲狋犪狆犺犪狊犲犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犿狆犾犻狀犵狋犻犿犲狊
上午８：４５－９：１５是观察百里香染色体数目比较
好的时期，中期细胞的百分比最高可以达到４０％（图
１），其他取样时间虽然也可以观察到中期分裂相的细
胞，但所占比例较小，不易筛选出分散较好的染色体分
裂相。以０．０４％秋水仙素和０．００２ｍｏｌ／Ｌ８羟基喹
啉等体积混合溶液预处理百里香芽尖２～３ｈ，既发挥
了秋水仙素累积分裂中期相的高效性，又保持了８羟
基喹啉能使染色体清晰，便于观察的特点（表２）。另
外，在６０℃，０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ中解离１５ｍｉｎ，后用４５％
冰醋酸软化１０ｍｉｎ效果最佳；酸解５及１０ｍｉｎ由于
细胞解离不充分，细胞不易分散，造成许多细胞重叠在
一起，内部细胞由于接触不到染液而染色较浅，外部细
５８１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
胞却由于细胞质也着色，对比度低，染色体不容易观
察；酸解２０及２５ｍｉｎ虽然解离比较充分，细胞容易分
散，细胞质也不易着色，但细胞中的染色体染色太浅而
不易观察，部分细胞由于解离过度而出现破裂，染色体
也出现不同程度的破坏，断裂成片段，影响染色体数目
统计和核型分析（表３）。
２．２　核型分析
２．２．１　染色体数目　选择３０个染色体分散良好的细
胞观察计数，其中２６个细胞染色体数目为２４条，占计
数总数的８６．７％；４个细胞染色体数目为２６，占计数
总数的１３．３％。根据核型分析标准化建议［１６］，确定百
里香染色体数目为２狀＝２ｘ＝２４。
２．２．２　染色体相对长度及核型分析　根据李懋学和
陈瑞阳［１４］提出的植物核型分析标准，进行百里香染色
体核型分析。选择３０个百里香细胞进行染色体计数，
核型取５个细胞的平均值。测量染色体长臂和短臂，
计算染色体相对长度、臂比值、染色体相对长度指数，
按照染色体总长度由长至短的顺序对染色体进行排列
和编号（表４，图２～４）。
实验结果可以得出百里香染色体的数目为２狀＝
２ｘ＝２４，其中第２号和第７号为近中部着丝粒染色体
（ｓｍ），其余均为中部着丝粒染色体（ｍ）；由长染色体
表２　不同预处理液的效果比较
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狉犲犪犵犲狀狋犳狅狉狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋
预处理液
Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｒｅａｇｅｎｔｓ
中期细胞
Ｍｅｔａｐｈａｓｅ
ｃｅｌｓ
分散效果
Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔ
分辨程度
Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ
ｄｅｇｒｅｅｓ
０．０１％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ 少Ｌｅｓｓ 团状 Ｄｏｕｇｈ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
０．０２％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ 少Ｌｅｓｓ 团状 Ｄｏｕｇｈ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
０．０４％秋水仙素Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ 多 Ｍｏｒｅ 较好 Ｇｏｏｄ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
０．０４％秋水仙素 Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ＋
０．００２ｍｏｌ／Ｌ８羟基喹啉溶液
８Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（１∶１）
多 Ｍｏｒｅ 好Ｂｅｔｔｅｒ 清晰Ｃｌｅａｒ
　预处理２～３ｈＰｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２－３ｈ．
表３　不同解离时间的效果比较
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱犻狊狊狅犮犻犪狋犻狅狀狋犻犿犲
解离时间
Ｔｉｍｅｓ
（ｍｉｎ）
中期细胞
Ｍｅｔａｐｈａｓｅ
ｃｅｌｓ
分散效果
Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔ
分辨程度
Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ
ｄｅｇｒｅｅｓ
５ 少Ｌｅｓｓ 团状 Ｄｏｕｇｈ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
１０ 多 Ｍｏｒｅ 较好 Ｇｏｏｄ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
１５ 多 Ｍｏｒｅ 好Ｂｅｔｔｅｒ 清晰Ｃｌｅａｒ
２０ 多 Ｍｏｒｅ 过于分散 Ｏｖｅｒｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
２５ 少Ｌｅｓｓ 过于分散 Ｏｖｅｒｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ 模糊Ｂｌｕｒｒｅｄ
（Ｌ）、中长染色体（Ｍ２）、中短染色体（Ｍ１）和短染色体（Ｓ）４种染色体组成。核型公式为２狀＝２ｘ＝２４＝２０ｍ＋
４ｓｍ，核染色体相对长度在７．０７％～１３．１３％，染色体长度比为１．８６，染色体臂比大于２∶１的染色体占８．３３％，
按照Ｓｔｅｂｂｉｎｓ［１７］的核型分类标准，百里香的核型属２Ａ型，核型不对称系数为５９．６３％。
表４　百里香染色体的核型参数
犜犪犫犾犲４　犓犪狉狔狅狋狔狆犲狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊狅犳犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲犻狀犜．犿狅狀犵狅犾犻犮狌狊
染色体序号
Ｎｏ．
染色体相对长度
Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｅｎｇｔｈ（％）
长臂
Ｌｏｎｇａｒｍ（％）
短臂
Ｓｈｏｒｔａｒｍ（％）
臂比
Ａｒｍｒａｔｉｏ
类型
Ｔｙｐｅ
染色体相对长度指数
Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｅｎｇｔｈｉｎｄｅｘ
１ １３．１３ ８．０２ ５．１１ １．５７ Ｌ １．４１
２ １２．１５ ８．０５ ４．１０ １．９６ Ｍ２ １．３０
３ １１．４３ ６．７０ ４．７３ １．４２ Ｍ２ １．２２
４ １０．３４ ６．２４ ４．１０ １．５２ Ｍ２ １．１１
５ ９．４６ ５．３９ ４．０７ １．３２ Ｍ２ １．０１
６ ８．４９ ４．７４ ３．７５ １．２６ Ｍ１ ０．９１
７ ８．３４ ５．５９ ２．７５ ２．０３ Ｍ１ ０．８９
８ ８．３３ ４．７４ ３．５９ １．３２ Ｍ１ ０．８９
９ ８．０４ ４．３６ ３．６８ １．１８ Ｍ１ ０．８６
１０ ７．９１ ４．４５ ３．４６ １．３２ Ｍ１ ０．８５
１１ ７．４１ ４．５０ ２．９１ １．５５ Ｍ１ ０．７９
１２ ７．０７ ４．０６ ３．０１ １．３５ Ｓ ０．７６
６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
图２　百里香染色体形态
犉犻犵．２　犜犺犲犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲犿狅狉狆犺狅犾狅犵狔狅犳犜．犿狅狀犵狅犾犻犮狌狊
图３　百里香染色体的核型图
犉犻犵．３　犓犪狉狔狅狋狔狆犲狅犳犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲犻狀犜．犿狅狀犵狅犾犻犮狌狊
数字１～１２代表染色体序号。Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓａｒｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｓｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｓ．
３　讨论
图４　百里香染色体的核型模式图
犉犻犵．４　犓犪狉狔狅狋狔狆犲狆犪狋狋犲狉狀狅犳犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲犻狀犜．犿狅狀犵狅犾犻犮狌狊
３．１　百里香染色体制片技术的探究
根据李懋学等［１４，１５］提出的植物核型分析标准，确
定百里香的染色体属于小染色体，这给百里香染色体
数目的统计和核型分析带来很大困难。取材部位、取
材时间、预处理液的种类和浓度、预处理时间、酸解的
时间及方法、染色时间等都影响实验的成败。理论上
讲，任何时间取样压片，都可以从正常生长的根中获得
中期分裂相［２０，２１］。但是如果分裂相所占的比例很小，
核型分析就十分困难。李国珍［２２］认为，一般植物细胞
染色体的分裂高峰期在上午的８：００－１０：００，而董然
等［２３］在对长白山３种橐吾（犔犻犵狌犾犪狉犻犪狊犻犫犻狉犻犮犪）的核型
研究中，取材时间为上午１０：００，赵振军［２４］在阿拉伯茶
（犆犪狋犺犪犲犱狌犾犻狊）细胞的研究中得出细胞集中分裂时间在上午８：３０－１１：３０，阎素丽［２５］在对向日葵（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀
狀狌狊）的核型分析中发现上午９：３０－１０：００是取材的最佳时间，而本实验初步观察到百里香在上午８：４５－９：１５间
存在分裂高峰期，将近４０％的细胞处于分裂中期，有利于筛选分散良好的百里香染色体用于核型分析。
在染色体制片中对材料进行预处理主要是阻断纺锤体的形成，使细胞分裂终止在中期阶段，可提高中期分裂
相的出现频率。由于植物不同物种之间的差异性，不同植物所适合的预处理液一般不同。张永兵等［２６］在对甜瓜
（犆狌犮狌犿犻狊犿犲犾狅）的核型分析中用对二氯苯和纺线菌酮的混合液预处理甜瓜根尖，获得了主、次缢痕清晰、分散良
好的中期染色体分裂相，张红梅等［２７］在青花菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪）染色体核型分析中得出用０．００２ｍｏｌ／Ｌ８羟
基喹啉处理２．５ｈ染色体分散性最好。本实验确定在百里香染色体制片中以０．０４％秋水仙素和０．００２ｍｏｌ／Ｌ８
羟基喹啉等体积混合溶液预处理百里香芽尖２～３ｈ，秋水仙素累积分裂中期相最多，结合８羟基喹啉又能使染
色体更清晰、便于观察。
７８１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
３．２　百里香的遗传分类学探讨
国外对百里香属内各组部分种的研究结果表明，Ｍｉｃａｎｔｅｓ组染色体为二倍体，染色体数目为３０，Ｍａｓｔｉｃｈｉｎａ
组的染色体为二倍体和四倍体，染色体数目有３０，５８，６０，染色体基数多为１５或１５的倍数；Ｐｉｐｅｒｅｌａ组的染色体
为二倍体，基数为１４；Ｐｓｅｕｄｏｔｈｙｍｂｒａ组的染色体包括有二倍体和四倍体，染色体数目包括２８，３０，５６，染色体基
数为１４，１５或相应的倍数；Ｔｈｙｍｕｓ组的染色体比较复杂，染色体数目包括有２８，３０，５４，５６，５８，基数多为１４，１５，
２７，２８，２９；Ｈｙｐｈｏｄｒｏｍｉ组染色体数目有２６，２８，４２，５４，５６，５８，６０，６２，８４，９０，染色体基数包括１３，１４，２１及它们的
倍数等等；Ｓｅｒｐｙｌｕｍ组同Ｈｙｐｈｏｄｒｏｍｉ组较相似，染色体数目有２４，２６，２８，３０，３２，３５，５２，５６，５８，８４，９０，染色体
基数包括１２，１３，１４，２１等［１１，２８］。本实验结果表明，甘肃康乐地产野生百里香的染色体为２倍体：２狀＝２ｘ，染色体
基数为１２，对比国外报道的百里香属各组的染色体数目资料，初步比较发现产自甘肃康乐县的百里香染色体数
目及形态特征与百里香属内的Ｓｅｒｐｙｌｕｍ组在染色体基数及数目方面较为相似。一般认为，核型进化的基本趋
势是由对称向不对称发展的，系统演化上处于比较古老或原始的植物，大多具有较对称的核型，而不对称的核型
则常见于衍生的、特化的以及比较进化的植物类群中［１５］。核型不对称系数越接近５０％，核型的对称程度越高，进
化程度越原始，对甘肃地产百里香核型不对称系数和核型类型分析，百里香的核型不对称系数为５９．６３％，接近
于５０％，具有较大的对称性；其核型属２Ａ型，表明甘肃地产百里香在百里香属中是相对较为原始的。而权俊萍
等［１１］对我国４种、２个亚种百里香属植物的研究结果中表明，除百里香种未确定外，其他３种及２个亚种的核型
均为２Ｂ，说明它们在百里香属中是比较进化的，这与对甘肃康乐县地产百里香核型的研究结果有一定的差异，推
测甘肃康乐地产百里香在百里香属中是比较原始，不能归属于上述３种。关于其在百里香属内的系统地位问题，
还需进一步研究，才能作出准确判断。
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９８１第２１卷第１期 草业学报２０１２年