全 文 ：四川白三叶根瘤菌遗传多样性及系统发育研究
潘明洪１，凌瑶２，景文１，马洪平１，彭燕１
（１．四川农业大学动物科技学院，四川 雅安６２５０１４；２．四川农业大学新农村发展研究院，四川 雅安６２５０１４）
摘要：为阐明四川部分地区野生白三叶根瘤菌的遗传多样性及系统发育地位，对分离自四川雅安、康定、泸定、西
昌、成都和乐山６个地区白三叶根瘤的６９株菌进行系统研究。采用１６ＳｒＤＮＡ限制性片段长度多态性分析（ｒｅ
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）和１６ＳｒＤＮＡ 基因、持家基因（狉犲犮犃、犪狋狆犇、犵犾狀犐犐）、结瘤基因
（狀狅犱犆）、固氮基因（狀犻犳犎）系统发育分析的方法进行了研究。结果表明，１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ中所有供试菌株产
生了４种酶切图谱类型，表现出较为丰富的遗传多样性。持家基因与１６ＳｒＤＮＡ基因系统发育分析结果基本一致，
９株代表菌株主要分布在α变形菌纲（犃犾狆犺犪犘狉狅狋犲狅犫犪犮狋犲狉犻犪）的根瘤菌属（犚犺犻狕狅犫犻狌犿），并与豌豆根瘤菌三叶草生物
型（犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻）ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 的亲缘关系较近。ＰＣＲ可扩增出狀狅犱犆和狀犻犳犎 基因片段，但从
属于土壤杆菌属（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿）的菌株ＬＳ１１０５中则扩增不出这两个基因。所有供试菌株被鉴定到了种的水平，
证实了６８株为白三叶根瘤菌，并通过不同采样地点菌株之间的比较，发现白三叶与根瘤菌的共生关系因地理分布
不同而具有多样性，对于丰富白三叶根瘤菌资源及其开发利用具有重要意义。
关键词：白三叶；根瘤菌；遗传多样性；１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ；持家基因；系统发育
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．２０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０５０１４３１０
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０５１６　　
　　 生物固氮是指自然界中的一些微生物和蓝绿藻将大气中的不能被植物利用的氮气还原成可利用的氨的过
程［１］。根瘤菌与豆科植物形成的共生固氮体系具有固氮能力强、固氮量高和抗逆性强等优点，是生物固氮中效率
最高的体系，所固定的氮素约占生物固氮总量的６５％［２］。近来有关的研究日益增多，马霞等［３］发现在适宜氮素
水平下接种根瘤菌可以明显增加紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）的固氮百分率、生物固氮量和种子产量，李智燕
等［４］研究显示天蓝苜蓿根瘤菌比紫花苜蓿根瘤菌具有更强的耐酸、耐铝性，王卫栋等［５］报道接种根瘤菌的紫花苜
蓿在ＮａＣｌ胁迫下具有较强的抗氧化和渗透调节能力。因此，了解根瘤菌的生物多样性，选育高效与抗逆性能优
良的菌株用于农林生产，对于应对日趋严重的环境污染和干旱等逆境问题具有深远的意义。
白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）又名白车轴草、荷兰翘摇等，是三叶草属的重要豆科牧草，因其产量高、品质优良、
适应性强，在四川地区分布广泛，可用作饲料、绿肥、堤岸防护草种、草坪以及蜜源和药材等［６７］。目前，国内外有
关白三叶根瘤菌遗传多样性及系统分类研究的报道颇少。１９７４年《伯杰氏细菌鉴定手册》［８］第８版以宿主范围
为依据，将其确定为三叶草根瘤菌（犚犺犻狕狅犫犻狌犿狋狉犻犳狅犾犻犻）。到了１９８４年，Ｊｏｒｄａｎ［９］将三叶草根瘤菌划分到豌豆根
瘤菌（犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿），定为豌豆根瘤菌三叶草生物型（犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻）。刘晓云和陈文
新［１０］、吕飞等［１１１２］和刘晓云等［１３］在采用１６ＳｒＤＮＡ基因、狀狅犱犃和狀犻犳犎 共生基因序列测定方法进行三叶草根瘤
菌的分类研究中也得到了相一致的结果。
１６ＳｒＤＮＡ因保守性高、信息量大、普遍性及快速简便的特点而被称为分子进化种，并被作为系统分类研究
中最合适的指标［１４］。１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ指纹图谱因具有种的特异性而成为根瘤菌系统分类研究的重要方
法［１５］。此外，持家基因狉犲犮犃、犪狋狆犇、犵犾狀犐犐、犵狔狉犅及狋犺狉犆等［１６］也越来越多地被应用于根瘤菌新种群系统发育地
位的确定，可应用较为广泛的细菌分离水平，从种内到种间的水平以及更高级别的分析［１７１８］。利用不同基因组位
点的保守基因来确定细菌的分类地位，将是细菌分类发展的一个方向［１９］。
第２３卷　第５期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１４３－１５２
２０１４年１０月
收稿日期：２０１４０３３１；改回日期：２０１４０４２５
基金项目：四川省科技支撑项目（Ｎｏ．２０１３ＮＺ００１３）和十二五农村领域国家科技计划课题（Ｎｏ．２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０３）资助。
作者简介：潘明洪（１９８８），男，四川乐山人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗｗｗ．ｐｍｈ６８＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｐｅｎｇｙａｎｌｅｅ＠１６３．ｃｏｍ
本研究采用１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ及１６ＳｒＤＮＡ基因、持家基因（狉犲犮犃、犪狋狆犇、犵犾狀犐犐）、结瘤基因（狀狅犱犆）和
固氮基因（狀犻犳犎）系统发育分析方法，对分离自我国四川雅安、康定、泸定、西昌、成都和乐山６个地区野生白三叶
根瘤的６９株菌进行遗传多样性的研究，为进一步揭示四川白三叶根瘤菌的系统发育地位提供可靠的理论依据，
对于丰富根瘤菌资源具有积极的意义。
１　材料与方法
１．１　材料
供试菌株为本实验室前期分离和保存的白三叶根瘤菌，来源于２０１１年８－９月在四川６个市县收集野生白
三叶的根瘤。根瘤菌的分离按照Ｖｉｎｃｅｎｔ［２０］经典方法进行，挑取单菌落，经过多次纯化，革兰氏染色，镜检，斜面
保藏［２１］。共分离得到供试菌株６９株，宿主植物均为白三叶，菌株编号及来源见表１。
表１　菌株来源及１６犛狉犇犖犃犘犆犚－犚犉犔犘图谱类型
犜犪犫犾犲１　犜犺犲狋犲狊狋犲犱狊狋狉犪犻狀狊犪狀犱狋犺犲狋狔狆犲狊狅犳１６犛狉犇犖犃犘犆犚－犚犉犔犘犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狆犪狋狋犲狉狀狊
供试菌株
Ｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ
来源
Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ
ｏｒｉｇｉｎ
酶切图谱类型
１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰｐａｔｔｅｒｎｓ
犎犪犲Ⅲ 犎犻狀犳Ⅰ 犕狊狆Ⅰ 犎犺犪Ⅰ
酶切图谱类型组合
Ｃｏｍｂｉｎｅｄｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
ｐａｔｔｅｒｎｓ
ＫＤ１１０１，ＫＤ１１０２，ＫＤ１１０３，犓犇１１０４，ＫＤ１１０５，Ｋ１１Ｄ０６，
ＫＤ１１０８，ＫＤ１１０９，ＫＤ１１１０，ＫＤ１１１１，ＫＤ１１１３，ＫＤ１１１４，
ＫＤ１１１６，ＫＤ１１１７，ＫＤ１１１８，ＫＤ１１１９，ＫＤ１１２０，ＫＤ１１２１，
ＫＤ１１２２，Ｋ１１Ｄ２３，ＫＤ１１２４，ＫＤ１１２５，ＫＤ１１２６，ＫＤ１１２７，
ＫＤ１１２８，ＫＤ１１２９
四川康定Ｋａｎｇｄｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａ Ａ Ａ Ａ Ⅰ（ＡＡＡＡ）
ＹＡ１１０１， ＹＡ１１０２， ＹＡ１１０３， ＹＡ１１０４， ＹＡ１１０５，
ＹＡ１１０７， ＹＡ１１０８， ＹＡ１１０９， ＹＡ１１１０， ＹＡ１１１１，
ＹＡ１１１２， ＹＡ１１１３， ＹＡ１１１５， ＹＡ１１１６， ＹＡ１１１８，
犢犃１１２１，ＹＡ１１２３，ＹＡ１１２４，ＹＡ１１２５
四川雅安Ｙａ’ａｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａ Ａ Ａ Ａ Ⅰ（ＡＡＡＡ）
ＸＣ１１０１，ＸＣ１１０２，ＸＣ１１０３，ＸＣ１１０４，ＸＣ１１０５，ＸＣ１１０７，
ＸＣ１１０８，ＸＣ１１０９，犡犆１１１０，ＸＣ１１１２
四川西昌Ｘｉｃｈａｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａ Ａ Ａ Ａ Ⅰ（ＡＡＡＡ）
ＣＤ１１０１，ＣＤ１１０２，ＣＤ１１０３，ＣＤ１１０４，犆犇１１０５，ＣＤ１１０６，
ＣＤ１１０８
四川成都Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａ Ａ Ａ Ａ Ⅰ（ＡＡＡＡ）
犔犛１１０２，ＬＳ１１０３ 四川乐山Ｌｅｓｈａｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａ Ａ Ａ Ａ Ⅰ（ＡＡＡＡ）
犔犇１１０２，ＬＤ１１０３ 四川泸定Ｌｕｄｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａ Ａ Ａ Ａ Ⅰ（ＡＡＡＡ）
犔犛１１０１ 四川乐山Ｌｅｓｈａｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｂ Ｂ Ｂ Ｂ Ⅱ（ＢＢＢＢ）
犔犛１１０５ 四川乐山Ｌｅｓｈａｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ⅲ（ＣＡＣＡ）
犓犇１１０７ 四川康定Ｋａｎｇｄｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｄ Ｃ Ｄ Ｃ Ⅳ（ＤＣＤＣ）
　表中粗体字体表示为所选取的代表菌株。ＴｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｓｉｎｂｏｌｄａｒｅｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｉｎｔｈｅＴａｂｌｅ．
１．１．１　主要试剂和仪器　本研究所使用的ＰＣＲ试剂及琼脂糖凝胶电泳试剂购于天根生化科技（北京）有限公
司，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，限制性内切酶来自ＮＥＢ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）公司。主要仪器
包括超净工作台，生化培养箱，恒温水浴锅，台式离心机，ＰＣＲ扩增仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，美国），ＢｉｏＲａｄ凝胶成像系统。
１．１．２　供试菌株的培养　供试菌株均用ＹＭＡ培养基［２２］培养，其成分为：甘露醇１０．０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，
Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，酵母粉３．０ｇ，琼脂１８～２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ６．８～７．０，培养温度为２８℃。
１．２　根瘤菌ＤＮＡ的提取
本研究的相关试验工作从２０１３年５月开始在四川农业大学草业工程实验室进行。ＤＮＡ的提取方法参照文
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
献［２３］，以纯根瘤菌为材料进行。用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测样品ＤＮＡ的浓度，所有的ＤＮＡ样品于－２０℃
保存备用。
１．３　１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ扩增与ＲＦＬＰ分析
以总ＤＮＡ为模板，使用来源于大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）１６ＳｒＤＮＡ 序列保守区域的２个引物Ｐ１（５′
ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＣＴ３′）和 Ｐ６（５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴ
ＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣ３′），分别对应于大肠杆菌的第８～３７碱基位置和第１４７９～１５０６碱基位置［２４］。引物
Ｐ１ 和Ｐ６ 配制成１０μｍｏｌ／Ｌ浓度备用。ＰＣＲ反应体系为５０μＬ，其中Ｐ１ 和Ｐ６ 各１μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ，２×Ｔａｑ
ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至５０μＬ。ＰＣＲ扩增条件为：９４℃
预变性３ｍｉｎ；３０个循环（９４℃，变性，１ｍｉｎ；５５℃，退火，１ｍｉｎ；７２℃，延伸，２ｍｉｎ）；７２℃，延伸，１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产
物经１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测，于－２０℃保存。
参照ＳｅｌｅｎｓｋａＰｏｂｅｌ等［２５］的方法，用犎犪犲Ⅲ、犕狊狆Ⅰ、犎犻狀犳Ⅰ和犎犺犪Ⅰ４种限制性内切酶进行酶切。酶切
反应体系为２０μＬ，其中ＰＣＲ产物１０μＬ，１０×ＮＥＢ缓冲液２μＬ，内切酶０．５μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ，过夜酶切，
温度为３７℃。以２．０％琼脂糖凝胶电泳，１００Ｖ，２ｈ，用自动凝胶成像系统拍照。对酶切电泳图谱进行分类，电泳
图谱上不同菌株具有相同的电泳条带被认为是同一个遗传图谱类型。
１．４　１６ＳｒＤＮＡ序列分析
根据１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ遗传图谱类型，选取每种图谱类型组合中的代表菌株，将其１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ扩
增产物送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序，测序引物同扩增引物。将测得的序列经拼接后
与从ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）上获得的根瘤菌相关种的序列进行比对，经ＣｌｕｓｔａｌＸ［２６］和ＴｒｅｅｃｏｎＷ［２７］软件包分析，用
软件 ＭＥＧＡ５．１０按照Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ［２８］法构建出以１６ＳｒＤＮＡ序列为基础的系统发育树，并使用软件ＤＮＡ
ＭＡＮ６．０计算各测试菌株１６ＳｒＤＮＡ序列的相似性。
１．５　持家基因（狉犲犮犃、犪狋狆犇、犵犾狀犐犐）与结瘤基因（狀狅犱犆）和固氮基因（狀犻犳犎）的系统发育分析
持家基因的ＰＣＲ扩增引物参照文献［２９］。反应体系为５０μＬ，其中２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ，正向引
物和反向引物各１μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２１．５μＬ。１）狉犲犮犃扩
增条件：９５℃，预变性，３ｍｉｎ；３０个循环（９４℃，变性，１ｍｉｎ；５４℃，退火，１ｍｉｎ；７２℃，延伸，１ｍｉｎ）；７２℃，延伸，６
ｍｉｎ。２）犪狋狆犇扩增条件：９５℃，预变性，３ｍｉｎ；３０个循环（９４℃，变性，１ｍｉｎ；５８℃，退火，１ｍｉｎ；７２℃，延伸，１
ｍｉｎ）；７２℃，延伸，６ｍｉｎ。３）犵犾狀犐犐扩增条件：９５℃，预变性，３ｍｉｎ；３０个循环（９４℃，变性，１ｍｉｎ；５５℃，退火，１
ｍｉｎ；７２℃，延伸，１ｍｉｎ）；７２℃，延伸，６ｍｉｎ。
狀狅犱犆和狀犻犳犎 基因ＰＣＲ扩增所用引物见文献［３０］。反应体系为５０μＬ，其中２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５
μＬ，正向引物和反向引物各１μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２１．５μＬ。
１）狀狅犱犆基因扩增条件：９５℃，预变性，３ｍｉｎ；３０个循环（９４℃，变性，３０ｓ；５５℃，退火，４０ｓ；７２℃，延伸，１ｍｉｎ）；
７２℃，延伸，６ｍｉｎ。２）狀犻犳犎 基因扩增条件：９５℃，预变性，４ｍｉｎ；３０个循环（９４℃，变性，３０ｓ；５７℃，退火，３０ｓ；
７２℃，延伸，１ｍｉｎ）；７２℃，延伸，５ｍｉｎ。
各基因ＰＣＲ产物用１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测后，亦送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序。用
软件 ＭＥＧＡ５．１０分别对测得的代表菌株的基因序列与相应的参比菌株序列进行比对，用邻接法构建系统发育
树，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ为１０００。
２　结果与分析
２．１　供试菌株１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ扩增结果
以总ＤＮＡ为模板，Ｐ１ 和Ｐ６ 为引物，供试菌株的１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ产物均能在１．０％琼脂糖凝胶电泳检测出
条带，大小约为１．５ｋｂ，这说明供试根瘤菌与其他细菌的１６ＳｒＤＮＡ片段大小基本一致。
２．２　１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析
１６ＳｒＤＮＡ的扩增产物分别采用４种限制性内切酶（犎犪犲Ⅲ、犕狊狆Ⅰ、犎犻狀犳Ⅰ和犎犺犪Ⅰ）进行酶切，经２．０％
５４１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
琼脂糖凝胶电泳后拍照成像。供试菌株的犎犪犲Ⅲ和犕狊狆Ⅰ酶切分别有４种图谱类型，犎犻狀犳Ⅰ和犎犺犪Ⅰ酶切分
别有３种图谱类型（图１）。电泳图谱上不同菌株间迁移率相同的带被认为是同一个性状，随机标记为Ａ→Ｄ。所
有６９株供试菌株的１６ＳｒＤＮＡ的酶切图谱类型总共有４种不同组合类型（表１），其中有Ⅰ类型（ＡＡＡＡ）６６株
菌，占据供试菌株的９５．７％，其余Ⅱ（ＢＢＢＢ）、Ⅲ（ＣＡＣＡ）、Ⅳ（ＤＣＤＣ）３种类型各有１株菌，仅占４．３％。结果表
明，分离自白三叶草的根瘤菌１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ图谱存在较大差异，既有广泛分布于各取样地点的Ⅰ类
型，同时又有来源于四川康定的Ⅰ和Ⅳ２种类型及四川乐山的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ３种类型，所有供试菌株表现出一定的遗
传变异和地域差异。
图１　供试菌株１６犛狉犇犖犃犘犆犚－犚犉犔犘酶切组合图谱
犉犻犵．１　１６犛狉犇犖犃犘犆犚－犚犉犔犘犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狆犪狋狋犲狉狀狊
大写字母分别代表４种限制性酶切图谱类型Ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｐａｔｔｅｒｎｓ；Ｍ．ＤＬ１００．
　
２．３　１６ＳｒＤＮＡ序列分析
根据１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析结果和来源的不同挑选出９株代表菌株进行１６ＳｒＤＮＡ序列测定和系统
发育分析，并在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中比对相似序列。总共选取１２株参比菌株，采用邻接法构建系统发育树（图２）。
由图２可知，９株代表菌株分别归属于根瘤菌属（犚犺犻狕狅犫犻狌犿）、土壤杆菌属（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿）２个系统分支。
图谱类型为Ⅰ型（ＡＡＡＡ）的ＸＣ１１１０、ＬＤ１１０２、ＣＤ１１０５、ＫＤ１１０４、ＬＳ１１０２、ＹＡ１１２１，Ⅱ型（ＢＢＢＢ）的ＬＳ１１０１，Ⅳ型
（ＤＣＤＣ）的ＫＤ１１０７的共８株菌株与根瘤菌属构成一个分支。其中，菌株ＸＣ１１１０和ＬＤ１１０２与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪
狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 和犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狏犻犮犻犪犲ＵＳＤＡ２３７０Ｔ 聚在一起，其相似性为１００％。菌
株 ＫＤ１１０４、ＣＤ１１０５、ＫＤ１１０７、ＬＳ１１０１、ＹＡ１１２１、ＬＳ１１０２具有相同的序列，与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻
ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 和犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狏犻犮犻犪犲ＵＳＤＡ２３７０Ｔ 序列相似性最高，达到了９９．７％。图谱类型为Ⅲ
型（ＣＡＣＡ）的菌株ＬＳ１１０５则与土壤杆菌属单独形成一支，与犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ＮＣＰＰＢ２４３７Ｔ 的亲缘关系最近，相
似性达到了９９．５％。代表菌株与已知种的模式菌株的序列相似性，均大于目前界定属内１６ＳｒＤＮＡ序列相似性
９５％的标准［３１］。以上结果表明，白三叶根瘤菌因存在的地理环境的不同而表现出一定的差异性，甚至在同一地
理环境下也有较大程度的变异，与１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ酶切图谱类型分类结果基本一致。
６４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
图２　代表菌株１６犛狉犇犖犃序列构建的系统发育树
犉犻犵．２　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀１６犛狉犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狋犺犲狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲狊狋狉犪犻狀狊
　图中大写字母Ｔ上标表示模式菌株，粗体表示所选取的代表菌株，括号里面表示ＧｅｎＢａｎｋ序列接收号。下同。Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｓａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｗｉｔｈａ
ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴ，ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓａｒｅｉｎｂｏｌｄａｎｄａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋａｒｅｇｉｖｅｎｉｎｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
　
２．４　持家基因序列分析
根据１６ＳｒＤＮＡ序列分析和１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ，对所选的９株代表菌株进行持家基因（狉犲犮犃、犪狋狆犇 和
犵犾狀犐犐）部分序列的系统发育分析，采用邻接法构建的系统发育树如图３所示。
结果表明，持家基因的系统发育分析结果与１６ＳｒＤＮＡ系统发育分析结果基本一致，供试菌株也归属于根瘤
菌属和土壤杆菌属２个系统分支。其中，代表菌株 ＫＤ１１０７、ＫＤ１１０４、ＸＣ１１１０、ＣＤ１１０５、ＬＳ１１０１、ＬＳ１１０２和
ＹＡ１１２１共７株具有相同的序列而聚在一起，与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 的关系较近，序列
相似性在９３．４％～９５．０％之间。ＬＤ１１０２与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 和犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪
狉狌犿ｂｖ．狏犻犮犻犪犲ＵＳＤＡ２３７０Ｔ 聚在一起，且与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狏犻犮犻犪犲ＵＳＤＡ２３７０Ｔ 的关系较近，相似性为
９７．８％。ＬＳ１１０５亦与犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ＮＣＰＰＢ２４３７Ｔ 聚在一起，它们之间的相似性为９２．４％。
２．５　狀狅犱犆和狀犻犳犎 基因序列分析
所选取的９株代表菌株，除了ＬＳ１１０５外，ＰＣＲ均能成功扩增出狀狅犱犆和狀犻犳犎 基因，所构建的系统发育树如
图４和图５。
在狀狅犱犆基因构建的系统发育树中，ＹＡ１１２１、ＸＣ１１１０、ＬＳ１１０２、ＬＳ１１０１具有相同的序列，与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪
狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 相似性为９７．４％，ＫＤ１１０７、ＫＤ１１０４、ＣＤ１１０５与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻
ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 相似性为９５．７％，ＬＤ１１０２与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 相似性为９５．６％。
在狀犻犳犎 基因构建的系统发育树中，菌株 ＫＤ１１０７、ＫＤ１１０４和ＬＤ１１０２与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻
９．２ｋ具有相同的序列，相似性为１００％。ＬＳ１１０２、ＸＣ１１１０、ＬＳ１１０１、ＣＤ１１０５和ＹＡ１１２１具有相同的序列，与犚．
犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻Ｒ２１的亲缘关系最近，相似性为９７．５％。
７４１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
图３　代表菌株持家基因狉犲犮犃、犪狋狆犇和犵犾狀犐犐拼接后的系统发育树
犉犻犵．３　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀犮狅狀犮犪狋犲狀犪狋犲犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狉犲犮犃，犪狋狆犇，犪狀犱犵犾狀犐犐狅犳狋犺犲狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲狊狋狉犪犻狀狊
　
图４　代表菌株结瘤基因狀狅犱犆构建的系统发育树
犉犻犵．４　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀狀狅犱狌犾犪狋犻狅狀犵犲狀犲狀狅犱犆狅犳狋犺犲狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲狊狋狉犪犻狀狊
　
以上结果表明，除了ＬＳ１１０５以外的８菌株均以犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻亲缘关系最近，可以确定其
为三叶草根瘤菌。
３　讨论
本研究以分离自我国四川部分地区野生豆科植物白三叶根瘤的６９株菌株为研究对象，充分结合１６ＳｒＤＮＡ
８４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
ＰＣＲ－ＲＦＬＰ、持家基因（犪狋狆犇、狉犲犮犃和犵犾狀犐犐）及共生基因的系统发育分析等方法进行了遗传多样性和系统发育
研究，初步探讨了四川地区白三叶根瘤菌可能的分类地位，对于进一步丰富中国根瘤菌资源的研究具有积极的意
义。
图５　代表菌株固氮基因狀犻犳犎构建的系统发育树
犉犻犵．５　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀狀犻狋狉狅犵犲狀犳犻狓犻狀犵犵犲狀犲狀犻犳犎狅犳狋犺犲狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲狊狋狉犪犻狀狊　
结合１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ、１６ＳｒＤＮＡ序列分析结果，６９株供试菌株被鉴定到属的水平。来自于康定、乐
山的菌株具有变异的图谱类型，而来自雅安、泸定、西昌和成都的菌株具有单一的图谱。酶切图谱类型为Ⅰ型
（ＡＡＡＡ）的 ＫＤ１１０４、ＹＡ１１２１、ＸＣ１１１０、ＣＤ１１０５、ＬＤ１１０２、ＬＳ１１０１，Ⅱ型（ＢＢＢＢ）的 ＬＳ１１０１，Ⅳ型（ＤＣＤＣ）的
ＫＤ１１０７三种类型的８株菌株归属于根瘤菌属，而Ⅲ型（ＣＡＣＡ）的菌株ＬＳ１１０５归属于土壤杆菌属，所有供试菌
株共归为两个属，较为单一。这与刘晓云和陈文新［１０］分离自三叶草的根瘤菌分别归属于快生根瘤菌属、中华根
瘤菌属（犛犻狀狅狉犺犻狕狅犫犻狌犿）、中慢生根瘤菌属（犕犲狊狅狉犺犻狕狅犫犻狌犿）和慢生根瘤菌属（犅狉犪犱狔狉犺犻狕狅犫犻狌犿）的研究结果不太
一致，显示出其属、种在地区分布的局限性和专一性，可能与四川盆地特殊的地理环境和气候条件有关。因为刘
晓云和陈文新［１０］分离的根瘤菌主要来自江西、湖北和云南等地的三叶草属植物，范围也相对较广，从而具有较好
的多样性。本研究与众多现有的研究一致，根瘤菌与豆科植物的共生关系因区域地理环境的差异而具一定的多
样性［３２］，而同一采样地点的根瘤菌在很大程度上受地域、生态环境影响而表现为相似的类群，这与Ｔｉａｎ等［３３］、杨
亚珍等［３４］、何恒斌等［３５］、阎爱民和陈文新［３６］的研究结果吻合。此外，各个采样点的菌株虽然在酶切图谱上有一
定差异，但在１６ＳｒＤＮＡ系统发育树上则处于相同的位置，与冀玉良等［３７］的研究结果相似。在今后的研究中有
待扩大地理范围和菌株数量，以更全面地探索白三叶根瘤菌的种属分布和系统分类。
持家基因的系统发育分析结果与１６ＳｒＤＮＡ系统发育分析结果基本一致。除了ＬＤ１１０２与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪
狉狌犿ｂｖ．狏犻犮犻犪犲ＵＳＤＡ２３７０Ｔ 外，代表菌株ＫＤ１１０４、ＣＤ１１０５、ＫＤ１１０７、ＬＳ１１０１、ＹＡ１１２１、ＬＳ１１０２、ＸＣ１１１０共７株
与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 的亲缘关系最近，ＬＳ１１０５与犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ＮＣＰＰＢ２４３７Ｔ 最
近。在关于三叶草根瘤菌的系统分类研究中，Ｊｏｒｄａｎ［９］将三叶草根瘤菌定为豌豆根瘤菌的１个生物型犚．犾犲犵狌
犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻。刘晓云和陈文新［１０］、吕飞等［１１１２］的研究中供试的三叶草根瘤菌，与三叶草根瘤菌犚．
狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＲＰＶ０２、豌豆根瘤菌犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ＵＳＤＡ２３７０的序列相似性最高，亲缘关系最为接近。本研究
９４１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
中所供试的白三叶根瘤菌与犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狋狉犻犳狅犾犻犻ＡＴＣＣ１４４８０Ｔ 和犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿ｂｖ．狏犻犮犻犪犲
ＵＳＤＡ２３７０Ｔ 的亲缘关系较近，结果支持Ｊｏｒｄａｎ［９］的观点，即过去的三叶草根瘤菌、豌豆根瘤菌和菜豆根瘤菌３
个种合并为１个种，以犚．犾犲犵狌犿犻狀狅狊犪狉狌犿命名。
１６ＳｒＤＮＡ和持家基因序列分析与１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析结果具有一定的差异。其可能的原因为：１）
１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ广泛用于大量菌株的快速分群，在数据处理过程中可能因人为的判断而产生误差。２）
同一株菌株中有可能存在１６ＳｒＤＮＡ基因的不同拷贝，序列有所差异，导致酶切结果与序列分析结果不一致。３）
１６ＳｒＤＮＡ序列分析可以鉴定到属，但基因的横向转移及重组会影响亲缘关系的远近［３８］。４）１６ＳｒＤＮＡ核糖体
基因的高度保守性，只能鉴定到属及容易鉴别的种，区分关系比较接近的种或菌株存在一定的局限［３９］。
此外，本研究从白三叶根瘤中分离得到了土壤杆菌ＬＳ１１０５，此结果与国内外学者在分离根瘤菌的过程中经
常获得土壤杆菌的结果一致［４０４１］。Ｍｈａｍｄｉ等［４２］、Ｗａｎｇ等［４３］分别用犵狌狊犃和ＣＦＰ标记土壤杆菌进行了相关研
究，结果表明，土壤杆菌不具备结瘤能力，但在根瘤菌的存在下可以进入根瘤中定殖，与根瘤菌共存于根瘤内。此
外，菌株ＬＳ１１０５扩增不出结瘤基因狀狅犱犆和固氮基因狀犻犳犎，同常佳丽［４４］的研究结果一致，表明其不含共生基因，
与其不能单独侵染豆科植物结瘤相吻合。
４　结论
在本研究所分离自野生白三叶根瘤的６９株菌株中，１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ有４种图谱类型，表明白三叶根
瘤菌在四川具有较为丰富的多样性，且表现出一定的地域分布特征。１６ＳｒＤＮＡ基因、持家基因、结瘤基因、固氮
基因的系统发育分析，证实了所分离菌株有６８株为三叶草根瘤菌，且土壤杆菌不能扩增出结瘤基因狀狅犱犆、固氮
基因狀犻犳犎 等共生基因。这对于研究白三叶根瘤菌的分类鉴定及遗传多样性提供了理论依据，为丰富四川地区
白三叶根瘤菌资源及筛选能用于生产上的高效优良菌株奠定了基础，具有重大的现实指导意义。
参考文献：
［１］　陈强，陈文新，张小平，等．四川省葛藤属根瘤菌的遗传多样性研究［Ｊ］．中国农业科学，２００４，３７（１１）：１６４１１６４６．
［２］　陈文新，汪恩涛．中国根瘤菌［Ｍ］．北京：科学出版社，２０１１．
［３］　马霞，王丽丽，李卫军，等．不同施氮水平下接种根瘤菌对苜蓿固氮效能及种子生产的影响［Ｊ］．草业学报，２０１３，２２（１）：
９５１０２．
［４］　李智燕，邢学峰，唐华，等．铝和酸胁迫对苜蓿根瘤菌生长和抗氧化酶系的影响［Ｊ］．草业学报，２０１３，２２（３）：１４６１５３．
［５］　王卫栋，杨培志，张攀，等．共生根瘤菌对 ＮａＣｌ胁迫下紫花苜蓿抗氧化和渗透调节能力的影响［Ｊ］．草业学报，２０１３，
２２（５）：１２０１２７．
［６］　贾慎修，祝廷成，黄文惠，等．中国饲用植物志［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８７：３２１３３７．
［７］　李州，彭燕，苏星源．不同叶型白三叶抗氧化保护及渗透调节生理对干旱胁迫的响应［Ｊ］．草业学报，２０１３，２２（２）：２５７２６３．
［８］　ＢｕｃｈａｎａｎＲＥ，ＧｉｂｂｏｎｓｂｉａｎＮＥ．伯杰氏鉴定细菌学手册（第８版）［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７４：６５８．
［９］　ＪｏｒｄａｎＤＣ．ＦａｍｉｌｙＩＩＩ．犚犺犻狕狅犫犻犪犮犲犪犲［Ａ］．Ｉｎ：ＫｒｉｅｇＮＲ，ＨｏｌｔＪＧ．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｔｈｅ
ＷｉｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓＣｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ，１９８４：２３４２４２．
［１０］　刘晓云，陈文新．三叶草、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析和数值分类研究［Ｊ］．中国农业大学学
报，２００３，８（３）：１６．
［１１］　吕飞，蒋欣，徐佳洁，等．新疆和陕西三叶草属根瘤菌１６ＳｒＤＮＡ多态性及系统发育研究［Ｊ］．草地学报，２００９，１７（３）：３０４
３０９．
［１２］　吕飞．新疆和陕西部分地区三叶草属根瘤菌多样性及系统发育研究［Ｄ］．西安：西北农林科技大学，２００９．
［１３］　刘晓云，戴燕燕，郭振国，等．三叶草根瘤菌ＳＤＳＰＡＧＥ分析及结瘤试验分子验证［Ｊ］．草业科学，２０１０，２７（１）：７９８４．
［１４］　ＷｏｅｓｅＣＲ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１９８７，５１（２）：２２１．
［１５］　ＶａｎｄａｍｍｅＰ，ＰｏｔＢ，ＧｉｌｉｓＭ，犲狋犪犾．Ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃｔａｘｏｎｏｍｙ，ａｃｏｎｓｅｎｓｕｓａｐｐｒｏａｃｈｔｏｂａｃｔｅｒｉａｌｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１９９６，６０（２）：４０７４３８．
［１６］　王风芹，张勇法，刘杰，等．合欢，金合欢和银合欢根瘤菌系统发育研究方法比较［Ｊ］．微生物学报，２００８，４８（１）：１７．
０５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
［１７］　ＧｅｖｅｒｓＤ，ＣｏｈａｎＦＭ，ＬａｗｒｅｎｃｅＪＧ，犲狋犪犾．Ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｎｇｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，
３（９）：７３３７３９．
［１８］　窦雅静，陆俊锟，康丽华，等．黑木相思根瘤菌遗传多样性［Ｊ］．微生物学报，２０１２，５２（１２）：１４３９１４４８．
［１９］　ＭａｒｔｅｎｓＭ，ＤａｗｙｎｄｔＰ，ＣｏｏｐｍａｎＲ，犲狋犪犾．Ａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｉｅｓ：ａｃａｓｅｓｔｕｄｙ
ｕｓｉｎｇ１０ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓ犈狀狊犻犳犲狉（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｆｏｒｍｅｒ犛犻狀狅狉犺犻狕狅犫犻狌犿）［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，５８（１）：２００２１４．
［２０］　ＶｉｎｃｅｎｔＪＭ．Ｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｒｈｉｚｏｂｉａ［Ａ］．Ｉｎ：ＶｉｎｃｅｎｔＪＭ．ＡＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＰｒａｃｔｉｃａｌＳｔｕｄｙ
ｏｆｔｈｅＲｏｏｔｎｏｄｕｌｅＢａｃｔｅｒｉａ［Ｍ］．ＯｘｆｏｒｄａｎｄＥｄｉｎｂｕｒｇｈ：ＢｌａｃｋｗｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７０：１１３．
［２１］　韦革宏，刘虎岐，孙科技，等．河南省豆科植物根瘤菌表型多样性研究［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００２，
３０（３）：７１７５．
［２２］　ＢｅｒｇｅｒｓｅｎＦＪ．Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆ犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｉｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｅｄｉａ［Ｊ］．ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９６１，１４（３）：３４９
３６０．
［２３］　陈强，张小平，李登煜，等．从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌ＤＮＡ的方法［Ｊ］．微生物学通报，２００２，２９（６）：６３６７．
［２４］　谭志远，牛天贵，陈文新．天山根瘤菌（犚．狋犻犪狀狊犺犪狀犲狀狊犲）模式菌株１６ＳｒＤＮＡ全序列测定及其系统发育［Ｊ］．高技术通讯，
１９９７，１：５８．
［２５］　ＳｅｌｅｎｓｋａＰｏｂｅｌＳ，ＥｖｇｕｅｎｉｅｖａＨａｃｋｅｎｂｅｒｇＥ，ＲａｄｅｖａＧ，犲狋犪犾．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ犚犺犻狕狅犫犻狌犿‘犺犲犱狔狊犪狉犻’ｂｙＲＦＬＰａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄｒＤＮＡａｎｄｂｙｇｅｎｏｍｉｃＰＣＲｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，８０（５）：５１７５２８．
［２６］　ＴｈｏｍｐｓｏｎＪＤ，ＧｉｂｓｏｎＴＪ，ＰｌｅｗｎｉａｋＦ，犲狋犪犾．ＴｈｅＣＬＵＳＴＡＬ＿Ｘｗｉｎｄｏｗｓｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｉｄｅｄｂｙｑｕａｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２４）：４８７６４８８２．
［２７］　ＶａｎｄｅＰｅｅｒＹ，ＤｅＷａｃｈｔｅｒＲ．ＴＲＥＥＣＯＮｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ：ａｓｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅｆｏｒｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｒａｗｉｎｇｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ａｒｙｔｒｅｅｓｆｏｒｔｈｅＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｉｎｄｏｗｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｊ］．ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＣＡＢＩＯＳ，１９９４，１０（５）：５６９
５７０．
［２８］　ＳａｉｔｏｕＮ，ＮｅｉＭ．Ｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ：ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，１９８７，４（４）：４０６４２５．
［２９］　Ｉｓｌａｍ ＭＳ，ＫａｗａｓａｋｉＨ，ＭｕｒａｍａｔｓｕＹ，犲狋犪犾．犅狉犪犱狔狉犺犻狕狅犫犻狌犿犻狉犻狅犿狅狋犲狀狊犲ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｔｕｍｏｒｌｉｋｅｒｏｏｔｏｆｔｈｅ
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１４１６１４２９．
［３０］　ＬｉＭ，ＬｉＹ，ＣｈｅｎＷＦ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｒｈｉｚｏｂｉａｉｎｔｈｅｒｏｏｔｎｏｄｕｌｅｓｏｆ犆犪
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３５（４）：２３９２４５．
［３１］　谭志远，陈文新．根瘤菌新类群代表菌株的１６ＳｒＤＮＡ全序列测定及其系统发育地位［Ｊ］．微生物学报，１９９７，３７（６）：４１１
４１６．
［３２］　ＣｈｅｎＷＸ，ＷａｎｇＥＴ，ＣｈｅｎＷＦ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙｏｆｒｈｉｚｏｂｉａａｎｄｌｅｇｕｍｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｇｅ
ｏｇｒａｐｈｉｃａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｔｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＳｉｎｉｃａ，２００４，３７（１）：８１８６．
［３３］　ＴｉａｎＣＦ，ＺｈｏｕＹＪ，ＺｈａｎｇＹＭ，犲狋犪犾．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｒｈｉｚｏｂｉａｎｏｄｕｌａｔｉｎｇｓｏｙｂｅａｎｓｕｇｇｅｓｔｓｅｘｔｅｎｓｉｖｅｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ
ｏｆｌｉｎｅａｇｅｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓｉｎａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，１０９（２２）：８６２９８６３４．
［３４］　杨亚珍，韦革宏，万晓红，等．西北地区甘草根瘤菌的表型多样性研究［Ｊ］．微生物学通报，２００４，３１（２）：２０２５．
［３５］　何恒斌，贾昆峰，贾桂霞，等．沙冬青根瘤菌的抗逆性［Ｊ］．植物生态学报，２００６，３０（１）：１４０１４６．
［３６］　阎爱民，陈文新．苜蓿，草木樨，锦鸡儿根瘤菌的表型多样性分析［Ｊ］．生物多样性，１９９９，７（２）：１８．
［３７］　冀玉良，李堆淑，赵龙飞，等．陕西商洛部分地区刺槐根瘤菌的遗传多样性和系统发育［Ｊ］．农业生物技术学报，２０１３，
２１（１１）：１３７３１３８３．
［３８］　ＧａｕｎｔＭ Ｗ，ＴｕｒｎｅｒＳＬ，ＲｉｇｏｔｔｉｅｒＧｏｉｓＬ，犲狋犪犾．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓｏｆ犪狋狆犇ａｎｄ狉犲犮犃ｓｕｐｐｏｒｔｔｈｅｓｍａｌｓｕｂｕｎｉｔｒＲＮＡｂａｓｅｄｃｌａｓ
ｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｈｉｚｏｂｉａ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，５１（６）：２０３７２０４８．
［３９］　ＦｏｘＧＥ，ＷｉｓｏｔｚｋｅｙＪＤ，ＪｕｒｔｓｈｕｋＰ．Ｈｏｗｃｌｏｓｅｉｓｃｌｏｓｅ：１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｔｙｍａｙｎｏｔｂｅｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｇｕａｒａｎｔｅｅ
ｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｔｙ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９２，４２（１）：１６６１７０．
１５１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
［４０］　ＬｉｕＸＹ，ＷａｎｇＥＴ，ＬｉＹ，犲狋犪犾．Ｄｉｖｅｒｓｅｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｏｏｔｎｏｄｕｌｅｓｏｆ犜狉犻犳狅犾犻狌犿，犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪ａｎｄ犕犻犿狅狊犪ｇｒｏｗｎｉｎ
ｔｈｅｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌｒｅｇｉｏｎｓｏｆＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１８８（１）：１１４．
［４１］　ＭｈａｍｄｉＲ，ＭｒａｂｅｔＭ，ＬａｇｕｅｒｒｅＧ，犲狋犪犾．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆ犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊ｎｏｄｕｌｅｓｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｌｉｋｅｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｃａ
ｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，５１（２）：１０５１１１．
［４２］　ＭｈａｍｄｉＲ，ＬａｇｕｅｒｒｅＧ，ＡｏｕａｎｉＭＥ，犲狋犪犾．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｓｙｍｂｉｏｔｉｃｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｆｉｅｌｄｒｈｉｚｏｂｉａｃａｎｎｏｄｕｌａｔｅ犘犺犪狊犲狅
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［４３］　ＷａｎｇＬＬ，ＷａｎｇＥＴ，ＬｉｕＪ，犲狋犪犾．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｏｃｃｕｐａｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔｎｏｄｕｌｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆ犕犲犾犻犾狅狋狌狊犱犲狀狋犪狋狌狊ｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿
狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００６，５２（３）：４３６４４３．
［４４］　常佳丽．三叶草根瘤中根瘤菌与土壤杆菌关系的初步研究［Ｄ］．西安：西北农林科技大学，２０１０．
犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犪狀犱狆犺狔犾狅犵犲狀狔狅犳狉犺犻狕狅犫犻犪犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犻狀犛犻犮犺狌犪狀犘狉狅狏犻狀犮犲
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ｉｎｇｇｅｎｅｓ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ
２５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５