全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０１１３ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
李莹，柳参奎．碱茅６磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析．草业学报，２０１５，２４（１）：９９１０６．
ＬｉＹ，ＬｉｕＳＫ．Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆａ犜犘犛ｇｅｎｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎ犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，
２４（１）：９９１０６．
碱茅６磷酸海藻糖合成酶基因的
克隆及其耐逆性分析
李莹１，２，柳参奎１
（１．东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，黑龙江 哈尔滨１５００４０；２．黑龙江八一农垦大学
寒地作物种质改良与栽培重点实验室，黑龙江 大庆１６３３１９）
摘要：从碱茅酵母ｃＤＮＡ文库中经过 ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３ 筛选，均得到长为１１５３ｂｐ碱茅６磷酸海藻糖合成酶基因
（犘狌狋犜犘犛）片段。通过３′ＥｎｄｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ方法获得基因缺失的３′序列，该基因全长３３５８ｂｐ，编码８８２个氨
基酸。氨基酸序列比较结果表明，犘狌狋犜犘犛氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的ＴＰＳ蛋白的同源性
高达６０％～９０％。利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ技术，研究该基因的组织表达模式及ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３ 胁迫处理下基因的表达
模式变化；同时对转ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理，观察其在逆境下的生存
表现。结果表明，犘狌狋犜犘犛具有组织表达特异性，其中在根和花中表达量最大；ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３ 会诱导犘狌狋犜犘犛 基
因在根和叶中的上调表达；同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研
究结果表明，碱茅犘狌狋犜犘犛基因与逆境之间具有一定的应答关系，并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。
关键词：碱茅；６磷酸海藻糖合成酶；基因表达；酵母
犆犾狅狀犻狀犵狅犳犪犜犘犛犵犲狀犲犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犻狋狊犳狌狀犮狋犻狅狀犻狀狊狋狉犲狊狊狋狅犾犲狉犪狀犮犲犻狀犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪
狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
ＬＩＹｉｎｇ１，２，ＬＩＵＳｈｅｎｋｕｉ１
１．犃犾犽犪犾犻犛狅犻犾犖犪狋狌狉犪犾犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犛犮犻犲狀犮犲犆犲狀狋犲狉，犖狅狉狋犺犲犪狊狋犉狅狉犲狊狋狉狔犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪狉犫犻狀１５００４０，犆犺犻狀犪；２．犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犆狉狅狆
犌犲狉犿狆犾犪狊犿犐犿狆狉狅狏犲犿犲狀狋犪狀犱犆狌犾狋犻狏犪狋犻狅狀犻狀犆狅犾犱犚犲犵犻狅狀狊，犎犲犻犾狅狀犵犼犻犪狀犵犅犪狔犻犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犇犪狇犻狀犵１６３３１９，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａ６ｔｒｅｈａｌｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ（犜犘犛）ｆｒａｇｍｅｎｔ，１１５３ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｗａｓｉｓｏｌａ
ｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈＮａＣｌａｎｄＮａＨＣＯ３ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｒｏｍ犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪ｙｅａｓｔｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ．Ａ３′ｅｎｄｃＤＮＡａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｌｏｎｅ犘狌狋犜犘犛．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｉｓ３３５８ｂｐｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ８８２ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＭｕｌｔｉｐｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆＴＰＳｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｒｉｃｅ，
犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊，ｍａｉｚｅ，ａｎｄｏｔｈｅｒｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓｗｅｒｅａｂｏｕｔ６０％ｔｏ９０％．
Ｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆ犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪犘狌狋犜犘犛ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｎｄｅｒＮａＣｌａｎｄＮａＨＣＯ３ｓｔｒｅｓｓ
ｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ．ＡｌｓｏｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｙｅａｓｔＩＮＶＳｃＩ（ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛）ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ
ＩＮＶＳｃＩ（ｐＹＥＳ２）ｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｓａｌｔ，ｄｒｏｕｇｈｔ，ｏｓｍｏｔｉｃａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｅｓ．犘狌狋犜犘犛ｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘ
ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｒｏｏｔｓａｎｄｆｌｏｗｅｒｓ；ｉｎｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓ，ＮａＣｌａｎｄＮａＨＣＯ３ｉｎｄｕｃｅｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犘狌狋
第２４卷 第１期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年１月
Ｊａｎ，２０１５
收稿日期：２０１３１２１３；改回日期：２０１４０１１５
基金项目：黑龙江省寒地作物种质改良与栽培重点实验开放课题资助项目（ＣＧＩＣ２０１２０４），教育部创新团队发展计划（ＩＲＴ１３０５３），黑龙江省自然
科学基金项目（Ｃ２０１４０６），中央高校基本科研业务费专项资金（２５７２０１４ＢＡ２０），８６３项目（２０１３ＡＡ１０２７０１７）和哈尔滨市自然科学基金
（２００８ＲＦＱＸＮ００７）资助。
作者简介：李莹（１９７９），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士。Ｅｍａｉｌ：ＬＹ７９６６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｓｈｅｎｋｕｉｌｉｕ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＴＰＳｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｙｅａｓｔｃｅｌｓｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｅｒｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｈａｎｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｓ．Ｉｔｗａｓａｌｓｏｆｏｕｎｄ
ｔｈａｔｔｈｅＴＰＳｆｒｏｍａｌｋａｌｉｇｒａｓｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｓａｌｔ，ｄｒｏｕｇｈｔ，ｏｓｍｏｔｉｃａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎ犘狌狋犜犘犛ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｓｔｒｅｓｓｅｓ，ａｎｄ犘狌狋犜犘犛 ｍａｙ
ｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｆｏｒ犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪ｄｕｒｉｎｇａｄａｐｔｉｏｎｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪；６ｔｒｅｈａｌｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｙｅａｓｔ
海藻糖是由两个葡萄糖分子以ɑ，ɑ１，１糖苷键连接的非还原性双糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、无脊椎
动物和植物中［１］。它是植物在逆境胁迫条件下大量积累的一类物质，对植物抵御干旱、高温、低温、盐、氧化胁迫
及营养缺乏等逆境至关重要［２６］。海藻糖在生物体中的合成途径有５种，分布最广的通路是ＴＰＳ／ＴＰＰ途径，包
括两个步骤，两个不同的酶。植物体内，途径中，海藻糖６磷酸合成酶（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ６ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＴＰＳ）是
海藻糖的合成过程中的关键作用酶，即尿苷二磷酸葡萄糖和６磷酸葡萄糖在海藻糖６磷酸合成酶的催化作用下
合成６磷酸海藻糖（Ｔ６Ｐ），然后在海藻糖６磷酸酯酶（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ６ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＴＰＰ）作用下生成海
藻糖［７９］。
１９９８年，在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中一些与海藻糖生物合成相关的基因ＴＰＳ和 ＴＰＰ被发现［１０１１］。
近期ＴＰＳ和ＴＰＰ的同源序列在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、陆地棉（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）
及卷叶柏（犛犲犾犪犵犻狀犲犾犾犪犾犲狆犻犱狅狆犺狔犾犾犪）等多种植物中也被发现［１２１６］。植物中的ＴＰＳ基因都以基因家族的形式存
在。已测序的物种中，拟南芥中发现了１１个ＴＰＳ基因，高粱（犛狅狉犵犺狌犿狏狌犾犵犪狉犲）中发现了１１个ＴＰＳ基因，水稻
中发现了１１个ＴＰＳ基因，蓖麻（犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊）中发现了１３个ＴＰＳ基因［１７２０］。根据是否与酵母ＴＰＳ１具有
同源性，将ＴＰＳ蛋白分成了两个具有显著区别的类群，只有酵母ＴＰＳ１属于ＣｌａｓｓＩ，同时ＴＰＳ的活性已经被证
实［１９，２１］。ＣｌａｓｓＩＩＴＰＳ蛋白是否具有ＴＰＳ活性还未被证实。
由于逆境下海藻糖对生物体的保护作用，目前研究表明，通过转入海藻糖合成相关基因成功地改善了植物对
逆境的抵御能力。犗狊犜犘犛１过表达显著提高了水稻幼苗对低温，高盐，干旱等逆境胁迫的耐受能力［２２］。犛犾犜犘犛１
基因可以有效地恢复酵母突变体ｔｐｓ１Δ对ＮａＣｌ、Ｓｏｒｂｉｔａｌ的敏感性，由此推断犛犾犜犘犛１基因在卷柏的抗逆性方面
发挥了重要作用［１６］。过量表达拟南芥内源ＴＰＳＩ基因的植株耐旱性也得到了提高［２３］。因此与海藻糖合成的相
关酶在植物抗逆性方面发挥着重要的作用。
碱茅（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪）是一种禾本科单子叶盐生植物，主要分布在我国的东北松嫩盐碱草甸草原上。
与其他盐生植物相比，它在极端盐恶劣的盐碱环境下ｐＨ值９～１０完成其整个生命周期［２４］。它具有一套独特的
适应盐碱逆境的生理机制，同时也具有潜在的实用价值。因此，它是一种理想的研究耐盐机制的盐生植物。
本研究利用３′ＥｎｄｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ方法，克隆得到具有完整ＯＲＦ的犘狌狋犜犘犛基因，并对该基因的组织
表达模式以及在盐、碱胁迫处理下的ｍＲＮＡ表达特性进行分析；同时深入分析过表达酵母对盐、碱、渗透、氧化
等胁迫的耐受能力。试图探讨盐、碱逆境胁迫下该基因的抗性作用，为深入理解盐生植物抗逆机理积累资料。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
碱茅植株及种子采自东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心安达野外实验基地。２０１２年７月分离保
存野外生长的碱茅根、茎、叶、花、果等部分组织。同时成熟的种子经２０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ选种，选出籽粒饱满的种
子，５％ ＮａＣｌＯ３ 消毒５ｍｉｎ，无菌水洗３～５遍，２５℃室温水培养２周的碱茅幼苗为试材，相对湿度６０％，光照
６０００ｌｘ，光照时间为１６ｈ／８ｈ。分别选取经５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ３ 处理０，６，１２，２４，４８ｈ后，
分别收集叶部组织（地上部分）、根部组织（地下部分），液氮速冻后保存。并用于后期Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。
１．２ 基因的克隆与序列分析
碱茅ｃＤＮＡ文库于２００８年ＴａＫａＲａ公司合成构建于ｐＧＣＡＰ１０载体上，经过酶切、连接将其构建到改造的
酿酒酵母表达载体ｐＡＵＲ１０１（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）上。利用ＬｉＡｃ／ＰＥＧ酵母转化法［２５］，将其高效转化到酿酒酵母
菌株ＩｎＶｓｃＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中。通过对碱茅酵母文库的耐盐碱性筛选，从中均分离得到一抗性酵母
００１ 草 业 学 报 第２４卷
克隆，通用引物ＰＣＲ产物插入Ｔ载体测序得长度为１１５３ｂｐ，测序后经比对分析发现，该片段为５′端的完整的碱
茅６磷酸海藻糖合成酶基因（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪ｔｒｅｈａｌｏｓｅ６ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰｕｔＴＰＳ）的部分序列。通过
３′ＥｎｄｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ方法获得基因缺失的３′序列［２６］。所需引物如下：ＱＴ：５′ＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴ
ＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３′，ＱＯ：５′ＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧ３′，
ＱＩ：５′ＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣ３′， ＴＰＳＲＡＣＥ１：５′ＡＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＧ３′， ＴＰＳ
ＲＡＣＥ２：５′ＡＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＧ３′。
经比对拼接后，克隆全长序列。犘狌狋犜犘犛 基因全长克隆引物如下：ＴＰＳＦ：５′ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴＧ
ＧＡＣＴＣＧＣ３′，ＴＰＳＲ：５′ＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＴＧＴ３′。ＯＲＦｆｏｕｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）程序确定其开放读码框。ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）软件
计算推导的蛋白质的分子量及理论等电点；利用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ２．０／对该基因的
跨膜结构分析；利用ＢｌａｓｔＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）进行序列同源性搜索；利用ＣｌｕｓｔａｌＸ
１．８３软件对具有同源性、不同植物来源的ＴＰＳ蛋白序列进行多序列比对，并绘制分子进化树。
１．３ ｍＲＮＡ表达特性分析
液氮速冻研磨收集的样品，用ＴＲＩｚｏｌ一步法提取总ＲＮＡ，以１０μｇＲＮＡ在１．０％的甲醛琼脂糖变性凝胶上
电泳，并转移到尼龙膜上。以ＤＩＧ标记的犘狌狋犜犘犛ｃＤＮＡ为探针进行杂交，并利用ＣＤＰＳｔａｒＴＭ （Ｒｏｃｈｅ）来检
测Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交信号［２７］。
１．４ 过表达犘狌狋犜犘犛酵母菌株的抗逆性分析
分别取起始ＯＤ６００约为０．６的ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛和载体ｐＹＥＳ２的１０－１，１０－２，１０－３，１０－４和１０－５的酵母菌液于
１．０和１．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１４和２５ｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ３、３．０ｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２、１．８ｍｏｌ／ＬＳｏｒｂｉｔａｌ的半乳糖诱导的酵母培
养基中，３０℃培养３～５ｄ，调查其生长状态。
２ 结果与分析
２．１ 犘狌狋犜犘犛基因的克隆与序列分析
通过对碱茅酵母文库的耐盐碱性筛选，从中均分离得到一抗性酵母克隆，通用引物ＰＣＲ产物插入Ｔ载体测
序得长度为１１５３ｂｐ的碱茅６磷酸海藻糖合成酶基因片断，测序后进行ＢＬＡＳＴ比对，发现具有该基因片段５′端
的完整序列。该基因片段的碱基序列与红豆杉（犉犲狊狋狌犮犪犿犪犻狉犲犻，ＪＮ４１５６８３．１）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊，ＧＵ２２８５８８．１
７６）的同源性分别为９０％，７６％。初步确认该基因片段为碱茅ＴＰＳ基因序列的一部分（图１）。根据这一段序列
设计特异性引物ＴＰＳＲＡＣＥ１、ＴＰＳＲＡＣＥ２，分别与３′端通用引物ＱＯ、ＱＩ配对，扩增分离出长为２５００ｂｐ的端
片段，测序比对后与中间片段序列一起拼接得到长３４００ｂｐ的犘狌狋犜犘犛基因的ｃＤＮＡ全长序列，重新克隆基因
并测序，犘狌狋犜犘犛基因全长３３５８ｂｐ。序列的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ分析证实该基因的开放阅读框（ＯＲＦ）长２６４６ｂｐ，推定
编码８８２个氨基酸，其中５′端非翻译区包括６１２ｂｐ，３′端非翻译区包括１００ｂｐ，３３５９～３３８６位为Ｐｏｌｙ（Ａ）尾（图
１）。ＢＬＡＳＴＰ对ＰｕｔＴＰＳ蛋白保守区的预测结果表明该蛋白属于ＴＰＳ蛋白（图２）。ＧｅｎＢａｎｋ中选取部分植物
的ＴＰＳ蛋白，经ＢＬＡＳＴＸ分析发现碱茅ＴＰＳ蛋白与水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ，ＡＡＮ５２７４０．１）、拟南芥
（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪，ＣＡＢ１０５５７．１）、玉米 （犣犲犪 犿犪狔狊，ＡＤＡ６７９９１．１）、陆 地棉 （犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿，
ＡＡＶ６５４９４．１）、甜瓜（犆狌犮狌犿犻狊犿犲犾狅ｓｕｂｓｐ．犿犲犾狅，ＡＤＮ３４０２８．１）、红豆杉（犉犲狊狋狌犮犪犿犪犻狉犲犻，ＡＥＯ１３２３９．１）、银杏
（犌犻狀犽犵狅犫犻犾狅犫犪，ＡＡＸ１６０１４．１）、丹参（犛犪犾狏犻犪犿犻犾狋犻狅狉狉犺犻狕犪，ＡＥＱ５４９１６．１）、甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪，ＡＢＤ
６５１６５．１）、蓖麻（犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊，ＸＰ＿００２５２２２５５．１）等高等植物的 ＴＰＳ蛋白具有较高同源性，同源性高达
６０％～９０％（图３）。软件Ｃｌｕｓｔａｌｗ１．８．１对此种蛋白相近的１０个物种的ＴＰＳ蛋白序列进行聚类分析，结果表
明，碱茅中克隆的ＴＰＳ蛋白与羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）的ＴＰＳ蛋白亲缘关系最近，与黄瓜、蓖麻中发现的ＴＰＳ
蛋白亲缘关系较远（图４）。
ＰｒｏｔＰａｒａｍ 预测该基因编码蛋白质的分子量为１００．３７ｋＤａ，理论等电点（ｐＩ）为９．２５，为碱性蛋白。负电荷
氨基酸（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）总数为９５，正电荷氨基酸（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）总数为１１９。不稳定系数为５６．０６，为稳定的蛋白质。
据ＴＭＨＭＭｖ．２预测，信号肽预测表明该基因编码的蛋白无信号肽结构。ＰｕｔＴＰＳ编码的蛋白为一种非跨膜蛋
白，这一特性与其他植物中发现的ＴＰＳ蛋白相一致。
１０１第１期 李莹 等：碱茅６磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析
图１ 碱茅犘狌狋犜犘犛蛋白保守区预测
犉犻犵．１ 犆狅狀狊犲狉狏犲犱狉犲犵犻狅狀狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳犘狌狋犜犘犛狆狉狅狋犲犻狀
图２ 碱茅犘狌狋犜犘犛基因的犮犇犖犃序列
犉犻犵．２ 犘狌狋犜犘犛狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犮犇犖犃
２．２ 犘狌狋犜犘犛基因在碱茅不同组织中的表达
利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ技术，对犘狌狋犜犘犛基因在野外生存碱茅的根、茎、叶、花、种子中的表达模式进行分析。结
果表明，犘狌狋犜犘犛基因在茎中未见表达，在根、叶、花、种子中均有表达，其中在根和花中表达水平最高，表明
犘狌狋犜犘犛基因具有组织表达特异性（图５）。
２．３ 盐、碱逆境胁迫下犘狌狋犜犘犛基因的ｍＲＮＡ水平表达特性
为了研究犘狌狋犜犘犛基因与盐、碱胁迫的应答相关性，利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ技术分析其 ｍＲＮＡ在盐、碱胁迫下
地上组织和地下组织表达特性的变化（图６）。在ＮａＣｌ胁迫处理下，该基因在叶部的表达量随着处理时间的延长
２０１ 草 业 学 报 第２４卷
图３ １１种植物犜犘犛基因编码的
氨基酸序列多序列比对
犉犻犵．３ 犕狌犾狋犻狆犾犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱
犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犜犘犛犵犲狀犲
３０１第１期 李莹 等：碱茅６磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析
图４ １１种植物犜犘犛基因编码的氨基序列的系统进化树构建
犉犻犵．４ 犘犺狔犾狅犵犲狀犻犮狋狉犲犲狅犳犜犘犛犳犪犿犻犾狔犻狀１１狆犾犪狀狋狊
图５ 犘狌狋犜犘犛基因组织器官表达特异性分析
犉犻犵．５ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳
犘狌狋犜犘犛犫狔犖狅狉狋犺犲狉狀犫犾狅狋
图６ 盐、碱逆境胁迫下犘狌狋犜犘犛基因的犿犚犖犃表达特性
犉犻犵．６ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳
犘狌狋犜犘犛狌狀犱犲狉狊犪犾狋，犪犾犽犪犾犻狊狋狉犲狊狊犫狔犖狅狉狋犺犲狉狀犫犾狅狋
而增加，当１２ｈ时表达量达到最大。在根部，随着盐
处理时间的改变，基因的表达量先降低，但１２ｈ时表
达量迅速升高，达到最大，随后逐渐降低。在 ＮａＨ
ＣＯ３ 胁迫处理下，该基因在叶部的表达量在６ｈ时已
达到最大，根部在１２ｈ时表达量达到最大。综上所
述，在ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３ 处理下犘狌狋犜犘犛基因无论在根
部，还是叶部，都主要表现为上调表达。这表明犘狌狋
犜犘犛基因有可能参与了碱茅的耐盐、碱应答反应，属
于盐、碱逆境胁迫的相关基因。
２．４ ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛在酵母中的表达及其抗逆性
酵母是单细胞真核生物并与植物有着类似的代谢
途径，遗传操作简单易行，是外源蛋白表达的合适宿
主，ｐＹＥＳ２ 是半乳糖诱导的过表达载体。因此，本研
究利用酵母表达体系开展了转基因酵母对逆境的耐性
实验。对含有ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛 和ｐＹＥＳ２ 的酵母菌
（阴性对照）逆境处理的抗性检测发现（图７），正常情
况下，含ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛和ｐＹＥＳ２ 的酵母菌在无逆
境处理的ＹＰＤ培养基上生长情况相似；但在１ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ胁迫下转ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛酵母长势略优于对照
菌株；随着ＮａＣｌ浓度的增加，抗性生长优势力成为明
显，当浓度达到１．２ｍｏｌ／Ｌ时，对照菌株无法正常生
长，但转ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛酵母菌株仍可正常生长。说
明过表达犘狌狋犜犘犛提高了酵母菌株对盐胁迫的耐性
存活能力。在碱逆境（１４和２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ３）、
氧化逆境（３．０ｍｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２）、渗透胁迫（１．８ｍｏｌ／Ｌ
Ｓｏｒｂｉｔａｌ）等逆境下，转ｐＹＥＳ２犘狌狋犜犘犛酵母菌的长势
均明显优于转对照菌株，这些结果均说明犘狌狋犜犘犛在
酵母中过量表达能够提高其对碱、氧化、渗透逆境的耐
性。综上所述，犘狌狋犜犘犛基因的过量表达对酵母在环
境胁迫中的生长发挥重要作用。
图７ 非生物逆境胁迫下转犘狌狋犜犘犛基因酵母菌株的抗性分析
犉犻犵．７ 犌狉狅狑狋犺狅犳犘狌狋犜犘犛狅狏犲狉犲狓狆狉犲狊狊犻狀犵狔犲犪狊狋犮犲犾狊犻狀狋犺犲狆狉犲狊犲狀犮犲狅犳狏犪狉犻狅狌狊犪犫犻狅狋犻犲狊狋狉犲狊狊犲狊
４０１ 草 业 学 报 第２４卷
３ 讨论
我国因土地盐碱化、荒漠化，造成劣质土地已成为制约区域可持续发展及绿化生态环境的核心因素。在长期
进化过程中形成了形形色色的植物，包括有着微妙的适应环境的生长发育调节机制，不同的物种针对相应环境因
子的调控作用却有着时空差异的分子基础［２８３０］。
分子选育是抗盐碱植物新品种的关键，就是从盐生植物里分离抗盐碱功能基因。碱茅不仅是一种优良的牧
草，还是一种宝贵的盐生种质资源，碱茅可在ｐＨ１０以上的碱斑地上正常生长发育，目前它被人们称作极端耐盐
碱先锋植物，种植碱茅不但对盐碱土壤具有改良作用，同时为相关研究提供了丰富的耐盐碱基因资源。这不仅有
助于培育耐盐碱转基因农作物、牧草和花卉，而且还为我国盐碱草甸草原的改良和综合治理提供理论基础，具有
重大的经济价值和生态效应。
当植物遭遇干旱、盐碱、低温等逆境时，就会在体内积累各种小分子物质，提高细胞液浓度，降低其渗透势，并
保持一定的压力势，来维持细胞的正常膨压。参与渗透调节的物质有很多，大致可分为两大类。一类是由外界进
入细胞的无机离子，一类是在细胞内合成的有机物质，如脯氨酸、甜菜碱、甘露醇和海藻糖等。研究表明，海藻糖
是一种典型的应激代谢产物；当生物体生长环境良好时，体内不积累海藻糖；而当生物体处于胁迫环境（如饥饿、
干燥、高温和高盐碱等）时，体内就会迅速积累海藻糖，海藻糖的积累提高了对生物体内蛋白质、酶与细胞膜等活
性物质的保护，而且这些海藻糖会随着不良环境的解除而被降解［３０３１］。
植物犜犘犛基因，是海藻糖合成过程中的关键基因，ＴＰＳ外源基因的导入，即可合成６磷酸海藻糖。而６磷
酸海藻糖脱磷酸转化为海藻糖，可由细胞内广泛存在的非特异性磷酸酯酶催化完成，所以ＴＰＳ酶对海藻糖的积
累至关重要［１０，１６］。本研究过表达犘狌狋犜犘犛的酵母对盐、碱、氧化及渗透胁迫等多重逆境生长存活能力均有提高，
推定过表达犘狌狋犜犘犛基因有助于碱茅体内海藻糖合成增加，它的积累提高碱茅对各种逆境胁迫抵御。２００３年
Ｊａｎｇ等［３２］在研究转基因水稻犝犫犻１：：犜犘犛犘（转入ＴＰＳ和ＴＰＰ具有双融合功能基因的转基因水稻）时发现，在逆
境胁迫下，转犝犫犻１：：犜犘犛犘基因水稻由于植株体内海藻糖的大量积累，提高了转基因植株对干旱、盐、低温的耐
受性。我们的ｍＲＮＡ转录研究表明犘狌狋犜犘犛受逆境胁迫诱导，这可能也与逆境胁迫下植株体内海藻糖合成需
要大量的酶积累有至关重要的关系。该基因是在极端耐盐碱植物碱茅中分离得到，这也进一步为解释碱茅为何
能更好地适应极端恶劣条件的研究奠定了一定的基础。以后研究可以考虑在转基因植物上研究该基因的特性，
以期揭示犘狌狋犜犘犛基因提高生物抗逆性的机理。这将为深入了解该基因家族的功能提供新的资料，同时也为进
一步研究盐生植物的抗盐分子机制鉴定基础，对植物抗逆分子育种工作具有一定的理论指导意义。
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ｃｏｍｐｌｅｘｉｎ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲ａｎｄｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｈｅａｔｓｈｏｃｋ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，２４（４）：６８７６９５．
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６０１ 草 业 学 报 第２４卷