全 文 ：书基因工程在牧草培育中的应用
马江涛１，２，王宗礼１，黄东光３，吴燕民２
（１．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特０１００１０；２．中国农业科学院生物技术研究所，北京１０００８１；
３．深圳市铁汉生态环境股份有限公司，广东 深圳５１８０４０）
摘要：随着生物科学的发展，基因工程已涉足植物、动物、微生物等研究领域。近年，由于环境的日趋恶化，极端气
候频繁出现，社会对牧草抗逆新品种的需求日渐迫切，这也加速了基因工程在牧草培育中的应用与推广。本研究
对过去２０多年来基因工程在近３０种主要牧草遗传转化、品质改良、抗病虫、抗除草剂、抗逆性、可饲用疫苗等方面
的研究进展进行了全面总结和综述，分析了目前牧草基因工程研究中存在的问题，就发展前景进行了展望。
关键词：牧草；基因工程；应用
中图分类号：Ｓ５４０．３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０６０２４８１５
　 近些年，随着全球气候的恶化和生态建设事业的需要，同时国内在西部大开发战略实施以及转基因植物研究
与产业化重大专项的支持下，培育多用途优质牧草品种日益成为研究的热点。而现代生物技术的兴起为培育和
改良植物品种提供了一条便捷和实用的途径。基因工程作为现代生物技术体系的核心技术，在最近２０年间，取
得了迅猛发展。随着一系列新技术和新方法的不断涌现，其在牧草新品种培育研究中的应用也越来越广。利用
牧草基因工程在分子水平上定向改造牧草遗传性状的优势，结合传统育种手段，不仅能够拓宽牧草培育中种质资
源的范围，而且更能有效地利用现有的遗传变异体材料，使牧草育种更具有可操作性和目的性，大大缩短了育种
周期，全面革新传统牧草新品种培育的研究状况。尽管牧草基因工程的研究起步较晚，但由于环境的恶化和人们
生态意识的增强，基因工程在牧草改良中的潜力已被人们所重视，并已在牧草遗传转化、品种改良等方面取得了
一系列可喜成绩。同时，随着人们环保意识的增强和对绿色产品偏好性的日渐显著，利用生物技术定向将固氮、
抗病虫害以及耐盐碱等基因转移到牧草中，赋予转基因植株相应的特性，这样不仅减少了生产中化肥和农药的投
入，而且对促进我国无污染绿色养殖业和绿色畜产品的发展，以及西部地区生态环境建设都会产生深远的影
响［１］。
我国南北跨越纬度近５０°，地形复杂，气候带谱广，植物区系成分复杂。据不完全统计，我国植物中可供家畜
采食的就有５门２４６科１５４５属６７０４种，而目前已经或正在开发研究的牧草品种所占比例少之又少。因此，以
生物技术为平台，充分利用我国丰富的牧草资源，加速牧草资源的开发研究，培育适宜新形势下推广的多用途牧
草新品种刻不容缓。
１　牧草的体外再生
外源基因导入植物体的基本前提之一就是要有稳定、高效的再生体系。离体再生是进行植物遗传转化的基
础，是短时间内获得完整转基因植株的关键所在［２］。牧草的离体培养主要有愈伤组织培养（ｃａｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅ）、单倍
体培养（ｈａｐｌｏｉｄｃｕｌｔｕｒｅ）、花药培养（ａｎｔｈｅｒｃｕｌｔｕｒｅ）、细胞悬浮培养（ｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ）和原生质体培养
（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅ）等。
由于大多数牧草是异花授粉，品种高度异质，致使只有不多的牧草品种具有利用愈伤组织和悬浮细胞等再生
完整植株的能力。除此之外，影响牧草组织培养的因素还有很多。外植体的部位和生长状态的不同，其诱导产生
胚性愈伤组织以及再生的能力有所差别。在牧草再生体系研究的报道中（表１）［３２６］，多数是选用胚或花序幼穗作
为外植体，通过诱导其形成胚性愈伤组织，最后分化获得再生植株。以茎尖、茎节点、花药等作为外植体的研究也
２４８－２６２
２０１０年１２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第１９卷　第６期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
 收稿日期：２０１００４０２；改回日期：２０１００５１２
基金项目：国家重点基础研究发展计划（“９７３”计划，２００７ＣＢ１０８９０２２）资助。
作者简介：马江涛（１９８４），男，河北邢台人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｍｊｔ２００７＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗｕｙｍ５６＠１６３．ｃｏｍ
有所报道。Ｖａｌｋ等［５］研究发现以花序作为外植体远比成熟种子更易形成胚性愈伤组织。虽然成熟胚同其他外
植体相比愈伤组织的芽分化频率较低，但由于材料易于获取，且不受季节和植株发育时期等因素限制，因此，大多
研究还是首选成熟胚作为外植体。
培养基的组成成分、激素种类及配比等对愈伤的诱导和再生也有很大的影响。如培养基中加入凝胶和碳水
化合物，能明显提高多花黑麦草（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）胚性愈伤组织的形成［２７］；苄基腺嘌呤（ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ，
ＢＡ）和氯化苯氧乙酸（２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，２，４Ｄ）共同作用下对草地早熟禾体细胞胚胎发生和植株
再生具强烈刺激性［２８］。另外，在组织培养中植物的基因型也是一个重要的影响因子。ＭｃＬｅａｎ和Ｎｏｗａｋ［１８］发现
植物的再生能力受遗传特性的影响，这也使同种牧草的不同基因型之间的再生能力存在一定的差异。
表１　主要牧草的体外再生
犜犪犫犾犲１　犐狀狏犻狋狉狅狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳犿犪犻狀犳狅狉犪犵犲狊
种属Ｇｅｎｅｒａａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ 外植体来源Ｅｘｐｌａｎｔｓ 年份Ｙｅａｒ 参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
草地早熟禾犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊 胚芽鞘Ｃｏｌｅｏｐｔｉｌｅ １９９６ ［３］
原生质体Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ １９９３ ［４］
种子Ｓｅｅｄ １９８９ ［５］
未成熟花序Ｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
埃及三叶犜狉犻犳狅犾犻狌犿犪犾犲狓犪狀犱狉犻狀狌犿 子叶Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ２０１０ ［６］
下胚轴 Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
紫花苜蓿 犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 下胚轴 Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ２００９ ［７］
根 Ｒｏｏｔ １９８６ ［８］
杂花苜蓿 犕犲犱犻犮犪犵狅犿犲犱犻犪 根 Ｒｏｏｔ １９８６ ［８］
下胚轴 Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
柳枝稷犘犪狀犻犮狌犿狏犻狉犵犪狋狌犿 花序Ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ２００９ ［９］
野大麦犎狅狉犱犲狌犿犫狉犲狏犻狊狌犫狌犾犪狋狌犿 未成熟花序Ｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ２００７ ［１０］
羊草犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊 未成熟花序Ｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ２００４ ［１１］
百脉根犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊 根 Ｒｏｏｔ ２００３ ［１２］
雀稗犘犪狊狆犪犾狌犿狊犻犿狆犾犲狓 下胚轴 Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ２００３ ［１３］
根 Ｒｏｏｔ
新麦草犘狊犪狋犺狔狉狅狊狋犪犮犺狔狊犼狌狀犮犲犪 成熟胚 Ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏ ２００２ ［１４］
鸭姆草犘犪狊狆犪犾狌犿狊犮狉狅犫犻犮狌犾犪狋狌犿 胚Ｅｍｂｒｙｏ ２００３ ［１５］
原生质体Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ １９９９ ［１６］
苇状羊茅×一年生黑麦草犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪×犔．犿狌犾狋犻犳犻狅狉狌犿 花药 Ａｎｔｈｅｒ １９９９ ［１７］
红三叶犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲 下胚轴 Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ １９８９ ［１８，１９］
根颈Ｃｒｏｗｎ
叶柄Ｐｅｔｉｏｌｅ
白三叶犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊 下胚轴 Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ １９９５ ［２０］
巴哈雀稗犘犪狊狆犪犾狌犿狀狅狋犪狋狌犿 成熟颖果 Ｍａｔｕｒｅｃａｒｙｏｐｓｅｓ １９９０ ［２１］
碱茅犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪犾犻犿狅狊犪 种子Ｓｅｅｄ １９８９ ［２２］
锯齿形三叶草犜狉犻犳狅犾犻狌犿犿犲犱犻狌犿 叶柄Ｐｅｔｉｏｌｅ １９８８ ［２３］
鸭茅犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪 幼叶Ｂａｓａｌｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｙｏｕｎｇｅｓｔｌｅａｖｅｓ １９８８ ［２４］
一年生黑麦草犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿 未成熟花序Ｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １９８１ ［２５］
节点 Ｎｏｄｅｓ
黍属犘犪狀犻犮狌犿 胚Ｅｍｂｒｙｏ １９８１ ［２６］
茎尖Ｓｈｏｏｔｔｉｐｓ
未成熟花序Ｉｍｍａｔｕｒｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
９４２第１９卷第６期 草业学报２０１０年
２　牧草的遗传转化
遗传转化技术的迅速发展给传统植物遗传育种赋予了新的内容。利用基因工程技术进行植物分子育种，不
仅跨越了天然物种的屏障，克服了固有的生物种间限制，而且为定向改良植物性状、培育新品种开辟新的路径。
应用于植物的遗传转化方法有很多种，大体上可以分为２种方法：一是间接法；二是直接法。间接法是以农杆菌
为中介将外源基因介导转入并整合在植物基因组中。常用的农杆菌有根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）
和发根农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狉犺犻狕狅犵犲狀犲狊）；已应用于植物的直接转导法主要有基因枪法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、电击法
（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）和聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）法。除此之外，人们还发明了很多其他的转化方式以适
应不同植物的需求，如：子房注射法［２９］、花粉匀浆法［３０］、显微注射法［３１］、动态导入法［３２］、ＤＮＡ 直接涂抹柱头
法［３３］、激光束转化法［３４］、花粉管通道法［３５］、种胚吸收法［３６］、碳化硅纤维法［３７］和超声波法［３８］等。不同的材料，采
用同种转化方法产生的效果不尽相同，针对不同材料的生物特征选择适合的转化方式很重要。以上方法已经分
别在棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犪狉犫狅狉犲狌犿）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、甘蓝（犅狉犪狊
狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪）等植物中成功应用。
近年来牧草生物技术的兴起，也加快了相关转化体系的研究。转基因牧草最早是通过点击或ＰＥＧ法使原生
质体直接摄取外源ＤＮＡ实现的。这种利用原生质体培养和转化建立的转化体系在２０世纪９０年代是进行基因
转化表达研究的主要方法［３９］。随着植物遗传转化技术的发展，基因枪法和农杆菌介导法，以其便捷的优点，成为
目前牧草遗传转化的主要方法。
基因枪法又称微弹轰击法。它是将遗传物质附着于金粒或钨粒微弹表面，高速射入细胞、组织或细胞器，从
而实现外源ＤＮＡ在植物体内染色体上的整合与表达。关于基因枪法的最早报道是１９８７年Ｋｌｅｉｎ等［４０］利用钨
粒子将携带标识基因的ＤＮＡ导入洋葱（犃犾犾犻狌犿犮犲狆犪）表皮细胞，并产生基因瞬时表达。由于基因枪法具有受体
广泛，无物种限制，可同时转化多个质粒等特点，自此之后基因枪法作为一种全新的转化方式被应用于多种植物
中。目前牧草中已有的相关研究涉及到苇状羊茅、紫羊茅、草地早熟禾、笔花豆、羊草、新麦草、一年生黑麦草、多
年生黑麦草等，而且这些转化中所用的材料多为愈伤组织，转化效率相对也较高（表２）［４１６８］。以基因枪法进行的
转化多为多拷贝整合，虽然已有通过基因枪法获得单拷贝转基因牧草的研究报道，但多数情况下的转化效果并不
理想，基因整合过程中易发生重排和高拷贝插入现象，以及后代遗传不稳定等缺点。
与基因枪法相比，农杆菌介导法作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化机理清楚，转化的外源基因结
构完整，拷贝数低，整合后的外源基因结构变异小等优点。农杆菌转化植物的研究始于２０世纪８０年代初，自
Ｒｏｂｅｒｔ创建了叶盘法以后，在双子叶植物中得到了广泛应用［６９］，如：紫花苜蓿、紫云英、百脉根等（表２）。由于单
子叶植物不是农杆菌的天然寄主，因此，农杆菌介导法在单子叶植物上的应有范围有限。现已建立的转化体系
有：草地羊茅、苇状羊茅、无芒雀麦、结缕草、一年生黑麦草、多年生黑麦草等（表２）。
３　牧草遗传改良研究进展
生物技术作为一个强有力的遗传改良工具，已在多种植物上被大量应用，并取得了显著成果，这为牧草的遗
传改良与新品种的培育提供了科学依据。生物技术在牧草遗传改良方面已涉及到品质、抗病虫、抗逆等多方面
内容。
３．１　牧草品质改良
牧草品质的好坏直接关系到牲畜产量和畜类相关产品的质量。豆科牧草饲用价值和营养价值都明显高于其
他牧草。但部分豆科牧草随着开花和衰老植物体木质化进程显著加剧，严重影响了牲畜的消化率和牧草本身的
饲用性。咖啡酸ｏ甲基转移酶基因（犆狅犿狋）在植物木质素合成途径中控制咖啡酸（ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ）到阿魏酸（ｆｅｒｕｌｉｃ
ａｃｉｄ）的转化，研究人员利用农杆菌介导法将犆狅犿狋的反义结构转入紫花苜蓿体内，通过对随机抽取的８株转基因
植物茎节横切面分析，其中有３株与对照相比明显降低了木质素含量［４７］。通过延缓植物衰老、延长生长期也是
提高牧草营养价值减少生产损失的一种办法。异戊烯基转移酶（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｉｐｔ）是植物体内与细
胞分裂素合成有关的酶，目前对合成这一酶基因的转化和调控研究以烟草最多。通过对烟草的研究发现犻狆狋基
因有效地延缓了叶片的衰老，提高了植株对外源生长素和虫害的耐性，同时，高的表达量会对相应的组织或器官
０５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
产生形态学上的改变［７０］。狆犛犃犌１２是在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中发现的衰老特异表达启动子，只在衰老
的叶片中表达，受环境因素影响小。自Ｇａｎ和Ａｍａｓｉｎｏ［７１］将狆犛犃犌１２启动子与犻狆狋构成嵌合基因，转化烟草来
延缓叶片衰老以来，这种方法的可行性已经在莴苣（犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪）、水稻、玉米、甘蓝等植物中得到验证。Ｃａｌ
ｄｅｒｉｎｉ等［７２］以紫花苜蓿为材料进行了上述研究，发现转基因材料叶片在 ＭＳ培养基上培养３０ｄ后，较对照仍然
保持绿色。温室盆栽紫花苜蓿的对比，也得出了转狆犛犃犌１２犻狆狋基因材料明显延长了叶片的寿命。
表２　牧草的遗传转化
犜犪犫犾犲２　犌犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犵狉犪狊狊犲狊
种属
Ｇｅｎｅｒａａｎｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ
基因
Ｇｅｎｅｓ
转化方法
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
转化率
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
培养结果
Ｏｕｔｃｏｍｅ
年份
Ｙｅａｒ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
多年生黑麦草×草地羊茅
犔．狆犲狉犲狀狀犲×犉．狆狉犪狋犲狀狊犻狊
狌犻犱犃，犺狆犺 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
花粉愈伤
Ｐｏｌｅｎｃａｌｕｓ
４．２０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００９ ［４１］
草地羊茅
犉．狆狉犪狋犲狀狊犻狊
犫犪狉，狌犻犱犃 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
２．００％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００９ ［４２］
苇状羊茅
犉．犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪
犫犪狉，狌犻犱犃 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
１０．５０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００８ ［４３］
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
１１．５０％
犺狆犺，犵狌狊犃 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００３ ［４４］
犺狆犺，犵狌狊犃 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００３ ［４５］
犺狆狋，犫犪狉，
犵狌狊犃
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
６．８０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２０００ ［４６］
紫羊茅
犉．狉狌犫狉犪
犺狆狋，犵狌狊犃，
犵犳狆
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
３．７０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２０００ ［４６］
紫花苜蓿
犕．狊犪狋犻狏犪
反义犮狅犿狋
犮狅犿狋ａｎｔｉ犮狅犿狋
根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
去子叶幼苗
Ｓｅｅｄｌｉｎｇｗｉｔｈｏｕｔ
ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ
７．００％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００８ ［４７］
犵狌狊犃 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
子叶Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ
芽Ｓｈｏｏｔ
－ 转基因愈伤组织
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
１９９５ ［４８］
无芒雀麦
犅狉狅犿狌狊犻狀犲狉犿犻狊
狀狆狋犐犐，犵狌狊犃，
犵犳狆
根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
无胚性悬浮细胞
Ｎｏｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓ
－ 转基因愈伤组织
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
２００６ ［４９］
１５２第１９卷第６期 草业学报２０１０年
　续表２　Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ
种属
Ｇｅｎｅｒａａｎｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ
基因
Ｇｅｎｅｓ
转化方法
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
转化率
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
培养结果
Ｏｕｔｃｏｍｅ
年份
Ｙｅａｒ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
草地早熟禾
犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊
犺狆狋，（犫犪狉，
犵狌狊犃）
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
２２．００％（７．５０％）
转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００６ ［５０］
笔花豆
犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊
犅犲２犛１，犃狋狊１ 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
３．４７％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００６ ［５１］
结缕草
犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪
犺狆犺，犵狌狊犃 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
匍匐茎
Ｓｔｏｌｏｎ
６．００％～６．８０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００６ ［５２］
犺狆狋，狀狆狋，
狌犻犱犃，犫犪狉
根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｕｓ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００３ ［５３］
羊草
犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊
狆犪狋 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
１０．４０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００５ ［５４］
新麦草
犘狊犪狋犺狔狉狅狊狋犪犮犺狔狊犼狌狀犮犲犪
犺狆犺，犵狌狊犃 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
２９．００％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００４ ［５５］
一年生黑麦草
犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
犺狆犺，犵狌狊犃
根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００３ ［４５］
犆犺狋２，犚犆犆２ 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
１．９０％
转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００５ ［５６］
犔狅犾狆１，犔狅犾狆２，
犵狌狊犃
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００４ ［５７］
犛犈犈１，犐犘犜，
犵狌狊犃
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－
转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００４ ［５８］
犺狆犺 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
１９９７ ［５９］
紫云英
犃狊狋狉犪犵犪犾狌狊狊犻狀犻犮狌狊
犃犛犃２，狀狆狋犐犐 发根农杆菌
犃．狉犺犻狕狅犵犲狀犲狊
幼苗
Ｓｅｅｄｌｉｎｇ
－ 转基因毛状根
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｈａｉｒｙｒｏｏｔｓ
２００４ ［６０］
百脉根
犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊
犵狌狊犃 发根农杆菌
犃．狉犺犻狕狅犵犲狀犲狊
芽Ｓｈｏｏｔ
－
转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００３ ［６１］
美洲雀稗
犘犪狊狆犪犾狌犿狀狅狋犪狋狌犿
犫犪狉 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
４．７０％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００２ ［６２］
２５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
　续表２　Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ
种属
Ｇｅｎｅｒａａｎｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ
基因
Ｇｅｎｅｓ
转化方法
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
转化率
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
培养结果
Ｏｕｔｃｏｍｅ
年份
Ｙｅａｒ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
柳枝稷
犘犪狀犻犮狌犿狏犻狉犵犪狋狌犿
犵犳狆，犫犪狉，
犵狌狊犃
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
３．９９％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００１ ［６３］
多年生黑麦草
犔．狆犲狉犲狀狀犲
犔狅犾狆１，犔狅犾狆２，
犵狌狊犃
基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性悬浮细胞
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００４ ［５７］
狀狆狋犐犐，犵狌狊犃 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
３．３３％～１２．００％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００６ ［６４］
犗狊犖犎犡１ 根癌农杆菌
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００５ ［６５］
犪狉犵犈 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
胚性愈伤组织
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
－ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２００５ ［６６］
狀狆狋犐犐，犺狆犺 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
３．７０％～１１．４２％ 转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
２０００ ［６７］
犵狌狊犃 基因枪法
Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
愈伤组织
Ｃａｌｕｓ
－ 转基因愈伤组织
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｃａｌｕｓ
１９９４ ［６８］
　狌犻犱犃／犌犝犛／犵狌狊犃：β葡糖醛酸酶基因βｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；犺狆犺／犺狆狋：潮霉素磷酸转移酶基因 Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；犫犪狉／狆犪狋：草丁膦乙酰
转移酶基因Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；犵犳狆：绿色荧光蛋白基因Ｇｒｅｅｎｆｉｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；犮狅犿狋：咖啡酸ｏ甲基转移酶基因Ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄｏ
ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；狀狆狋犐犐：新霉素磷酸转移酶基因Ｎｅｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；犅犲２犛１：巴西栗富集甲硫氨酸２Ｓ清蛋白基因Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔｉａｅｘｃｅｌｓａ
ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｒｉｃｈ２Ｓａｌｂｕｍｉｎｇｅｎｅ；犃狋狊１：α微管蛋白抑制基因１Ａｌｐｈａｔｕｂｕｌｉｎｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ１；犆犺狋２牔犚犆犆２：几丁质酶基因Ｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ；犛犈犈１：半
胱氨酸蛋白酶基因Ａｍａｉｚｅｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｇｅｎｅｓｈｏｗｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ；犃犛犃２：邻氨基苯甲酸合成酶基因 Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅ；犔狅犾狆：致敏花粉蛋白质Ｐｏｌｅｎａｌｅｒｇｅｎ；犐犘犜：农杆菌细胞分裂素合成基因 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｃｙｔｏｋｉｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅ；
犗狊犖犎犡１：水稻液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运输蛋白基因ＴｈｅｒｉｃｅｖａｃｕｏｌａｒＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ；犪狉犵犈：Ｎ乙酰鸟氨酸脱酰基酶基因Ｎａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉ
ｎａｓｅｇｅｎｅ．
对于反刍动物来说，瘤胃内降解的蛋白质大部分被浪费掉，只有避开瘤胃发酵未被降解且被小肠消化、吸收
的蛋白才是动物真正可利用的蛋白。半胱氨酸和甲硫氨酸是反刍动物的限制性氨基酸，对动物生长发育和畜产
品数量和质量影响很大；同时，由于牧草中含硫蛋白含量都很低，因此，在饲料里补给过瘤胃含硫蛋白对提高羊毛
生长，奶牛日产奶量和肉牛增长率有积极的作用。向日葵清蛋白８（ＳＦＡ８）具有不被瘤胃液消化的特点，且含有
２３％的含硫蛋白。Ｗａｎｇ等［７３］将ＳＦＡ８与内质网定位信号ＫＤＥＬ一起转入高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪），使转
基因植株叶片中ＳＦＡ８蛋白含量占总可溶蛋白的０．２％。为了提高牧草含硫蛋白的含量，其他学者也进行了大
量相关研究，如：Ｑｕｅｃｉｎｉ等［５１］将高甲硫氨酸贮藏蛋白基因犅犲２犛１导入笔花豆；Ａｖｒａｈａｍ等［７４］获得了转拟南芥胱
硫醚γ合成酶（ＡｔＣＧＳ）基因的４个高表达紫花苜蓿株系，使叶片中的甲硫氨酸和半胱氨酸含量分别增加到原来
的３２．０和２．６倍。Ｂａｇｇａ等［７５］研究表明，外源转基因特定组合有利于游离甲硫氨酸和其在富硫蛋白中的积累。
张改娜和贾敬芬［７６］将从豌豆（食荚大菜豌，犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）中克隆出的富含硫氨基酸蛋白质基因豌豆清蛋白１
３５２第１９卷第６期 草业学报２０１０年
（犘犃１）基因转化紫花苜蓿，游离氨基酸分析表明，转基因苜蓿中蛋氨酸和半胱氨酸的含量从０．１％提高到０．４％。
有研究报道［７７］，要明显的提高牧草的品质，必须使外源蛋白占到总提取蛋白的１％～１０％才具有实际的营养价
值。因此，目前虽在提高牧草外源蛋白的研究方面已取得很大进展，但是与达到可以实际生产应用的水平相比，
还有很大的差距。
豆科牧草中的抗营养因子单宁一直是研究的热点。单宁是一类分子质量为０．５～３．０ｋｕ的多羟基酚，味苦
有收敛性。当含量达到干物质的４％～５％时，影响牧草的适口性，可使动物的进食量大减，并引起家畜中毒和其
他的一些不良反应［７８］。另外，缩合单宁可与植物蛋白结合，减少反刍动物瘤胃可降解蛋白质的数量，从而提高了
蛋白利用效率，同时还能减少膨胀病的发生。温带豆科牧草中的苜蓿、红三叶、白三叶和沙打旺（犃狊狋狉犪犵犪犾狌狊犪犱
狊狌狉犵犲狀狊）等都缺少单宁，而百脉根、红豆草（犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犪犲犳狅犾犻犪）、冠状岩黄芪（犎犲犱狔狊犮狉狌犿犮狅狉狅犺犪狉犻狌犿）单宁
含量偏高。国际上已把适宜的单宁含量作为牧草育种的目标。Ｃａｒｒｏｎ等［７９］将金鱼草（犃狀狋犻狉狉犺犻狀狌犿犿犪犼狌狊）中的
二氢黄酮还原酶（ＤＦＲ）反义ｃＤＮＡ转化百脉根外植体，通过诱导百脉根毛状根，发现缩合单宁的积累量与对照
相比减少了８０％。Ｒｏｂｂｉｎｓ等［８０］利用Ｃａｒｒｏｎ等［７９］转化的毛状根再生植株，进一步研究得出，转基因植株根、茎、
叶各个组织中单宁的含量明显下降，同时单宁代谢的改变没有影响整个植株的生物产量。
３．２　防治病虫害
牧草病虫害主要是指真菌、病毒和有害昆虫对牧草的伤害。植物的抗病虫害特性一般是受单个或少数几个
基因控制，因此，通过生物技术导入相关基因来改善植物抗性的效果都很明显。目前，抗病虫基因工程研究的主
要基因有：几丁质酶、葡聚糖酶、溶菌酶、植物防御素、植物抗毒素、核糖体蛋白、病毒外壳蛋白、病毒复制酶基因、
病毒移动蛋白、ＢＴ基因和蛋白酶抑制基因等。
β１，３葡聚糖和几丁质是真菌细胞壁的重要组成成分，β１，３葡聚糖酶和几丁质酶具有降解真菌细胞壁的作
用，从而可抑制真菌的繁殖和发展。一些研究表明，β１，３葡聚糖酶和几丁质酶在体外具有协同抑菌的作用，且
效果比单个酶作用更显著。因此，这方面的研究更多的是将两者一起进行植株的转化。Ｊｏｎｇｅｄｉｊｋ等［８１］将烟草
的β１，３葡聚糖酶基因Ｉ和几丁质酶基因Ｉ转化番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）。研究发现，二者有明显的协同
表达效果，使番茄尖孢镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿）发病率降低３６％～５８％，而单基因表达时抗病能力没有明
显增强。不同受体植物中２个基因的协同作用表现的结果不尽相同。但在苜蓿的研究中，结果却与上面的情况
相反。两者共转化苜蓿的抗病效果并不理想，而单个β１，３葡聚糖酶的转基因紫花苜蓿植株对苜蓿疫病菌
（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犿犲犵犪狊狆犲狉犿犪）有良好的抗性。研究人员认为这与２个基因在苜蓿中的表达水平低有关［８２］。褐斑
病和灰斑病也是牧草常见的真菌病，分别由立枯丝核菌（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻）和稻瘟病菌（犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲犵狉犻狊犲犪）
引起，多发于高羊茅和多年生黑麦草。Ｄｏｎｇ等［８３］研究了转Ｔ４ 溶菌酶基因高羊茅对这２种病害的抵抗性。在对
高羊茅真菌接种试验中发现，转基因植株与非转基因相比，病斑大小分别减小了６８％～８４％和７４％～９０％，且抗
病能力与对照差异性明显，表明转Ｔ４ 溶菌酶的高羊茅明显抑制了病害的组织侵害力。
在植物防治病毒病害方面，已采用的技术路线有导入病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，利用病毒的反义ＲＮＡ或卫星
ＲＮＡ基因，导入病毒的转移基因、复制酶基因等。病毒主要由核酸分子（ＤＮＡ或ＲＮＡ）和ＣＰ组成，以裸露的形
式在植物细胞中繁殖和扩增。根据病毒ＣＰ可以重新包装病毒或抑制病毒脱壳的特点，有目的地导入病毒ＣＰ基
因来抑制病毒的危害是目前最为有效的方法。苜蓿花叶病毒（ＡＭＶ）、白三叶花叶病毒（ＷＣＭＶ）和三叶草叶脉
黄化马铃薯Ｙ病毒（ＣＹＶＶ）对多种牧草品种都具有侵害性，是危害牧草生产的主要病毒病害。Ｋａｌａ等［８４］获得
了转ＡＭＶ和 ＷＣＭＶ基因的红三叶，转基因植株对这些花叶病毒表现出良好的免疫和抵抗性。赵桂琴等［８５，８６］
将外源的苜蓿花叶病毒（ＡＭＶ）外壳蛋白基因转入红三叶和白三叶，对转基因植株的检测表明，表达苜蓿花叶病
毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了
免疫的程度。
在抗虫方面，目前研究最多的是苏云金杆菌杀虫晶体蛋白（Ｂｔ）基因。Ｂｔ基因在棉花、玉米、水稻、小麦等作
物上应用较多，在牧草抗虫方面也有一些研究和应用，近年来有关的研究报道较少。Ｂｔ毒蛋白以原毒素形式存
在，在昆虫肠道内被蛋白酶水解为毒性多肽，这些多肽与昆虫肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用，致使细胞
４５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
膜产生穿孔，使昆虫幼虫停止取食，最终致死，但对人畜等哺乳动物和天敌无毒害。Ｓｔｒｉｚｈｏｖ等［８７］将Ｂｔ基因转入
苜蓿，明显提高了苜蓿对斜纹夜蛾（犛狆狅犱狅狆狋犲狉犪犾犻狋狋狅狉犪犾犻狊）和甜菜夜蛾（犛狆狅犱狅狆狋犲狉犪犲狓犻犵狌犪）２种害虫的抗性。另
外，通过修饰ＢｔＣｒｙＩＢａ基因，增加其中的Ｇ／Ｃ含量，将其中的密码子修改为植物偏爱密码子，使转基因白三叶
的叶子中ＣｒｙＩＢａδ内毒素含量达到可溶性蛋白的０．１％；在鳞翅目蝙蝠蛾科幼虫饲喂试验中，转基因白三叶对幼
虫生长表现出明显的抑制性，与非转基因材料相比增加了幼虫的死亡率［８８］。蛋白酶抑制剂（ＰＩ）基因，则主要通
过抑制昆虫消化系统中的蛋白酶，从而使昆虫消化不良，影响昆虫正常生长发育，直至死亡。Ｔｈｏｍａｓ等［８９］将烟
草天蛾蛋白酶抑制因子（ＰＩ）抗胰蛋白酶基因导入紫花苜蓿。结果表明，ＰＩ蛋白在根、叶和花中的表达量达到总
蛋白的０．１２５％，抗胰蛋白酶ＰＩ在转基因苜蓿中的积累有效地减轻了蓟马（犛犮犻狉狋狅狋犺狉犻狆狊犱狅狉狊犪犾犻狊）发病的危害。
除了以上２种常用杀虫、抑制蛋白基因，研究人员将来源于类产碱假单胞菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狆狊犲狌犱狅犪犾犮犪犾犻犵犲狀犲狊）的
杀虫蛋白进行了抗虫研究，发现其对蝗虫（犔狅犮狌狊狋犪犿犻犵狉犪狋狅狉犻犪）及直翅目昆虫具有广谱的杀伤力。Ｌｉ等［９０］将带
有类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因（狆狆犻狆）的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４转化短芒披碱草愈伤组织，通过体外再生获得转基
因植株，检测植株大约有９０％显示只插入１或２个拷贝，在蝗虫的抗性试验中，蝗虫死亡率达到１６．７３％。
３．３　抗除草剂
自１９８６年美国和法国科学家在世界上第１次将抗除草剂基因转入烟草以来，利用植物基因工程，在植物体
内引入外源抗除草剂基因来减轻或消除化学除草剂对植株的伤害，已成为植物抗除草剂育种的研究热点。目前，
抗除草剂育种工作主要是通过改变植物体内除草剂的靶蛋白，使其对除草剂不敏感或促其过量表达，以使植物吸
收除草剂后仍能进行正常代谢；其次，是引入酶或酶系统降解除草剂的毒害。现已有报道并利用的抗除草剂基因
有：犫犪狉（犘犃犜）、犵狅狓、犪狉狅犃、犛犝犚犅犎狉犪、犛犝犚犅犆３、犮狊狉１、犘狊犫犃、狋犳犇犃、犅犡狀等，其中犫犪狉基因在牧草中应用最广。
Ｋｕｔｈｌｅｅｎ等［９１］以农杆菌介导，将２种不同的启动子与犫犪狉基因融合导入苜蓿，田间试验发现，转犆犪犕犞３５犛：犫犪狉
的苜蓿对除草剂草铵磷表现出很强的抵抗力，而转犜犚２′：犫犪狉的苜蓿植株对除草剂只表现出一定的耐受性。Ｓｈｕ
等［５４］采用粒子轰击法将草丁膦乙酰转移酶（ＰＡＴ）基因转入羊草愈伤组织，并获得对草丁膦（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ，
ＰＰＴ）具有抗性的再生转基因羊草植株。在进行耐ＰＰＴ试验中，１３株非转基因羊草在喷施含有１００ｍｇ／ＬＰＰＴ
的Ｂａｓｔａ除草剂后，５ｄ内出现失绿和死亡现象，而转基因植株生长良好，也没表现出ＰＡＴ基因对生长方面的影
响。
另外，犫犪狉基因在为了使植物获得抗除草剂的特性而转化到植物中的同时，也越来越多的作为一种选择标记
基因与其他目的基因一起整合到植物基因组中，进行转基因阳性材料的筛选。抗除草剂基因越来越多的应用于
牧草生产、选育中，也增加了人们对其潜在危害的关注。当转基因通过基因流动逐渐在野生种群、非转基因同种
作物中居留后，会使得野生近缘种有获得选择优势的潜在可能性。Ｔｒａｎｅｌ等［９２］对苋属植物中对除草剂不敏感的
乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）基因在种间的传递进行了研究，将无抗性的具瘤苋（犃犿犪狉犪狀狋犺狌狊狉狌犱犻狊）与具有抗性的绿
穗苋（犃犿犪狉犪狀狋犺狌狊犺狔犫狉犻犱狌狊）杂交，结果８５％的杂交Ｆ１ 代表现出除草剂抗性，而且Ｆ１ 代可通过与亲代回交增加
后代的可育性，并且后代也对除草剂具有抗性。目前，虽然还未见到牧草方面的相关报道，但其潜在的生态安全
性值得进一步的研究，以防“超级杂草”的产生。
３．４　抗非生物胁迫牧草研究
牧草受到的非生物胁迫主要包括抗旱性、耐盐碱性和抗低温三方面。温度和降水量是限制植物地理分布及
生物产量的重要环境因素。同时，干旱、盐碱和低温也是危害农业生产的主要自然灾害。与农作物相比，牧草大
多种植在生长条件相对恶劣的环境下，因此，培育具有某一或多个抗逆性的牧草品种，对改良牧草特性，扩大种植
面积具有重要作用。到目前为止，科研工作者已经对渗透物质合成、编码水分胁迫相关蛋白、细胞抗氧化酶类等
基因的抗逆性进行了大量的研究，并通过转化不同的牧草获得了一批转基因材料。Ｗａｎｇ等［９３］将小麦ＬＥＡ基因
犜犪犔犈犃３转入羊草。干旱胁迫下，非转基因植株的相对含水量、叶片水势在经过４９ｄ处理后出现明显的下降，而
转基因植株基本保持不变；转基因植株的平均相对增长率比对照高出７５％，同时，复水后转基因植株的再生率是
对照的２０多倍。Ｗｕ等［６５］优化了多年生黑麦草的转化体系，获得了转水稻液泡膜 Ｎａ＋／Ｈ＋反向转运体基因
犗狊犖犎犡１的黑麦草，增加了黑麦草叶片中的Ｎａ＋、Ｋ＋和脯氨酸含量，使转基因植株在３５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ胁迫
５５２第１９卷第６期 草业学报２０１０年
下生长１０周不出现萎蔫。对于深根系牧草苜蓿，有的品种其根颈距地表很近，甚至就在地表，容易受到低温寒冷
的伤害。ＭｃＫｅｒｓｉｅ等［９４］将拟南芥超氧化物岐化酶基因（犉犲犛犗犇）的ｃＤＮＡ转入苜蓿，经过２年的大田越冬试验
证明，转基因植株的越冬率显著提高，但根颈中并没有额外碳水化合物的累积，证明了ＦｅＳＯＤ基因的超表达降
低了低温对苜蓿的次级伤害，提高了其冬季逆境后的恢复能力。
抗逆相关转录因子可以与下游多个相关基因结合，并激活促其表达。Ｚｈａｏ等［９５］为了改良高羊茅的耐旱特
性，将拟南芥犇犚犈犅１犃／犆犅犉３基因转化到高羊茅中，证明犇犚犈犅１犃／犆犅犉３激活了下游胁迫相关基因的表达，增
强了高羊茅的耐旱性。同样，Ｊｉｎ等［９６］通过转化获得带犌犿犇犚犈犅１的转基因紫花苜蓿，使苜蓿耐盐性提升到４００
ｍｍｏｌ／Ｌ，为对照植株的２倍。
３．５　可饲用疫苗的研究
牧草具有生产成本低、再生速度快、生物产量大等优点。自 Ｍａｓｏｎ等首次报道了利用植物表达外源蛋白进
行试验性疫苗的研究以来，越来越多的研究机构和人员投入到利用植物表达病毒性或细菌性抗原的研究［９７］。植
物基因工程疫苗是利用植物系统表达病原菌抗原蛋白的一个或几个亚单位，在不具有病原菌完整的侵染能力的
前提下使机体对特异的病毒或细菌产生免疫应答反应。转基因植物疫苗通过动物摄取含这种疫苗的植物组织或
种子获得免疫，这种疫苗不会被酶类所破坏，通过机体肠道黏膜作用使动物获得持久特异性免疫，且无或很少出
现病原体的过敏反应［９８］。Ｗｉｇｄｏｒｏｖｉｔｚ等［９７］将Ｏ１Ｃ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）结构蛋白ＶＰ１基因转化苜蓿进行转
基因植物生产病毒抗原和可饲用疫苗的研究。通过对采取注射转基因叶片提取液和饲喂叶片２种方式处理的
Ｂａｌｂ／Ｃ小白鼠血清抗体的ＥＬＩＳＡ检测，发现其对ＶＰ１具有强烈的免疫应答反应；用１０４ＳＭ５０ＬＤ的同源强毒进
行攻击，攻毒保护率分别为７７％～８０％和６６％～７５％，证明了利用苜蓿生产可饲用疫苗的可行性。ＤｕｓＳａｎｔｏｓ
等［９９］将按植物偏爱型密码子人工合成的犞犘１抗原决定簇氨基酸残基犞犘１３５１６０基因与犵狌狊犃基因融合转化苜
蓿植株，不仅优化了筛选方法，而且使攻毒保护率达到１００％，为可饲用疫苗的生产化向前推进了一步。Ｚｉａｕｄｄｉｎ
等［１００］利用农杆菌将来自溶血性曼氏杆菌（犕犪狀狀犺犲犻犿犻犪犺犪犲犿狅犾狔狋犻犮犪）的白细胞毒素基因片段（ＬＫＴ５０）转入苜蓿
中，并获得一批转基因植株，为防治家畜巴氏杆菌肺炎的发生，进行植物疫苗的研制打下了基础。
近年来，我国研究人员在转基因植物疫苗方面也取得了一系列的可喜成绩。Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒血凝素
基因犃犐犞犎犃［１０１］，口蹄疫病毒结构蛋白犞犘１基因［１０２］、犘１２犃３犆基因［１０３］，乙肝表面抗原犎犅狊犃犵基因［１０４］，兔出
血症病毒犚犎犇犞基因［１０５］，肝片吸虫保护性抗原基因犉犎３［１０６］等在豆科牧草中的表达以及部分动物免疫试验的
开展为我国将来植物可饲用疫苗的生产奠定了基础。
４　存在的问题与展望
与传统育种方式相比，通过生物技术手段引入外源基因来改变牧草性状，从而获得新品种的方法更加便捷和
吸引人，然而生物技术受目前研究水平的限制，基因插入的随机和多拷贝性、表达的不稳定性，以及材料基因型的
依赖性，使得转基因植物的效果不是很令人满意。在牧草基因工程研究中仍存在很多问题亟待解决。
一是在进行牧草转基因的研究中，高效再生与遗传转化体系的建立极为关键。尽管近年来不少课题组在这
方面投入大量的人力、物力，初步建立了一些牧草的再生和转化体系。但是这些体系转化效率不稳定，结果重复
性差，不同品种表现差异大，致使这些研究未能推广和产业化，只是停留在试验阶段，且这些研究中多以豆科牧草
为主［１０７］。而禾本科牧草的遗传转化在国际上一直是个未解决的难题，因此，牧草高效、稳定的遗传转化和体外
再生体系仍将是未来待解决的问题。
二是外源基因能否在转基因牧草中表达，以及在其后代遗传的稳定性是牧草转基因育种的成败所在。外源
基因在植物染色体上的不同插入位点引起的位置效应对基因的表达水平影响很大，这可能是由于插入位点附近
微环境对外源基因启动子的影响所致［１０８］；高拷贝的ＴＤＮＡ插入到同一或不同位点也会导致转基因沉默［１０９］；同
时，插入基因序列的特性对基因整合的结果与转化植物的表型都有一定的关联。外源基因在从亲代向子代传递
的过程中会产生基因丢失、沉默、重组、扩增等现象，使外源基因的表达活性及转基因植物的表现性状难以预测。
关于外源基因在宿主内的整合机理模型已有很多的报道，但这些模型只是根据某一物种或某一转化方法的研究
提出的，还不能适合所有的整合情况，有待进一步系统的研究。
６５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
三是在牧草转基因新品种研究方面，虽然在生产上取得了一些成绩，但转基因操作中采用的抗生素、抗除草
剂标记基因和其他病毒蛋白基因等，可能会对周边生态环境造成威胁或危害。目前安全选择标记、无选择标记和
生物除草剂等新技术的兴起使人们对转基因作物的安全性有了重新的认识。这些防护措施的采用可以解决一些
问题，但并没有从根本上解决问题。
四是植物抗逆性是受多基因调控的数量性状，个别功能基因的导入不能使植物的抗逆潜能发挥到最大。转
录因子作为相关功能基因表达的调节开关，增强某个抗逆相关转录因子的表达，可促使多个与抗逆有关基因的表
达，这为植物抗逆综合改良提供了一条非常有效的途径。近年，与植物抗逆性有关的转录因子基因（ｂＺＩＰ类、
ＷＲＫＹ类、ＮＡＣ类、ＭＹＢ类和ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ类）已从拟南芥、水稻、玉米等中被大量分离克隆出，转这些转录因
子基因的植株表现出良好的综合抗逆性，但在牧草方面鲜有报道。因此，通过调控植物体内反应传导链中的某些
基因或调控元件，激发植物自身的对生物和非生物胁迫的抗逆调控机制，从而获得广谱抗逆特性，这是牧草育种
研究未来发展的趋势。
五是我国有４亿ｈｍ２ 草地，拥有丰富的牧草资源。尽管近年来已开展了一些种质资源方面的工作，但研究
得深度和广度还不够。加大力度挖掘和鉴定我国具有重要有益农艺性状的牧草种质资源，对其进行遗传分析，建
立作图群体，这对从我国牧草中分离克隆有自主知识产权的新基因和基因表达调控元件具有重要的作用。同时，
结合分子标记技术（ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＲＡＰ、ＳＳＲ和ＩＳＳＲ等）在研究牧草资源的起源进化、基因多样性、遗
传图谱和杂种鉴定等方面的优越性［１１０，１１１］，完善我国牧草种质资源研究的框架将是未来长期研究工作的重点。
近年来，畜牧业在国民生产中的地位日益显著，牧草培育、生产等方面的研究也日渐升温，但与其他农作物相
比，社会研究投入的资金和关注程度差距仍然很大。随着环境的恶化，人们生态意识逐渐增强，我国草业必将得
到更高水平的发展。现代生物技术可以使植物具有传统育种手段无法聚集的优良性状，随着学科间的相互渗透，
各领域研究工作的不断深入和拓展，生物技术必定会对草业科学的发展起到重要推动作用，更好地为生产和生活
服务。
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犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪×犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犻狅狉狌犿［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９９，１０５：１９１１９５．
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［１９］　ＭａｃＬｅａｎＮＬ，ＮｏｗａｋＪ．Ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｈｙｐｏｃｏｔｙｌａｎｄｐｅｔｉｏｌｅｃａｌｕｓｏｆ犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲Ｌ．［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，
１９８９，８：３９５３９８．
［２０］　ＢｅａｔｔｉｅＬＤ，ＧａｒｒｅｔｔＲＧ．Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｓｈｏｏｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｉｍｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎ
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狀狅狋犪狋狌犿Ｆｌｕｇｇｅ）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，１９９０，２０：１２５１２９．
［２２］　ＨｅｓｚｋｙＬＥ，ＢｉｎｈＤＱ，ＫｉｓｓＥ，犲狋犪犾．Ｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｇｒｅｅｎｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｂｙｃａｌｕｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎ犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪犾犻犿狅狊犪
（Ｓｃｈｕｒ．）Ｈｏｌｍｂｇ．［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，１９８９，８：１７４１７７．
［２３］　ＣｈｏｏＴＭ．Ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｚｉｇｚａｇｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犳犻狌犿犿犲犱犻狌犿Ｌ．）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，１９８８，７：２４６２４８．
［２４］　ＨｏｒｎＭＥ，ＣｏｎｇｅｒＢＶ，ＨａｒｍｓＣＴ．Ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｏｒｃｈａｒｄｇｒａｓｓ（犇犪犮
狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪Ｌ．）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｔＲｅｐｏｒｔｓ，１９８８，７：３７１３７４．
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犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，１９８１，１：４７５５．
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ｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，１９９７，１６：３７９３８４．
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９５２第１９卷第６期 草业学报２０１０年
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ｐｌａｎｔｓｉｎｆｉｅｌｄ［Ｊ］．ＢｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，２００３，４７（１）：１３７１４０．
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ＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００１，２０：４８５４．
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ｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲Ｌ．）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００６，２５：６５１６５９．
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狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖａｃｕｏｌａｒＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１６９：６５７３．
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ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ犈．犮狅犾犻ａｒｇＥｇｅｎｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，１５：３３９３４７．
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狆犲狉犲狀狀犲Ｌ．）ｐｌａｎｔｓｏｆｆｏｒａｇｅａｎｄｔｕｒｆｔｙｐｅｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：５１９５２８．
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ＭＡＪｉａｎｇｔａｏ１，２，ＷＡＮＧＺｏｎｇｌｉ１，ＨＵＡＮＧＤｏｎｇｇｕａｎｇ３，ＷＵＹａｎｍｉｎ２
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Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈｅｎｚｈｅｎＴｅｃｈａｎｄＥｃｏｌｏｇｙ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０４０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｈａｓｐｅｒｍｅａｔｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｆｉｅｌｄｓ，ｓｕｃｈ
ａｓｂｏｔａｎｙ，ｚｏｏｌｏｇｙ，ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄｓｏｏｎ．Ｔｈｅｎｅｗｉｍｐｒｏｖｅｄｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｆｏｒａｇｅｓａｒｅｄｅｍａｎｄｅｄｕｒｇｅｎｔｌｙｂｅ
ｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙｗｏｒｓｅｎｅｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｈａｐｐｅｎｅｄｅｘｔｒｅｍｅｗｅａｔｈｅｒ．Ａｎｄｔｈｏｓｅａｌｓｏａｃ
ｃｅｌｅｒａｔｅｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｏｐｕｌａｒｉｚｉｎｇｏｆｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｆｏｒａｇｅ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｓｕｍｍａｒｉ
ｚｅｓｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｆｏｒａｇｅｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｎｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｑｕａｌｉｔｙｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ｄｉｓｅａｓｅａｎｄ
ｐｅｓｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓａｓｗｅｌａｓｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｅｄｉｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ
ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｏｌｖｉｎｇｎｅａｒｌｙ３０ｓｐｅｃｉｅｓｏｆｇｒａｓｓｅｓｉｎｔｈｅｐａｓｔ２０ｙｅａｒｓ．Ｆｉｎａｌｙ，ｗｅａｎａｌｙｚｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎｆｏｒａｇｅ
ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈ，ａｎｄｍａｋｅａｐｒｏｓｐｅｃｔｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｒｅｎｄｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｔｈｉｓ
ｆｉｅｌｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｆｏｒａｇｅ；ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
２６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６