全 文 ：书大叶补血草犖犪＋／犎＋逆向转运蛋白
基因的克隆及序列分析
周玲玲１，缪建锟１，祝建波１，曹连莆２
（１．石河子大学生命科学学院 农业生物技术重点实验室，新疆 石河子８３２０００；２．石河子大学农学院，新疆 石河子８３２０００）
摘要：根据同源序列区域设计简并引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ方法从盐生植物大叶补血草中分离了 Ｎａ＋／Ｈ＋
逆向运输蛋白基因的ｃＤＮＡ（犔犵犖犎犡１，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＵ７８０４５７）。犔犵犖犎犡１的ｃＤＮＡ全长为２３９７ｂｐ，５′端非
翻译区长度为５１２ｂｐ，３′端非翻译区长度为２２９ｂｐ，其中包括１２ｂｐ的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴，中间的开放读码框为１６５６
ｂｐ，编码１个５５０个氨基酸的多肽，推测分子量为６１ｋＤ。氨基酸同源性分析表明，ＬｇＮＨＸ１与北滨藜、小麦、盐角
草和拟南芥液泡Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运输蛋白的一致性分别为８２．６２％，８２．０１％，８０．６４％和７５．８６％。预测分析表明，
ＬｇＮＨＸ１具有１１～１２个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白（ＬｇＮＨＸ１）与液泡型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白
的亲缘关系较近，与质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白亲缘关系较远。
关键词：大叶补血草；Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因（犖犎犡１）；ｃＤＮＡ克隆；ＲＡＣＥ
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４０．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０５０１７６０８
土壤盐渍化是影响农业生产与生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素。在我国干旱、半干旱地区的盐
碱地占国土面积的１／２左右，严重制约农业生产的发展［１］。如何利用大面积的盐碱地，提高作物耐盐性是目前面
临的一个重要研究课题。随着生物技术的发展和广泛应用，克隆植物耐盐相关基因并利用转基因技术将一些与
抗性密切相关的外源目的基因导入栽培植物中来提高其耐盐性是解决盐渍化的一条有效途径。近年来，培育优
质抗逆的牧草和草坪草品种日益成为研究的热点问题［２］。
在干旱和半干旱地区，土壤表层盐分的积累是农作物产量的严重限制因素。盐胁迫主要由钠离子引起的，土
壤中Ｎａ＋盐过多会引起植物体内离子不平衡、水分亏缺和离子毒害［３～５］。对此，植物体内会形成一些调节适应机
制以保持胞质内较低的Ｎａ＋浓度，如离子的选择性吸收、减少Ｎａ＋的吸入、Ｎａ＋的区隔化和Ｎａ＋的外排［６］。其中
Ｎａ＋的区隔化和Ｎａ＋的外排是由Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白调节的。液泡膜上的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白将细胞质
中的Ｎａ＋逆着Ｎａ＋浓度梯度送到液泡中区隔离集中，可以减少Ｎａ＋对细胞器和酶的伤害，促使细胞从外界环境
中吸收水分，维持渗透平衡。因此，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白对植物抵御盐分的胁迫起着重要作用。
目前，已从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）［７］、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［８］、北滨藜（犃狋狉犻狆犾犲狓犵犿犲犾犻狀犻）［９］、玉米
（犣犲犪犿犪狔狊）［１０］、盐地碱蓬（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）等多种植物中克隆到液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因。将拟南芥液
泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因进行遗传转化，发现过量表达该基因产物的转基因拟南芥可在２００ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＮａＣｌ环境中正常生长发育［１１］。过量表达拟南芥液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的转基因番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊
犮狌犾犲狀狋狌犿）在２００ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ胁迫下也能够正常生长、开花和结实［１２］。这些结果说明，转单一的Ｎａ＋／Ｈ＋
逆向转运蛋白基因能够明显提高植物耐盐性，同时也说明了Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白在植物耐盐性方面具有重要
作用。
目前大多数Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因是从具有低逆向运输活性的甜土植物中分离的，但前人的研究表明
盐生植物普遍具有在液泡中高效区隔化 Ｎａ＋的机制［７］。关于盐生植物 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运输蛋白基因只在北滨
藜［９］、番杏（犜犲狋狉犪犵狅狀犻犪狋犲狋狉犪犵狅狀犻狅犻犱犲狊）［１３］等植物中研究过。大叶补血草 （犔犻犿狅狀犻狌犿犵犿犲犾犻狀犻犻）是一种优良的盐
１７６－１８３
２００９年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第５期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
收稿日期：２００８１１１９；改回日期：２００８１２１５
基金项目：国家转基因专项“转新型抗旱、耐盐碱等基因的棉花种质资源材料创造”（２００８ＺＸ０８００５００４）和石河子大学自然科学与技术创新项
目（ＺＲＫＸ２００８０３４）资助。
作者简介：周玲玲（１９６６），女，新疆伊宁人，副教授，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｍｓｙｚｌ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｃａｏｌｉａｎｐｕ＠１２６．ｃｏｍ
生牧草，在新疆北部戈壁荒滩、盐土及盐渍化荒地上成片分布，为了探讨植物的耐盐机理，培育出能在盐渍土壤中
生存的农作物新品种，以大叶补血草为材料，从中分离出Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因，为将其用于遗传转化，提
高作物耐盐性奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 大叶补血草种子采自新疆石河子市北湖公园附近的盐渍化荒地，经灭菌后在１／２ＭＳ培养基
中萌发，长成幼苗，采集叶片作为实验材料。
１．１．２ 菌株、质粒和试剂 大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α菌株为本实验室保藏菌种。ｐＧＭＴ测序载体、快
速扩增ｃＤＮＡ５′末端全长试剂盒（５′ｆｕｌＲＡＣＥｋｉｔ）和快速扩增ｃＤＮＡ３′末端全长试剂盒（３′ｆｕｌＲＡＣＥｋｉｔ）均
购自ＴａＫａＲａ公司，核糖核酸（ＲＮＡ）提取试剂、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）产物回收试剂盒、脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）
分子量标记、ＥｃｏＲ１等限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶均购自天根公司，ＰＣＲ引物合成及测序均由上海生工生
物工程技术服务有限公司完成，其他试剂均为分析纯。
１．２ 方法
将２００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ水溶液倒入大叶补血草无菌苗的培养基中，胁迫幼苗１２ｈ。取其幼叶在液氮中研磨
至粉状，按照ＲＮＡ提取试剂（ＱＩＡＧＥＮ）上的操作说明提取总的ＲＮＡ。
１．２．１ 核心片段的克隆 根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的植物犖犎犡１基因氨基酸序列的保守区，设计合成了１对ＰＣＲ
简并引物，其序列为，Ｐ１：ＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＲＣＡＲＴＴＹＴＴ和 Ｐ２：ＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧ
ＧＴＧＳＷＮＧＴＤＡＴＣＡＴ，反转录用ＯｌｉｇｏｄＴ作引物，反应条件：４２℃６０ｍｉｎ，９０℃５ｍｉｎ，４℃５ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增
按照９４℃４ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ进行，扩增获得的产物经琼脂糖凝胶
电泳检测，将预期的ＤＮＡ片段回收后，克隆于ＰＧＭＴ载体上，菌液ＰＣＲ检测后送上海生工生物工程技术服务
有限公司测序。
１．２．２ ５′ＲＡＣＥ 采用５′ｆｕｌＲＡＣＥｋｉｔ试剂盒。首先使用碱性磷酸酶对总 ＲＮＡ中裸露的５′磷酸基团进行去
磷酸反应；再使用烟草酸焦磷酸酶去掉ｍＲＮＡ的５′帽子结构，保留１个磷酸基团；在Ｔ４ＲＮＡ连接酶（４０Ｕ／μＬ）
的作用下在５′端连接上５′ＲＡＣＥ接头得到ＬｉｇａｔｅｄＲＮＡ。５′ｆｕｌＲＡＣＥｃＤＮＡ合成的反应体系为１０μＬ，含有
６μＬ的加接头的 ＲＮＡ，０．５μＬ的随机引物９ｍｅｒｓ（５０μｍｏｌ／Ｌ），２μＬ的５×ＭＭＬＶ缓冲液，１μＬ的ｄＮＴＰ混
合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），０．２５μＬ的 ＲＮＡ 酶抑制剂（４０Ｕ／μＬ），０．２５μＬ的逆转录酶 ＭＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ
－）（２００
Ｕ／μＬ）。反应条件为３０℃１０ｍｉｎ；４２℃６０ｍｉｎ；７０℃１５ｍｉｎ以完成ｃＤＮＡ第１链的合成。
根据已克隆获得的大叶补血草 犖犎犡１基因核心片段序列，分别设计５′ＲＡＣＥ 特异性引物５Ｐ１：ＣＣＣＴ
ＴＣＡＣＣＧＡＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＡ和５Ｐ２：ＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣ。依照ＴａＫａＲａ５′ｆｕｌＲＡＣＥｋｉｔ操
作指南进行，以５′ＲＡＣＥｃＤＮＡ原液为模板，用５′ＲＡＣＥ外侧引物和５Ｐ１为正反引物，进行套式ＰＣＲ反应，扩
增参数：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。再以上述ＰＣＲ反应液为模板，利
用５′ＲＡＣＥ内侧引物和５Ｐ２为正反引物，进行套式ＰＣＲ 反应，扩增参数：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，
７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ，扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收目的片段，再进行连接、转
化、克隆和测序。
１．２．３ ３′ＲＡＣＥ 采用３′ｆｕｌＲＡＣＥｋｉｔ试剂盒。３′ｆｕｌＲＡＣＥｃＤＮＡ合成的反应体系为１０μＬ，含有１μＬ的
３′ＲＡＣＥ接头（５μｍｏｌ／Ｌ）引物，２μＬ的５×ＭＭＬＶ 缓冲液，１μＬ的ｄＮＴＰ混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），２．５μＬ的无
ＲＮＡ酶的灭菌水，０．２５μＬ的 ＲＮＡ 酶抑制剂（４０Ｕ／μＬ），３μＬ的总 ＲＮＡ，０．２５μＬ的逆转录酶 ＭＭＬＶ
（ＲＮａｓｅＨ－）（２００Ｕ／μＬ）。将反应体系在４２℃保温６０ｍｉｎ以完成ｃＤＮＡ第１链的合成。
根据获得的大叶补血草 犖犎犡１基因核心片段序列，设计３′ＲＡＣＥ特异性引物，３Ｐ１：ＴＧＣＧＡＣＴＣＴＧＴ
ＣＡＴＴＴＧＴＴＧ和３Ｐ２：ＴＧＧＧＴＴＴＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＣ。依照ＴａＫａＲａ３′ｆｕｌＲＡＣＥｋｉｔ操作指南进
行，以３′ＲＡＣＥｃＤＮＡ原液为模板，用３Ｐ１和３′ＲＡＣＥ外侧引物为正反引物，进行套式ＰＣＲ反应，扩增参数：
９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。再以上述ＰＣＲ反应液为模板，利用３Ｐ２
７７１第１８卷第５期 草业学报２００９年
和３′ＲＡＣＥ内侧引物为正反引物，进行套式ＰＣＲ反应，扩增参数９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃４５ｓ，７２℃２ｍｉｎ，
３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收目的片段，再进行连接、转化、克隆和
测序。
１．２．４ 大叶补血草犖犎犡１基因开放阅读框的扩增 根据已获得的大叶补血草ＮＨＸ１基因核心片段序列及３′
端和５′端的序列进行序列拼接得到基因的全序列，设计特异性引物Ｐ３：ＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＧＴＴＣＡＡＴＣＴＴ
ＧＣＣＡＡＡＡ和Ｐ４：ＧＧＴＣＡＣＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＧＴＣＡＡＡＴＴ，通过ＲＴ－ＰＣＲ，扩增参数：９４℃５ｍｉｎ；
９４℃３０ｓ，５６℃１ｍｉｎ；７２℃２ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ，扩增产物用１％的琼脂糖凝胶电泳检测，确定目的条
带，切胶回收目的片段。回收产物克隆于ＰＧＭＴ载体，蓝白斑筛选阳性菌落并进行菌落ＰＣＲ鉴定，选取鉴定正
确的阳性克隆测序。
１．２．５ 大叶补血草Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因ｃＤＮＡ序列分析 使用ＤＮＡＭＡＮ进行核苷酸序列的翻译和氨
基酸序列的比对分析及分子系统树的构建，使用在线工具ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿
ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ预测蛋白质跨膜区。
２ 结果与分析
２．１ 大叶补血草Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白全长ｃＤＮＡ的克隆
使用简并性引物Ｐ１和Ｐ２进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到１个与预期扩增片段相符的约１０００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段
（图１）。测序结果表明，获得了１个９８５ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，用ｂｌａｓｔ比对，证实这个ｃＤＮＡ片段与已克隆的
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因具有较高的同源性，说明获得的片段是Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因的片段。根据此
片段设计基因特异引物３Ｐ１和３Ｐ２、５Ｐ１和５Ｐ２，用ＲＡＣＥ技术扩增到此基因的５′和３′ｃＤＮＡ末端序列（图２和
３），将琼脂糖凝胶上的ＤＮＡ带回收并克隆测序。
测序结果显示，５′和３′端片段的长度分别为９６８和８４２ｂｐ，它们与中间９８５ｂｐｃＤＮＡ片段相应末端分别有
１７２和２２６ｂｐ的重叠区，将这３个片段核苷酸序列进行拼接，得到大叶补血草ＮＨＸ１基因的全长ｃＤＮＡ，其长度
为２３９７ｂｐ。按ｃＤＮＡ的序列设计可读框的特异性引物Ｐ３和Ｐ４，用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆大叶补血草犖犎犡１开
放阅读框ＯＲＦ（图４），对其测序证明拼接序列是准确的。在该序列的５′端存在５１２ｂｐ的非翻译区（ＵＴＲ），中间
为１６５６ｂｐ的ＯＲＦ，３′ＵＴＲ长度为２２９ｂｐ，其中包括１２ｂｐ的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴。将此基因命名为犔犵犖犎犡１。该
基因ｃＤＮＡ全长在ＧｅｎＢａｎｋ中的登陆号为ＥＵ７８０４５７。
２．２ ＬｇＮＨＸ１和其他Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白亲缘关系比较
由核苷酸推导的大叶补血草Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白含有５５０个氨基酸，推测分子量为６１ｋＤ。疏水性分析
图１ 犚犜－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．１ 犚犜－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记；１：ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
图２ ５′犚犃犆犈－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．２ ５′犚犃犆犈－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记ＤＮＡ（ＤＬ２０００）；１：５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ扩增产物
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；１：５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
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图３ ３′犚犃犆犈－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．３ ３′犚犃犆犈－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记；１：３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ扩增产物
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｓ
图４ 犔犵犖犎犡１犗犚犉的扩增产物
犉犻犵．４ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犔犵犖犎犡１犗犚犉
１：犔犵犖犎犡１的ＰＣＲ扩增产物；Ｍ：分子量标记
１：ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犔犵犖犎犡１ｃＤＮＡ；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ
表明，ＬｇＮＨＸ１的Ｎ末端为一疏水结构，可能由１１～１２个跨膜结构域组成（图５）。将犔犵犖犎犡１的氨基酸序列
与其他植物的ＮＨＸ１的氨基酸序列进行同源性比较。结果表明，它与北滨藜（Ａ１３０３８４９２）、番杏（ＡＦ５２７６２５）、盐
角草（犛犪犾犻犮狅狉狀犻犪犲狌狉狅狆犪犲犪）（ＡＹ１３１２３５）、盐地碱蓬（ＡＹ２６１８０６）和拟南芥（ＡＹ６８５１８３）的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白
具有很高的同源性，分别为８２．６２％，８２．０１％，８０．６４％，７９．８６％和７５．８６％（表１）。ＬｇＮＨＸ１的跨膜区与其他
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的跨膜区相似性较高。ＬｇＮＨＸ１中Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡
嗪嘧的结合位点“ＦＦＩＹＬＬＰＰＩ”是高度保守的［１４］（图６）。
为了分析不同Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白之间的遗传关系，进行了系统发育分析（图７），ＬｇＮＨＸ１与液泡型的
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的亲缘关系较近，其中包括 ＡｇＮＨＸ１、ＡｄＮＨＸ１、ＳｅＮＨＸ１、ＡｔＮＨＸ１等，ＡｔＮＨＸ１的功
能是在液泡膜上将Ｎａ＋区隔化到液泡中［７］。ＬｇＮＨＸ１与ＡｇＮＨＸ１、ＡｄＮＨＸ１、ＳｅＮＨＸ１属于同一簇，都是盐生
植物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白。ＬｇＮＨＸ１与质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白亲缘关系较远，如 ＭｃＳＯＳ１、Ｌｅ
ＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ１、ＡｔＳＯＳ１，它们在质膜上执行 Ｎａ＋外排的功能［１５］。这些结果表明，犔犵犖犎犡１是液泡型的 Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运蛋白基因。
图５ 犔犵犖犎犡１的疏水性分布图（用犜犕狆狉犲犱分析）
犉犻犵．５ 犎狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔狆犾狅狋狅犳犔犵犖犎犡１（狌狊犲犜犕狆狉犲犱犪狀犪犾狔狊犲）
９７１第１８卷第５期 草业学报２００９年
表１ 犔犵犖犎犡１与不同犖犪＋／犎＋逆向转运蛋白同源性比较
犜犪犫犾犲１ 犛犻犿犻犾犻狋狔犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犔犵犖犎犡１狋狅狏犪狉犻狅狌狊犖犪＋／犎＋犪狀狋犻狆狅狉狋犵犲狀犲狊
基因 Ｇｅｎｅ 来源Ｓｏｕｒｃｅ 登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 同源性Ｓｉｍｉｌｉｔｙ（％）
犃犵犖犎犡１ 北滨藜犃．犵犿犲犾犻狀犻 ＡＢ０３８４９２ ８２．６２
犜狋犖犎犡１ 番杏犜．狋犲狋狉犪犵狅狀犻狅犻犱犲狊 ＡＦ５２７６２５ ８２．０１
犃犱犖犎犡１ 犁苞滨藜犃．犱犻犿狅狉狆犺狅狊狋犲犵犻犪 ＡＹ２１１３９７ ８１．７２
犛犲犖犎犡１ 盐角草犛．犲狌狉狅狆犪犲犪 ＡＹ１３１２３５ ８０．６４
犛狊犖犎犡１ 盐地碱蓬犛．狊犪犾狊犪 ＡＹ２６１８０６ ７９．８６
犘狋犖犎犡１ 毛白杨犘狅狆狌犾狌狊狋狅犿犲狀狋狅狊犪 ＡＹ６６０７４９ ７６．６７
犌犺犖犎犡１ 陆地棉犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿 ＡＦ５１５６３２ ７６．１７
犃狋犖犎犡１ 拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 ＡＹ６８５１８３ ７５．８６
犞狏狀犺狓１ 葡萄犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪 ＡＹ６３４２８３ ７３．６０
犎狏犖犎犡１ 大麦 犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲 ＡＹ４６１５１１ ７０．０９
犣犿犖犎犡１ 玉米犣．犿犪狔狊 ＡＹ２７００３６ ６９．８６
犜犪犖犎犡１ 小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 ＡＹ４６１５１２ ６６．４３
犔犲犖犎犡１ 番茄犔．犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿 ＡＪ３０６６３０ ６５．７６
犃犲犖犎犡１ 长穗堰麦草犔狅狆犺狅狆狔狉狌犿犲犾狅狀犵犪狋狌犿 ＡＦ５０７０４４ ６４．３５
犓犮犖犎犡１ 花花柴 犓犪狉犲犾犻狀犻犪犮犪狊狆犮犻犪 ＤＱ３０３２３１ ６０．６５
３ 讨论
耐盐性是一个复杂性状，是多个基因相互作用的结果，植物中存在大量的盐胁迫反应基因似乎也支持这个观
点。以前认为一个特定基因型的品种只有包含多个耐盐基因才能具有耐盐性，单一基因不能提高作物的耐盐
性［１２］。然而有研究表明，转单一的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因能够明显地提高作物的耐盐性［１１，１２］。拟南芥液
泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运转蛋白基因犃狋犖犎犡１在拟南芥［１１］、番茄［１２］和油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊）中［１６］的过量表达，均
获得了耐盐性提高的转基因植株。因此，根据犖犎犡１的同源基因氨基酸序列，本研究成功地从耐盐植物大叶补
血草中，获得液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运输蛋白基因。这个基因与其他植物的液泡型Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运输体基因高度
同源。
疏水性分析表明，本研究所克隆的ＬｇＮＨＸ１具有１１～１２个跨膜区域（图５）。与其他植物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向
转运蛋白的比较可以看出，跨膜区是高度保守的（图６）。真核生物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的跨膜区片段是高度
保守的，因此这些区域在Ｎａ＋／Ｈ＋交换中可能起到重要作用［１７］。ＬｇＮＨＸ１的跨膜区ＴＭ３具有１个推测的氨氯
吡嗪咪（Ｎａ＋通道阻断物）结合序列，这段序列在其他植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白ＮＨＸ以及哺乳动物Ｎａ＋／Ｈ＋
逆向转运蛋白ＮＨＥ中均高度保守，氨氯吡嗪咪与真核生物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白结合后能抑制其转运活性。
ＬｇＮＨＸ１的Ｃ末端比质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的Ｃ末端短的多，仅有１００多个氨基酸。ＡｔＮＨＸ１的Ｃ
末端定位于液泡腔内，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等［１８］认为ＡｔＮＨＸ１的Ｃ末端可能是糖基化或其他蛋白修饰的位点。系统发
育分析也表明ＬｇＮＨＸ１与液泡型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白亲缘关系近，与质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的
亲缘关系较远（图７），ＡｔＮＨＸ１的功能是在液泡膜上将 Ｎａ＋区隔化到液泡中。ＬｇＮＨＸ１与 ＡｇＮＨＸ１、ＡｄＮ
ＨＸ１、ＳｅＮＨＸ１属于同一簇，都是盐生植物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白。因此ＬｇＮＨＸ１的功能可能是跨液泡膜运
输Ｎａ＋，并将其在液泡中积累。
利用基因转化来提高植物抗盐性，是可行的耐盐基因工程策略，继Ｂｌｕｍｗａｌｄ等转犃狋犖犎犡１基因的油菜和
番茄成为第１批具有实用价值的耐盐农作物后，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白成为人们关注的热点。然而无论在正常
生长条件还是盐胁迫下，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的活力和表达调控机制都还不十分清楚。尽管已经克隆了一些
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因，但是从不同植物中克隆Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因有利于在分子水平上研究这些
０８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
图６ 犔犵犖犎犡１与其他植物犖犪＋／犎＋逆向转运蛋白氨基酸序列的比对
犉犻犵．６ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犖犪＋／犎＋犪狀狋犻狆狅狉狋犲狉犳狉狅犿狆犾犪狀狋狊
加黑部分是一致性的氨基酸，其他植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的登陆号和来源见表１Ｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｅｂｏｘｅｄ
ｉｎｂｌａｃｋ，ｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓａｎｄｓｏｕｒｃｅｓｏｆｅａｃｈｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒａｒｅｓｅｅｎａｔｔａｂｌｅ１
基因的结构和功能，从而研究调节Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白活力的转录及翻译后调控。因此从盐生植物大叶补血
草中分离了Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因。克隆和分析鉴定这些基因对更进一步深入了解该类基因的耐盐作用
机理是必不可少的，此外从耐盐的盐生植物中分离Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因很可能具有更强大的Ｎａ＋／Ｈ＋离
１８１第１８卷第５期 草业学报２００９年
图７ 犔犵犖犎犡１与其他代表植物的犖犪＋／犎＋逆向转运体的系统发育分析
犉犻犵．７ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犔犵犖犎犡１犪狀犱狅狋犺犲狉狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲犖犪＋／犎＋犪狀狋犻狆狅狉狋犲狉狊
ＬｅＮＨＸ１：番茄ＮＨＸ１；ＡｔＮＨＸ１：拟南芥ＮＨＸ１；ＬｇＮＨＸ１：大叶补血草ＮＨＸ１；ＴｔＮＨＸ１：番杏ＮＨＸ１；ＡｇＮＨＸ１：北滨藜ＮＨＸ１；
ＡｄＮＨＸ１：犁苞滨藜ＮＨＸ１；ＳｅＮＨＸ１：盐角草ＮＨＸ１；ＭｃＳＯＳ１：冰叶午时花（犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿 ）ＳＯＳ１；
ＬｅＳＯＳ１：番茄ＳＯＳ１；ＡｔＳＯＳ１：拟南芥ＳＯＳ１；ＯｓＳＯＳ１：水稻ＳＯＳ１
子逆向转运功能，将其用于遗传转化，对于提高作物耐盐性将会更加有效。目前已经成功地构建了大叶补血草
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因的植物表达载体，转化拟南芥的工作正在进行中。期望通过对该基因转化模式植物
拟南芥的研究，进一步了解这个Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因在盐胁迫下的表达情况，阐明Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋
白在植物耐盐性中的作用，为选择更为优良的耐盐基因奠定基础。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犪犖犪＋／犎＋犪狀狋犻狆狅狉狋犲狉犵犲狀犲犻狀狋犺犲犺犪犾狅狆犺狔狋犲犔犻犿狅狀犻狌犿犵犿犲犾犻狀犻
ＺＨＯＵＬｉｎｇｌｉｎｇ１，ＭＩＡＯＪｉａｎｋｕｎ１，ＺＨＵＪｉａｎｂｏ１，ＣＡＯＬｉａｎｐｕ２
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２０００，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｖａｃｕｏｌａｒｔｙｐｅｄＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｈａｌｏｐｈｙｔｅ犔．犵犿犲犾犻狀犻犻ｂｙＲＴ－ＰＣＲ
ａｎｄＲＡＣＥ．Ｔｈｅ犔犵犖犎犡１ｃＤＮＡｗａｓ２３９７ｂｐｉｎｃｌｕｄｉｎｇａ５′ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆ５１２ｂｐａｎｄａ３′ｎｏｎｔｒａｎｓ
ｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆ２２９ｂｐｗｉｔｈｐｏｌｙＡ，ａｎｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ１６５６ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｏｆ
５５０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｗｉｔｈａｐｒｅｄｉｃｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｏｆ６１ｋＤ．Ｉｔｗａｓｓｈｏｗｎｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎａｌｙ
ｓｉｓｔｈａｔｔｈｅＬｇＮＨＸ１ｗｅｒｅ８２．６２％，８２．０１％，８０．６４％ａｎｄ７５．８６％ｉｄｅｎｔｉｔｉｃａｌｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｔｏｔｈｅｖａｃｕｏｌａｒ
ｔｙｐｅｄＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｓｆｒｏｍ犃狋狉犻狆犾犲狓犵犿犲犾犻狀犻，犜犲狋狉犪犵狅狀犻犪狋犲狋狉犪犵狅狀犻狅犻犱犲狊，犛犪犾犻犮狅狉狀犻犪犲狌狉狅狆犪犲犪ａｎｄ
犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴＭｐｒｅｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄ１１－１２ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｏｆＬｇＮＨＸ１．
ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔＬｇＮＨＸ１ｉｓｍｏｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｖａｃｕｏｌａｒｔｙｐｅｄＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ，ｃｏｍ
ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｔｙｐｅＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ，ｔｏｗｈｉｃｈｉｔｉｓｌｅｓｓｒｅｌａｔｅｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔犻犿狅狀犻狌犿犵犿犲犾犻狀犻犻；ｖａｃｕｏｌａｒｔｙｐｅｄＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ（犖犎犡１）；ｃＤＮＡ；ＲＡＣＥ
３８１第１８卷第５期 草业学报２００９年