全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
大叶补血草质膜 Na+ /H+ 逆向转运蛋白基因
SOS1的克隆及对番茄的遗传转化
马苏勇1 祝建波 2 王爱英 2 周玲玲 2
( 1石河子大学外国语学院,石河子 832000; 2石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子 832000)
摘 要: 根据大叶补血草 ( L im onium gmelinii(W ild.l ) Kuntze) SOS1基因序列 (登录号: EU780458)设计特异性引物, 通过
RTPCR方法从叶片中克隆得到质膜 Na+ /H +逆向转运蛋白基因 LgSOS1,将该基因重组于质粒 pCAMB IA1390的 CaMV35S启
动子下游, 构建含 LgSOS1基因植物表达载体 pCAMB IA1390LgSOS1。通过根癌农杆菌介导法转化番茄 ( Lycopersicon esculen
tum ),在 12 m g /L 6BA、0 2 m g /L IAA、20 m g /L潮霉素和 200 m g /L羧苄青霉素的 MS培养基上进行选择培养,从抗性愈伤组
织中获得再生植株。经 PCR和 RTPCR检测,初步证实 LgSOS1基因已整合至番茄的基因组中。
关键词: 大叶补血草 SOS1基因 番茄 遗传转化
Cloning and Genetic Transformation of Tomato w ith
SOS1 Gene from L imonium gmelinii
M a Suyong
1
Zhu Jianbo
2
W angA iying
2
Zhou L ing ling
2
(
1
Co llege of Foreignlanguage, Shihez i University, Shihezi 832000;
2
K ey Laboratory of AgricultureB iological T echnology of College of LifeScience, Shihezi University, Shihez i 832000)
Abstrac:t A p lasm a m embranetyped N a+ /H+ antiporter gene SOS1 has been separa ted from halophyte L im on ium gmelinii
( W ild.l ) Kuntze by RTPCR. Expression casse ttes inc lud ing a CaMV35S promo ter, the Na+ /H+ antiporter g ene LgSOS1, and NOS po ly
A sequencew ere c loned into the vector pCAMB IA1390, wh ich was transferred into tom ato byAgrobacteriumm ed iated m ethod. T ransgen
ic tom a toes w ere regenerated and se lected on MS basalm edium supplem ented w ith 1 2 mg /L 6BA, 0 2 m g /L IAA, 20 m g /LH yg rom y
cin and 200 mg /L carbenic illin. Som eH ygrom yc inBres istan t transgen ic tom atoes w ere ob tained and confirm ed by PCR and RTPCR.
Key words: L im on ium gm elinii SOS1 gene Lycop ersicon esculentum Gene tic transfo rm ation
收稿日期: 20100301
基金项目:国家转基因专项 ( 2008ZX08005004) ,石河子大学高层次人才启动项目 ( RCZX200903 )
作者简介:马苏勇,男,实验师,研究方向:植物基因工程
通讯作者:周玲玲, Em ai:l m syz@l 163. com
N a
+
/H
+逆向转运蛋白是细菌、酵母、藻类、动
物和高等植物膜系统上普遍存在的一种转运蛋白,
参与细胞质内的 pH、N a+浓度调节和细胞体积变
化等生命活动 [ 1 - 3]。在高盐浓度下植物可以通过
质膜和液泡膜上的 N a+ /H +逆向转运蛋白, 逆 Na+
浓度梯度将 Na+运出细胞或将 N a+区隔化在液泡
内, 以维持细胞质 N a+稳态和 N a+ /K +比相对稳
定, 减少 N a+对细胞质中细胞器的毒害, 因此,
N a
+
/H
+逆向转运蛋白在植物抵御盐胁迫中起重
要作用 [ 4]。
随着对盐生植物及植物耐盐分子机制的研究,
目前,人们已克隆了许多与植物抗干旱和耐盐碱相
关的基因,在拟南芥中发现的 SOS基因家族就是一
类与耐盐相关的重要基因家族 [ 5] , 其中比较重要的
为 SOS1、SOS2和 SOS3三个基因。 SOS1基因位于
植物细胞质膜上, 负责 Na+ 外排。 Shi等 [ 7 ]从拟南
芥中克隆到 SOS1基因后 [ 6] , 在拟南芥中做了过量
表达,转基因植株的耐盐性明显提高。拟南芥 SOS1
基因突变体对盐超敏感, 表明 SOS1基因在植物耐
盐机制中起重要作用。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
SOS基因是一类与抗逆相关的重要基因, 能否
在植物中高效表达、具备抗逆功能等研究具有重
要的科学意义和应用前景。大叶补血草 L imonium
gmelinii (W ild.l ) Kuntze是新疆特有的泌盐植物,
其生境土壤多为盐化草甸土, 根际土含盐量达
23%时, 群落生长良好。因此, 推断大叶补血草
的 Na+ /H +逆向转运蛋白可能具有很强的 N a+转
运能力。本试验将分离到的 LgSOS1基因转入经
济作物番茄中, 以期获得耐盐能力提高的转基因
番茄植株, 对培育新型转基因耐盐作物具有重大
意义。
1 材料与方法
11 材料与试剂
大叶补血草 L. gm eliniie种子采自新疆石河子
市北湖公园附近的盐渍化荒地,经表面灭菌后在1 /2
M S培养基中萌发, 长成幼苗,采集叶片作为试验材
料。番茄 ( Ly cop ersicon esculentum )种子为新疆玛纳
斯帮农种业有限责任公司的红番部落三号 875,将
番茄种子用 20%次氯酸钠浸泡 15 m in,再用无菌水
反复冲洗至少 6遍,然后接种于无激素的 1 /2MS培
养基上,于 26 16 h 40 mo l/ (m 2 s)光照, 70%相
对湿度条件下培养 1周。将番茄下胚轴剪成 1 cm
左右的小段,在培养基 (M S+ 12 mg /L 6BA + 02
mg /L IAA )平板上预培养 2– 3 d ( 26 , 16 h 40
mo l/ (m 2 s)光照 )备用。
大肠杆菌 (E scherich ia coli) DH5、pCAMBIA1390
由石河子大学农业生物技术重点实验室提供, 根癌
农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101由中国
热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室
赠送。
所用化学试剂均为国产分析纯; 所用 DNA限制
性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、逆转录
酶及其反应所用的 Bu ffer等均购自 Fermentas公司,
RNA提取试剂 RNA Plant Regent和 Trizo l Reagent
购于 Q IAGEN公司,琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购
自北京 T iangen公司, PCR引物合成及测序由上海
生工生物工程技术服务有限公司完成。
12 方法
121 大叶补血草叶片总 RNA的提取 用 200
mmo l /L N aC l溶液对大叶补血草无菌苗进行 12 h处
理后,取叶片在液氮中研磨至粉状, 按照 RNA plant
Reagent的方法提取总的 RNA。
122 特异性引物的合成 根据大叶补血草 Lg
SOS1基因序列 (登录号: EU780458)设计引物,同时
在上游引入 Xba I、下游引入 EcoR I酶切位点。引
物序列为 P1: TCTAGA (Xba I) CTGATCCAGTAGG
AGGAATTAGAAG和 P2: GAATTC (E coR I) AAAA
TAAGCAACATGATATGGAAGA。
123 RTPCR扩增 RT反应体系: RNA 50 ng,
O ligo dT 2 L置 70 5m in, 然后置冰上。再加入 5
!M MLV Buffer 4 L, dNTP ( 25 mmo l/L ) 2 L,
RNase inh ib itor 05 L, M MLV R everseTranscriptase
05 L, 加 RNasefreeH 2O至 20 L于 42 反应 1
h, 72 10m in,然后置冰上。
PCR反应体系: 上述 RT产物 2 L, 10 ! PCR
Bu ffer 2 L, M gC l2 1 L, dNTP ( 25 mmol /L ) 05
L, ddH2O 13 L, P1 ( 25 mmo l/L ) 05 L, P2 ( 25
mmo l/L ) 05 L, Taq po lymerase 05 L, 共 20 L。
反应程序: 95 4 m in; 95 30 s, 58 30 s, 68 3
m in, 25个循环; 72 7m in。
124 PCR产物的回收、连接和转化 将 PCR产
物于 1%琼脂糖凝胶进行电泳, 对符合预期大小的
片段进行回收、连接。连接体系为: 回收片段
75 L, pGM T载体 05 L, T4 L igase Buffer 1 L,
T4 Ligase 1 L, 16 连接过夜。取连接产物 5 L转
化感受态大肠杆菌 DH5菌株 ( CaC l2法制备 ),涂于
含氨苄青霉素 ( 50mg /L )的 LB培养平皿 (预先均匀
涂布 16 L 20 mg /mL Xgal和 4 L 200 mg /mL
IPTG)中,于 37 培养过夜。
125 转化子的鉴定、测序 从转化 LB平板上挑
取白色菌斑, 用含有氨苄青霉素 ( 50 mg /mL)的 LB
液体培养基于 37 振荡培养箱培养 6 h, 提取质
粒,用引物 P1、P2进行 PCR鉴定, 限制性内切酶
Xba I和 E coR I进行双酶切鉴定。将鉴定好的阳
性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司
测序。
126 植物表达载体的构建 用 Xba I和 E coR I
从阳性重组质粒 pGM TLgSOS1上切下目的基因,
回收;用 Xba I和 E coR I将 pCAMB IA1390质粒双酶
切后,回收大片段; 将目的基因和酶切后的质粒片段
112
2010年第 9期 马苏勇等:大叶补血草质膜 N a+ /H+逆向转运蛋白基因 SOS1的克隆及对番茄的遗传转化
连接, 形成了含有 LgSOS1全长 cDNA 的 pCAM
B IA1390LgSOS1。重组质粒转化 E. coli DH5, 经
PCR验证, Xba I和 E coR I双酶切鉴定后由上海生
物工程技术服务有限公司测序。
127 农杆菌介导的番茄遗传转化 将重组质粒
通过冻融法转入根癌农杆菌 GV3101菌株, 经 PCR
鉴定出阳性单克隆,在含有庆大霉素 ( 50 mg /L )、卡
那霉素 ( 50mg /L )和利福平 ( 50mg /L )的 LB液体培
养基中于 28 振荡培养 24- 48 h, 然后, 以 1∀100
比例活化至 OD260为 06- 08,采用下胚轴浸染法
转化番茄, 将预培养 2- 3 d的番茄下胚轴浸入备
用农杆菌菌液中 10 m in后, 将下胚轴取出用无菌
滤纸吸去多余菌液, 转到原来的培养基 (与预培养
基相同 )上共 (暗 )培养 2 d。再转移到含有 IAA
( 02 mg /L )、6BA ( 12 mg /L )、carben icillin ( 200
mg /L )和潮霉素 B ( 20 mg /L )的 MS选择培养基上
诱导产生抗性芽,每 2周换一次培养基, 待芽长至
1- 2 cm大小后, 将丛生芽切下, 转移至含有 IAA
( 03mg /L )、carben icillin ( 200 mg /L )和潮霉素 B
( 20 mg /L )的 1 /2 M S生根培养基上诱导生根。转
基因番茄 15 d左右开始有根生成,待根系发达时,
将根系生长良好的植株去除封口膜, 室温环境中
炼苗 7 d左右, 然后用水洗净培养基, 将苗转入装
有基质 (蛭石 ∀腐质土 = 2∀1 )的花盆中, 置于光照
培养箱中培养, 培养条件为 26 , 16 h 40 mo l/
( m
2 s)光照, 70%相对湿度, 注意避光、保湿。
128 转化植株的 PCR检测 采用 SDS法 [ 8 ]分别
从转化植株和非转化植株叶片中小量提取 DNA为
模板, 采用 P1、P2引物进行 PCR扩增, 扩增片段大
小应为 3 455 bp左右。反应程序见 123, PCR扩
增产物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
129 转化植株的 RTPCR检测 取 PCR检测阳
性植株的幼嫩叶片 01 g,采用 Q IAGEN公司的 Tr
izo lR eagent提取叶片总 RNA。反转录和 PCR反应
程序见 123, 其中阴性对照以所提取的未转化植
株的总 RNA为模板, PCR产物用 1. 0%琼脂糖凝胶
电泳检测。
2 结果与分析
21 大叶补血草 SOS1基因的克隆
根据大叶补血草 SOS1基因序列所设计的一对
特异性引物,以大叶补血草总 RNA为模板经反转录
得到 cDNA,经过 PCR扩增得到大小为 3 455 bp的
DNA片段 (图 1)。将 PCR得到的目的条带回收纯
化后与 pGM T载体连接,转化大肠杆菌 DH5,然后
提取质粒,经 PCR和 X ba I、E coR I双酶切鉴定 (图
2),将鉴定好的阳性克隆送至上海生物工程技术服
务有限公司进行测序。将测序结果与原序列进行比
对,二者的相似性达 100%, 表明所克隆的目的基因
序列的正确性。
M.标准 DNA分子量; 1. RTPCR产物
图 1 LgSOS1 cDNA的扩增产物
M.标准 DNA分子量; 1.质粒 pGMTLgSOS1酶切
图 2 质粒 pGMTLgSOS1酶切产物
22 LgSOS1基因植物表达载体的构建
将从重组质粒 pGM TLgSOS1上切下的目的基
因与 pCAMB IA1390载体片段连接, 形成了含有 Lg
SOS1基因全长 cDNA的 pCAMBIA1391LgSOS1。转
化 E. co li DH5后,进行 PCR和 Xba I、E coR I双酶
切验证,结果如图 3、图 4所示, 说明 LgSOS1基因的
植物表达载体构建成功。随后将 pCAMB IA1390Lg
SOS1质粒转入农杆菌 GV3101中。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
M. DNA分子量标准; 1. LgSOS1 PCR扩增
图 3 重组子 pCAMBIA1390LgSOS1 PCR扩增
M. DNA分子量标准; 1. pCAM BIA1390LgSOS1酶切
图 4 pCAMBIA1390LgSOS1酶切鉴定
23 转化番茄的 PCR检测
提取转化番茄总 DNA, 以未转化番茄总 DNA
为阴性对照,用引物 P1、P2进行 PCR扩增,转入外
源 LgSOS1基因的转基因植株应从其 DNA扩增出
3 455 bp片段。在检测的 52株再生植株中,其中 31
株为 PCR阳性 (图 5), 即转基因植株占再生植株
的 596%。
24 转化番茄的 RTPCR检测
RTPCR反应检测部分 PCR阳性植株中 Lg
SOS1基因的表达状况, RTPCR产物电泳检测结
果 (图 6)显示, 监测的部分转化植株中能够扩增
出预期的 3 455 bp目的条带。这一结果说明目的
基因 LgSOS1可以在所检测的转化植株中正常的
转录。
M. DNA分子量标准; 1- 3.转基因番茄; 4.非转基因番茄
图 5 转基因番茄 LgSOS1基因的 PCR鉴定
M. DNA分子量标准; 1, 2.转基因番茄; 3.阳性对照; 4.阴性对照
图 6 转基因番茄 LgSOS1基因的 RTPCR鉴定
3 讨论
利用基因转化来提高植物抗盐性, 是可行的耐
盐基因工程策略。目前只发现少数海洋藻类和真盐
生植物质膜上具有 N a+ ATPase[ 9]能将 Na+外排出
细胞。酵母细胞质膜上 Na+ 的外排作用主要与
Na
+
/H
+逆向转运蛋白 SOD2有关 [ 10] , 一些高等植
物质膜上的 Na+ /H +逆向转运活性也与 N a+的外排
有关。因此质膜上 N a+ /H +逆向转运蛋白和 N a+
ATPase的分子生物学研究应当是通过转基因措施
培育抗盐作物品种的另一思路。继 B lumwa ld等转
A tNHX1基因的油菜和番茄成为第一批具有实用价
值的耐盐农作物后 [ 11, 12] , N a+ /H+ 逆向转运蛋白成
为人们关注的热点,毋庸置疑, Na+ /H +逆向转运蛋
白在耐盐中起到重要作用。
前人过量表达质膜 N a+ /H +逆向转运蛋白试验
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2010年第 9期 马苏勇等:大叶补血草质膜 N a+ /H+逆向转运蛋白基因 SOS1的克隆及对番茄的遗传转化
表明, N a+ /H +逆向转运蛋白对 N a+的外排, 维持胞
质内的低 Na+浓度水平, 对植物在盐渍环境中的生
长起着非常重要的作用。W aditee等 [ 13]从耐盐的藻
青菌中克隆的 N a+ /H +逆向转运蛋白基因 ( ApN
haP)在淡水生长的藻青菌中过量表达发现, 表达
ApNhaP基因的淡水藻可以在含 05 mo l/L N aC l的
培养液中正常生长。 Sh i等 [ 7]将拟南芥质膜 Na+ /
H
+逆向转运蛋白基因 SOS1转入拟南芥中, 使其过
量表达,结果发现明显减少了盐胁迫下的植株木质
部蒸腾流中的 N a+ ,转基因植株的耐盐性明显提高。
王姝杰等 [ 14]将蓝藻质膜 Na+ /H +逆向转运蛋白基
因 Nhap转入烟草, F1代转基因烟草的耐盐性得到
了显著的提高。同时发现 SOS1在 Na+的长途运输
中 (从根到茎叶 )起关键作用: 当盐胁迫比较严重
时, SOS1会将韧皮部中的盐分吸收到细胞中,而轻
度胁迫时 SOS1则将 Na+排到韧皮部中 [ 15]。
大叶补血草为典型的泌盐盐生植物, 其茎、叶表
面富含盐腺,在盐渍环境下能分泌出富含盐分的晶
体,自然条件下, 在形成盐壳的重盐碱地上仍可见到
该种分布,对盐渍环境有较强的适应性。为了探讨
植物的耐盐机理,培育出能在盐渍土壤中生存的农
作物新品种,本研究通过 RTPCR方法, 从大叶补血
草中克隆了质膜型 Na+ /H +逆向转运蛋白基因 Lg
SOS1,并首次将其转入番茄中, 经 PCR、RTPCR鉴
定,初步得到转 LgSOS1基因的番茄植株。该研究
对于深入了解该类基因与植物的耐盐能力之间的关
系具有重要意义。后续研究将对转基因番茄的耐盐
性进行鉴定,以期得到耐盐性明显提高的番茄植株,
为将大叶补血草作为一种种质资源应用于植物耐盐
基因工程提供一定的参考。
参 考 文 献
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