全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1353 - 1358
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 03 - 25; 修回日期 : 2009 - 07 - 20
基金项目 : 国家转基因专项项目 (2008ZX080052004) ; 石河子大学自然科学与技术创新项目 ( ZRKX2008034)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: caolianpu@1261com; Tel: 099322058605)
大叶补血草 Na + /H+ 逆向转运蛋白基因 ( SOS1 )
的克隆与序列分析
周玲玲 1 , 祝建波 1 , 曹连莆 23
(1石河子大学生命科学学院 , 农业生物技术重点实验室 , 新疆石河子 832000; 2石河子大学农学院 , 新疆石河子
832000)
摘 　要 : 用 RT2PCR及 RACE方法从盐生植物大叶补血草 L im onium gm elin ii (W illd. ) Kuntze中分离出
Na + /H +逆向转运蛋白基因的 cDNA (LgSOS1 , GenBank登录号 EU780458) , LgSOS1的 cDNA全长为 3 910
bp, 5′非翻译区为 79 bp, 3′非翻译区为 376 bp, 开放阅读框为 3 455 bp, 编码 1 151个氨基酸 , 推测分子量
为 126 kD。氨基酸同源性分析表明 , LgSOS1与冰叶午时花、沙拐枣、番茄、盐芥和拟南芥质膜型 Na + /H +
逆向转运蛋白的一致性分别为 69102% , 64142% , 61196% , 60112%和 59162%。预测分析表明 , LgSOS1
有 12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白与质膜型的 Na + /H +逆向转运蛋白的亲缘关系较近 , 与液
泡型的 Na + /H +逆向转运蛋白亲缘关系较远。
关键词 : 大叶补血草 ; 质膜型 Na + /H +逆向转运蛋白基因 (SOS1) ; cDNA克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921353206
C lon ing and Sequence Ana lysis of a Na + /H + An tiporter Gene in Ha lophyte
L im on ium gm elin ii
ZHOU L ing2ling1 , ZHU J ian2bo1 , and CAO L ian2pu23
( 1 Key Laboratory of A griculture B iolog ica l Technology of College of L ife2science, Shihezi U niversity, Sh ihezi, X in jiang 832000,
Ch ina; 2 College of A gricu lture, Shihezi U niversity, Sh ihezi, X in jiang 832000, Ch ina)
Abstract: A p lasma membrane Na+ /H + antiporter gene ( L gSOS1 , GenBank accession No.
EU780458) has been separated from halophyte L im onium gm elin ii by RT2PCR and RACE. The L gSOS1
cDNA is 3 910 bp long including 5′untranslated region of 79 bp, 3′untranslated region of 376 bp with Poly
A , and an open reading frame of 3 455 bp encoding a p rotein of 1 151 am ino acidswith a p redicted molecular
mass of 126 kD. By multip le sequence alignment analysis of am ino acids, it has been shown that the identities
in am ino acids to p lasma membrane Na+ /H + antiporters gene of LgSOS1 is 69102% , and 64142% ,
61196% , 60112% , and 59162% of M esem bryan them um crysta llinum , Popu lus euphra tica, L ycopersicon es2
cu len tum , Thellung iella ha loph ila and A rabidopsis tha liana, respectively. TMp red p rediction showed LgSOS1
has 12 transmembrane domains. Phylogenetic analysis indicates that LgSOS1 is more related to p lasma mem2
brane2type Na+ /H + antiporter, compared with vacuolar2type Na+ /H + antiporter, to which it is less related.
Key words: L im onium gm elin ii ( W illd. ) Kuntze; p lasma membrane Na+ /H + antiporter gene
(SOS1 ) ; cDNA cloning; sequence analysis
盐胁迫是影响植物生长发育 , 降低农作物产量的主要逆境因素之一。为了抵御盐分的胁迫 , 植物
体形成了一系列的调节适应机制 (Bohnert et al. , 1995) , 主要是通过在细胞质中积累有机溶质 , 离
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子在液泡内区隔化和将过多的钠离子通过质膜向细胞外排放等实现。Na+ /H +逆向转运蛋白是一种
Na+的逆向转运体 , 在细胞质膜和液泡膜上均有分布 , 可将细胞质中的 Na+逆着 Na+浓度梯度送到液
泡中区隔化集中 , 也可将细胞质中的 Na+逆向运送到胞外高 Na+环境中 , 从而减少了钠离子对细胞质
中细胞器的毒害 , 因此 , Na+ /H +逆向转运蛋白在植物抵御盐胁迫中起重要作用 (Barkla & Pantoja,
1996; 陈观平 等 , 2006)。
高等植物的排 Na+机制主要与质膜 Na+ /H +逆向转运蛋白有关。植物中 Na+ /H +逆向转运蛋白活
性是在大麦质膜上首次发现 (Ratner & Jacoby, 1976) , 此后在液泡膜上也有研究报道 , 目前已经在
大量的盐生植物、非盐生植物和藻类中发现 Na+ /H +逆向转运蛋白活性 (B lumwald et al. , 2000; 任
仲海 等 , 2002)。Shi等 (2000) 从拟南芥中克隆到 SOS1基因 ( SaltOverly SensitiveΙ) , 拟南芥 SOS1
突变体对盐超敏感 , 表明 SOS1在植物耐盐机制中起重要作用。Shi等克隆拟南芥 SOS1基因后 , 在拟
南芥中做了过量表达 , 转基因植株的耐盐性显著提高。
目前大多数 Na+ /H +逆向转运蛋白基因是从具有低逆向运输活性的甜土植物中分离的 , 但前人的
研究表明盐生植物普遍具有在液泡中高效区隔化 Na+的机制 ( Gaxiola et al. , 1999)。大叶补血草
(L im onium gm elin ii) 是一种优良的盐生牧草 , 在新疆北部戈壁荒滩、盐土及盐渍化荒地上成片分布。
为了探讨植物的耐盐机理 , 培育出能在盐渍土壤中生存的农作物新品种 , 作者首次从大叶补血草中克
隆了质膜型 Na+ /H +逆向转运蛋白基因 , 并与其他植物进行了比较分析 , 对于了解不同植物 Na+ /H +
逆向转运蛋白基因在结构与功能上的差异 , 深入了解该类基因与植物的耐盐能力之间的关系具有重要
意义 , 并为将其用于遗传转化 , 提高作物耐盐性奠定理论基础。
1　材料与方法
111　材料
大叶补血草种子采自新疆石河子市北湖公园附近的盐渍化荒地 , 经灭菌后在 1 /2MS培养基中萌
发 , 长成幼苗 , 采集叶片作为试验材料。
大肠杆菌 ( Escherich ia coli) DH5α菌株为本实验室保藏菌种。pGM 2T测序载体、5′2Full RACE kit
和 3′2Full RACE kit购自 TaKaRa公司 , RNA p lant提取试剂、 PCR产物回收试剂盒、DNA marker、
EcoR1等限制性内切酶、Taq酶购自天根公司 , PCR引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有
限公司完成 , 其它试剂均为分析纯。
112　方法
将 200 mmol·L - 1的 NaCl水溶液倒入大叶补血草无菌苗的培养基中 , 胁迫幼苗 12 h。取其幼叶 ,
按照 RNA Plant (Q IAGEN ) 提取试剂上的操作说明提取总的 RNA。
根据 GenBank 中已发表的植物 SOS1 基因氨基酸序列的保守区 , 设计 1 对简并引物。 P1:
GGGCGAGTCCCTGATGAAYGAYGG和 P2: TCGTCCAGCATCTCCCAGTANGYNGCYTG。经 RT2PCR 扩
增出 L gSOS1的保守片段。将扩增的保守片段 cDNA插入到 PGM 2T载体上 , DNA序列测定由上海生工
生物工程技术服务有限公司完成。
采用 cDNA末端快速扩增法 ( rap id anp lification of cDNA ends, RACE) , 3′RACE用 3′2Full RACE
kit。3′RACE 的特异性引物 3P1: CCTTAGAGGCGTTTGGTGAT, 3P2: ATCTGGGACCTGCTGACTGG。
5′RACE采用 5′2Full RACE kit。5′RACE的特异性引物 5P1: TCCACACAACAGATGCTATTCC, 5P2:
CGCCTAAAGCCACTTGAACC。
由于 SOS1基因序列较长 , 通过反转录合成全长 cDNA有一定困难 , 故选择融合 PCR的方法 (李
敏和杨谦 , 2007) 进行该基因开放阅读框的扩增。具体做法包括 3次 PCR反应 , 最后在一个反应体
系中实现 3个片段的融合反应。
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2　结果与分析
211　大叶补血草 Na + /H+逆向转运蛋白全长 cD NA的克隆
使用简并引物 P1和 P21进行 RT2PCR扩增得到一个与预期片段相符约 1 000 bp的 cDNA片段
(图 1)。经测序和 B last比对 , 证实这个 cDNA片段与已克隆的 Na+ /H +逆向转运蛋白基因具有较高
的同源性 , 说明获得的片段是 Na+ /H +逆向转运蛋白基因的片段。根据此片段序列设计特异引物 3P1
和 3P2、5P1和 5P2, 用 RACE技术扩增得到此基因的 3′和 5′cDNA末端序列 (图 2)。
　　测序结果显示 , 3′和 5′端片段的长度分别为
2 366 bp和 782 bp, 它们与中间 1 040 bp cDNA片
段相应末端分别有 155 bp和 125 bp的重叠区 , 将
这 3个片段核苷酸序列进行拼接 , 得到大叶补血
草 SOS1基因的全长 cDNA , 其长度为 3 910 bp。
按 cDNA的序列设计可读框的特异性引物 P3和
P4, 用融合 PCR方法克隆大叶补血草 SOS1 开放
阅读框 ORF (图 3) , 对其测序验证拼接是准确
的。在该序列的 5′端存在 79 bp 的非翻译区
(UTR) , 中间为 3 455 bp的开放阅读框 , 3′端非
翻译区长度为 376 bp, 包括 11 bp的 poly (A ) 尾
巴。将此基因命名为 L gSOS1。该 cDNA 全长在
GenBank中的登陆号为 EU780458。
图 3　L gSOS1 cD NA的扩增产物
M: 标准 DNA 分子量 ; 1: LgSOS1 cDNA 的扩增产物。
F ig. 3　Am plif ica tion of L gSOS1 cD NA
M: DNA marker; 1: PCR amp lification of LgSOS1 cDNA.
212　大叶补血草 Na + /H+逆向转运蛋白氨基酸序列分析
由核苷酸推导的大叶补血草 Na+ /H +逆向转运蛋白含有 1 151个氨基酸 , 推测分子量为 126 kD。
疏水性分析表明 , LgSOS1的 N末端为一疏水结构 , 可能由 11～12个跨膜结构域组成 (图 4)。资料
研究表明 , LgSOS1跨膜区的氨基酸序列与其他植物的 Na+ /H +逆向转运体之间存在很高的相似性。
SOS1的 C末端部分亲水 , 将近 700个氨基酸 , 推测其存在于细胞质中。由于 SOS1具有长的亲水尾 ,
故成为目前最大的 Na+ /H +逆向转运体 (周晓馥和王兴智 , 2002)。
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图 4　L gSO S1的疏水性分布图 (用 TM pred分析 )
F ig. 4　Hydrophob ic ity plot of L gSO S1
将 LgSOS1的氨基酸序列与其他植物的 SOS1的氨基酸序列进行同源性比较。结果表明 , 它与冰
叶午时花 (M esem bryan them um crysta llinum )、沙拐枣 ( Popu lus euph ra tica)、番茄 (L ycopersicon escu len2
tum )、盐芥 ( Thellung iella ha loph ila )、拟南芥 (A rabidopsis tha liana) 和小麦 ( Triticum aestivum ) 的
Na+ /H +逆向转运蛋白具有较高的同源性 , 分别为 69102% , 64142% , 61196% , 60112% , 59162% ,
58135% (表 1)。
表 1　L gSO S1与几种植物的 Na + /H +逆向转运蛋白同源性比较
Table 1　S im ility com par ison of L gSO S1 to var ious Na + /H + an tiport genes
基因
Gene
来源
Source
登录号
Accession No.
同源性 / %
Sim ility
M cSOS1 冰叶午时花 M esem bryanthem um crystallinum EF207776 69102
PeSOS1 沙拐枣 Populus euphratica DQ517530 64142
LeSOS1 番茄 Lycopersicon esculen tum AJ717346 61196
ThSOS1 盐芥 Thellungiella halophila EF207775 60112
A tSOS1 拟南芥 A rabidopsis tha liana NM_126259 59162
O sSOS1 水稻 O ryza sativa AY785147 59161
TaSOS1 小麦 Triticum aestivum AY326952 58135
P tSOS1 碱茅 Puccinellia tenuiflora EF440291 57162
LpSOS1 黑麦草 Lolium perenne AY987046 54174
为了分析不同 Na+ /H + 逆向转运蛋白之间的遗传关系 , 进行了系统发育分析。由图 5可知 ,
LgSOS1与质膜型的 Na+ /H +逆向转运蛋白的亲缘关系较近 , 如冰叶午时花 McSOS1、沙拐枣 PeSOS1、
番茄 LeSOS1、水稻 (O ryza sa tiva) O sSOS1等。LgSOS1与液泡型的 Na+ /H +逆向转运蛋白亲缘关系较
远 , 如拟南芥 A tNHX1、北滨藜 (A triplex gm elin i) AgNHX1、盐角草 (Sa licorn ia europaea) SeNHX1和
番茄 (L ycopersicon escu len tum ) LeNHX1等。这些结果表明 , L gSOS1是质膜型的 Na+ /H +逆向转运蛋
白基因。
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　9期 周玲玲等 : 大叶补血草 Na + /H +逆向转运蛋白基因 (SOS1) 的克隆与序列分析 　
图 5　L gSO S1与其他代表植物的 Na + /H +逆向转运体的系统发育分析
F ig. 5　Phylogenetic ana lysis of L gSO S1 and other represen ta tive Na + /H + an tiporters
3　讨论
本试验中以 RT2PCR及 RACE方法从耐盐植物大叶补血草中分离了具有完整编码区的质膜型
Na+ /H +逆向转运蛋白基因的 cDNA。生物信息学分析表明 , 其氨基酸序列与高等植物中已知序列质
膜型 Na+ /H +逆向转运蛋白 ( SOS1) 的同源性较高 , 而与液泡型的 Na+ /H +逆向转运蛋白亲缘关系
较远。蛋白序列预测分析表明含有 11～12个跨膜区域 , 与已报道的动、植物和微生物的 Na+ /H +逆
向转运蛋白的跨膜区域数 (10～12) 一致 , 但没有发现氨氯吡嗪咪 (Na+通道阻断物 ) 结合位点。
LgSOS1的跨膜区氨基酸序列与其他植物的 Na+ /H +逆向转运蛋白之间存在很高的相似性 , 表明跨膜
区是高度保守的。C端有一个较长的亲水区域 , 将近有 700个氨基酸组成 , 面向细胞质 , 这样就有更
多机会跟那些调控逆向转运蛋白活性的诸多蛋白相互作用 , 以此达到调节 Na+ /H +运输 , 适应盐环境
的目的 ( Zhu, 2000)。
过量表达质膜 Na+ /H +逆向转运蛋白试验表明 , Na+ /H +逆向转运蛋白对 Na+的外排 , 维持胞质
内的低 Na+浓度水平 , 对植物在盐渍环境中的生长起着非常重要的作用。Shi等 (2003)用 CaMV35S
启动子驱动拟南芥质膜 Na+ /H +逆向转运蛋白 SOS1基因 , 并使它在拟南芥中过量表达 , 发现它显著
提高了拟南芥的耐盐性。与对照相比 , 转基因植物生长状况良好 , 且只在木质部和芽中积累少量的
Na+ 。W aditee等 (2002) 从耐盐的藻青菌中克隆的 Na+ /H +逆向转运蛋白基因 (A pN haP) 在淡水生
长的藻青菌中过量表达发现 , 表达 A pN haP的淡水藻可以在含 015 mol·L - 1 NaCl的培养液中正常生
长。这表明了 Na+外排在植物耐盐性中有重要作用。同时发现 SOS1在 Na+的长途运输中 (从根到茎
叶 ) 起关键作用 , 当盐胁迫比较严重时 , SOS1会将韧皮部中的盐分吸收到细胞中 , 而轻度胁迫时
SOS1则将 Na+排到韧皮部中 ( Shi et al. , 2002)。
利用基因转化来提高植物抗盐性 , 是可行的耐盐基因工程策略。目前只发现少数海洋藻类和真盐
生植物质膜上具有 Na+ 2ATPase (D ibrov & Fliegel, 1998) 能将 Na+外排出细胞。酵母细胞质膜上
Na+的外排作用主要与 Na+ /H +逆向转运蛋白 SOD2有关 , 一些高等植物质膜上的 Na+ /H +逆向转运
活性也与 Na+的外排有关。因此质膜上 Na+ /H +逆向转运蛋白和 Na+ 2ATPase的分子生物学研究应当
是通过转基因措施培育抗盐作物品种的另一思路。继 B lumwald等转 A tN HX1基因的油菜和番茄成为第
一批具有实用价值的耐盐农作物后 (Ap se et al. , 1999; Zhang & B lumwald, 2001) , Na+ /H +逆向转
运蛋白成为人们关注的热点 , 毋庸置疑 , Na+ /H +逆向转运蛋白在耐盐中起到重要作用。克隆和分析
鉴定这些耐盐基因对我们理解植物耐盐机制是必不可少的 , 同时 , 进一步研究其功能特征及其信号传
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导的调节途径 , 对植物耐盐基因工程起着重要的指导作用。
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