全 文 ：书草地早熟禾新格莱德胚性愈伤组织原生质体
培养及植株再生的研究
赵小强１，２，３，马晖玲１，２，３，林栋１，２，３，周万海１，２，３，吴翔１，２，３
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；
３．中－美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：以草地早熟禾品种———新格莱德成熟种子为供试材料，在含３．０ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸（２，４Ｄ）、０．５ｍｇ／Ｌ
６苄氨基嘌呤（６ＢＡ）的 ＭＢ５ 培养基中进行胚性愈伤组织诱导的培养。并从生长了７～９个月的胚性愈伤组织中
分离出原生质体，将该原生质体置于ＫＭ８Ｐ培养基（含３．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、１００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白、
１００ｍｇ／Ｌ水解乳蛋白、１％蔗糖、０．４ｍｏｌ／Ｌ甘露醇）中进行了液体浅层培养。结果表明，新格莱德原生质体在上述
ＫＭ８Ｐ培养基中培养３ｄ后出现第１次细胞分裂，２～３周后形成小细胞团，此时添加低渗培养液２～３次，小细胞
团持续分裂并形成愈伤组织。当愈伤组织块长至３～５ｍｍ时，转入固体培养基ＭＳ＋３．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ
６ＢＡ和 ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ萘乙酸（ＮＡＡ）＋５．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ上进行培养，使其细胞增殖和分化，且逐步形成完整的植
株。
关键词：草地早熟禾；新格莱德；原生质体培养；植株再生
中图分类号：Ｓ５４１＋．９；Ｑ９４５．３９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０２００５５０６
草地早熟禾（犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊）为北方主要的冷季型草坪草。其品种新格莱德因具有株体低矮、持绿期长；生活
力强、经久耐用、极耐践踏；耐低修剪；极耐寒、抗旱性超群；抗病虫力突出等特点而被广泛应用于草坪绿地的建
植。以新格莱德作为一种优良的亲本材料，通过以原生质体培养为基础的细胞融合技术来改良草地早熟禾其他
常见栽培品种的性状特性，获得杂种优势后代，达到草地早熟禾优良品种选育的目的。迄今为止，细胞融合技术
已成为改良植物性状的重要手段，而从原生质体获得再生植株是进行细胞融合的先决条件［１］。Ｖａｎｄｅｒ等［１］建立
了草地早熟禾的原生质体悬浮培养体系，获得了白化苗；随后Ｋｉｒｓｔｅｎ等［２］也建立了草地早熟禾品种“Ｇｅｒｏｎｉｍｏ”
的悬浮培养体系，并以此悬浮细胞体系为材料获得原生质体和再生植株。
本研究从草地早熟禾品种－新格莱德成熟种子中诱导出愈伤组织，并经多次继代培养产生松软的胚性愈伤
组织，再从中游离出原生质体，经原生质体培养，获得再生绿苗。这一研究成果对于进一步进行草地早熟禾体细
胞杂交和外源基因的转化提供了研究基础。
１ 材料与方法
１．１ 愈伤组织的诱导、继代以及胚性愈伤组织的筛选
于２００７年３月至２００８年１１月，选取草地早熟禾品种新格莱德（Ｎｕｇｌａｄｅ）成熟种子，灭菌后接种于含３．０
ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ的 ＭＢ５（ＭＳ大量＋ＭＳ微量＋Ｂ５ 有机＋铁盐＋蔗糖＋琼脂）培养基上诱导愈伤组
织，选淡黄色或鲜黄色的愈伤组织在相同的培养基中进行继代增殖。每１５～２０ｄ继代１次，连续继代１０～１２次
后，大部分大颗粒淡黄色的胚性愈伤组织转变为淡黄色易分散的小颗粒，最终成为稳定的细胞系，然后取此类愈
伤组织，用于原生质体的分离。胚性愈伤组织的诱导和继代培养在黑暗、（２５±１）℃条件下进行。
１．２ 原生质体的分离与其纯化
从在固体培养基上继代培养了７～９个月、更换新鲜培养基培养了８～１０ｄ的新格莱德愈伤组织细胞系中取
１ｇ左右的材料，于１０ｍＬ混合酶解液中分离原生质体。在本研究中设置了４个酶处理组合。
第１９卷 第２期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
５５－６０
２０１０年４月
收稿日期：２００９０２２３；改回日期：２００９０４０１
基金项目：甘肃农业大学草业学院草业科学国家级重点学科学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省部共建重点实验室资助项目（ＣＹ
ＧＧ２００６１０）和甘肃省教育厅项目（０７０２０３）资助。
作者简介：赵小强（１９８５），男，甘肃武山人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗｕｓｈａｎ２００２ｚｘｑ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｍａｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ⅰ：１％纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本Ｊａｐａｎ），１％离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本
Ｊａｐａｎ）；
Ⅱ：１％纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本Ｊａｐａｎ），１％离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本
Ｊａｐａｎ），０．３％崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）；
Ⅲ：１％纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本Ｊａｐａｎ），１％离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本
Ｊａｐａｎ），０．３％崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ（Ｓｉｇｍａ），０．３％果胶酶ＰｅｃｔｏｌａｓｅＹ２３（Ｙａｋｕｌｔ，日本Ｊａｐａｎ）；
Ⅳ：１％纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本Ｊａｐａｎ），１％离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０（Ｙａｋｕｌｔ，日本
Ｊａｐａｎ），０．３％崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ（Ｓｉｇｍａ），０．５％果胶酶ＰｅｃｔｏｌａｓｅＹ２３（Ｙａｋｕｌｔ，日本Ｊａｐａｎ）。
其中酶溶剂（ＣＰＷ１３，ｍｇ／Ｌ）为：ＫＨ２ＰＯ４（２７．２）、ＫＮＯ３（１０１．０）、ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ（１４８０．０）、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
（２４６．０）、ＫＩ（０．１６）、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ（０．０２５）、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ２，（Ｎ吗啡啉）乙基磺酸、１３％甘露醇，ｐＨ５．８。经
０．４５μｍ微孔滤膜过滤灭菌。
在（２６±１）℃黑暗条件下，将愈伤组织加入不同的酶液中静置３０ｍｉｎ，然后在５０ｒ／ｍｉｎ的摇床上震荡，进行
酶解。每隔２ｈ设置１个酶解时间段，并且每２ｈ测定分离出的原生质体产量和活力，以确定适宜的酶解时间。
酶解材料经２００、３００目无菌尼龙网筛过滤，除去没有酶解完全的组织和细胞团，滤液经２５０ｒ／ｍｉｎ离心５～
１０ｍｉｎ收集原生质体。用酶溶剂ＣＰＷ１３（成分同上）悬浮，再离心，这样反复２～３次。最后用原生质体培养液
洗涤２次。
１．３ 原生质体的培养和植株再生
将经洗涤的原生质体重新悬浮于原生质体培养基中，调整密度到２×１０５～５×１０５ 个／ｍＬ。原生质体培养介
质采用常用的ＫＭ８Ｐ［４］基本培养基，含３．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、１００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白、１００ｍｇ／Ｌ水解
乳蛋白、１％蔗糖、０．４ｍｏｌ／Ｌ甘露醇、ｐＨ为５．８。吸取２ｍＬ原生质体悬浮液于直径为６ｃｍ的培养皿中，在（２６
±１）℃，黑暗条件下液体浅层静置培养。在第７和１４天时更换甘露醇浓度依次减半的新鲜的培养基。４周之后
将形成的肉眼可见的小愈伤组织转移到除去甘露醇的培养基进行培养。将长至２ｍｍ左右的小愈伤组织转移至
含３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ的 ＭＢ５ 培养基继续进行培养，然后转移至含０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ、５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ
的 ＭＳ分化培养基上培养。
１．４ 原生质体活性的检测
吸取１滴原生质体悬浮液置于载玻片上，在荧光显微镜下检测其活性。采用荧光素双醋酸酯（ＦＤＡ）进行染
色。ＦＤＡ用丙酮配制成５ｍｇ／ｍＬ溶液，然后按照２５μＬＦＤＡ／ｍＬ进行染色，静置５ｍｉｎ后观察，随机选取３个
视野统计原生质体的数量。
２ 结果与分析
２．１ 胚性愈伤组织的诱导、继代以及胚性愈伤组织的筛选
成熟种子在诱导培养基中培养４周后，即可诱导形成大量的愈伤组织，选取淡黄色或鲜黄色的愈伤组织（图
１１）在相同的培养基中进行继代培养，继代培养时去除水渍状的愈伤组织（图１２）。１５～２０ｄ继代１次，继代１０
～１２次后，愈伤组织外观呈淡黄色或鲜黄色颗粒型，质地较紧密，且用无菌水将其悬浮在倒置显微镜下观察，此
时愈伤组织的细胞大多数为细胞质浓、等径、壁薄、核大、分裂旺盛，最终成为稳定的细胞系（图１３）。试验证明，
从这种愈伤组织能够分离出大量的原生质体。
２．２ 原生质体的游离
２．２．１ 供试材料的选择 选取活力旺盛的胚性愈伤组织是草地早熟禾新格莱德原生质体游离与培养成功的关
键。研究发现，活力旺盛的愈伤组织在酶解时可获得较多且生命力强的原生质体（图１４），且获得的原生质体在
培养过程中且容易分裂，本试验所得的结论与王?之等［３］的结论是一致的。
２．２．２ 适宜的酶液成分的选定 经多次继代的淡黄色胚性愈伤组织细胞系处于旺盛生长期，取此类愈伤组织于
混合酶中游离原生质体。经５０ｒ／ｍｉｎ震荡可得大量的原生质体。在游离原生质体时，不同的酶液组成（表１）以
及酶解时间对原生质体的产量和活力都有很大的影响，经试验得到最佳的酶液组合为：１％纤维素酶Ｃｅｌｕｌａｓｅ
ＯｎｏｚｕｋａＲ１０、１％离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０、０．３％崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ、０．５％果胶酶ＰｅｃｔｏｌａｓｅＹ２３。
６５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
图１ 草地早熟禾新格莱德原生质体培养及其植株再生
犉犻犵．１ 犘狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犻狀犖狌犵犾犪犱犲（犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊）
１：胚性愈伤组织；２：水渍状愈伤组织；３：适合于游离原生质体的松软胚性愈伤组织；４：游离的原生质体；５：有活力的原生质体；６：原生质体再
生细胞的第１次分裂；７：原生质体再生细胞的第２次分裂；８：原生质体再生细胞的第３次分裂；９：原生质体培养７ｄ形成的小细胞团；１０：原生质
体培养３０ｄ后形成的小愈伤组织；１１：原生质体再生的愈伤组织；１２：原生质体再生完整的小植株１：Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉ；２：Ｓｔｉｃｋｙｃａｌｉ；３：Ｆｒｉａｂｌｅ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉｓｕｌｔａｂｌｅｆｏｒｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；４：Ｆｒｅｓｈｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｆｒｏｍｃａｌｉ；５：Ｖｉａｂｌｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；６：Ｆｉｒｓｔｄｉｖｉｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌａｆｔｅｒ３ｄｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；７：Ｓｅｃｏｎｄｄｉｖｉｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌａｆｔｅｒ３ｔｏ５ｄｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；８：Ｔｈｉｒｄｄｉｖｉｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌａｆｔｅｒ
５ｔｏ７ｄｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；９：Ｃｅｌｃｌｕｓｔｅｒｓｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌａｆｔｅｒ７ｄｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；１０：Ｍｉｃｒｏｃａｌｉｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｔ３０ｄｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；
１１：Ｃａｌｉｆｏｒｍｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｍｉｃｒｏｃａｌｉ；１２：Ｐｌａｎｔｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃａｌ
７５第１９卷第２期 草业学报２０１０年
２．２．３ 最佳酶解时间的确定 本研究表明，酶解时间
少于１４ｈ时，原生质体的产量及其活力较低，均少于
酶解１４ｈ时的产量和活力２６．７×１０５ 个／ｇ，７１．２％。
当酶解时间超过１８ｈ时，原生质体的产量为２３．３×
１０５个／ｇ，但是活力下降下降到６８．３％，不利于原生质
体的培养（表２）。酶解时间以１４～１６ｈ为好。
２．２．４ 渗透压的调节 酶和酶解时间是游离原生质
体的主要因素，但酶液中渗透压稳定剂在原生质体的
游离中也起到很关键的作用。在原生质体的分离中，
常加入０．３５～０．８０ｍｏｌ／Ｌ的甘露醇、葡萄糖、蔗糖或
山梨醇来调节酶液的渗透压［４］。本试验在酶液中加入
了０．４０ｍｏｌ／Ｌ甘露醇，有效地提高了原生质体的释放
量和稳定性。
２．２．５ 适宜的继代培养天数确定 在上述酶解条件
下，研究了愈伤组织不同继代培养时间对原生质体分
离效果的影响（图２）。结果表明，继代培养第９天时，
可获得大量的具有活力的原生质体（图１５），并且多
数细胞质较浓，在以后的培养中易于分裂。因此，继代
培养时间定为８～１０ｄ。
２．３ 原生质体的培养和植株再生
２．３．１ 原生质体再生细胞的分裂 原生质体在
ＫＭ８Ｐ基本培养基中培养２～３ｄ后，可观察到原生质
体再生细胞的第１次、第２次和第３次分裂（图１６，１７，
１８）。随后可观察到再生细胞的持续分裂，并形成小
细胞团（图１９）。第９～１０天时，在倒置显微镜可观察
到几十个和上百个细胞的细胞团。培养２周后，原生
质体持续分裂形成约１０个细胞组成的细胞团。４周
后，原生质体产生肉眼可见的小愈伤组织（图１１０）。
２．３．２ 渗透压对原生质体分裂和生长的影响 添加
渗透压减半的新鲜培养基有利于细胞的增殖。从试验
中观察到，在培养过程中，渗透压对草地早熟禾的原生
质体培养的影响很大。原生质体培养到第１周时，此
时添加渗透压不变的新鲜培养基继续培养，１周之后
在倒置显微镜下可以看到细胞的分裂速度很慢，相比
较，在添加渗透压减半的继代培养中原生质体的分裂
现象特别明显；培养到第２～３周时，更换渗透压再次
减半的新鲜培养基，此时可以观察到较多的小细胞团，
且大部分形成小愈伤组织，而渗透压没变的培养皿中
表１ 不同的酶液组成对草地早熟禾新格莱德
原生质体产量和活力的影响
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犲狀狕狔犿犲狊犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狊
狅狀狋犺犲狔犻犲犾犱犪狀犱狏犻犪犫犻犾犻狋狔狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊
犳狉狅犿犖狌犵犾犪犱犲（犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊）
酶液组成
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ｏｆｅｎｚｙｍｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
原生质体产量
Ｙｉｅｌｄｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
（个Ｎｏ．／ｇ
Ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ）
原生质体
活力
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
（％）
Ⅰ １％ 纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０ １．６９×１０５ ４９．６
１％ 离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０
Ⅱ １％ 纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０ ３．８９×１０５ ５７．７
１％ 离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０
０．３％ 崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ
Ⅲ １％ 纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０ ７．９５×１０５ ６４．０
１％ 离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０
０．３％ 崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ
０．３％ 果胶酶ＰｅｃｔｏｌａｓｅＹ２３
Ⅳ １％ 纤维素酶ＣｅｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０ ２．１２×１０６ ７０．５
１％ 离析酶 ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ１０
０．３％ 崩溃酶Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ
０．５％ 果胶酶ＰｅｃｔｏｌａｓｅＹ２３
表２ 不同的酶解时间对草地早熟禾新格莱德
原生质体产量和活力的影响
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋犺犲狋犻犿犲狅犳犲狀狕狔犿犲
犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅狀狋犺犲狔犻犲犾犱犪狀犱狏犻犪犫犻犾犻狋狔狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊
犳狉狅犿犖狌犵犾犪犱犲（犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊）
酶解时间
Ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ（ｈ）
原生质体产量
Ｙｉｅｌｄｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
（个Ｎｏ．／ｇＦｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ）
原生质体活力
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
（％）
２ １．０×１０５ ４９．２
４ ３．２×１０５ ５３．０
６ ５．３×１０５ ５９．０
８ ６．６×１０５ ６２．０
１０ ７．０×１０５ ６４．５
１２ １９．０×１０５ ６９．８
１４ ２６．７×１０５ ７１．２
１６ ２９．６×１０５ ７４．８
１８ ２３．３×１０５ ６８．３
的细胞只是停留在小细胞团的水平，很少形成愈伤组织。试验表明，在原生质体的培养过程中及时地补添低渗的
培养基，可有力于原生质体的培养，这同Ｓｕｎ等［５］、蔡起贵等［６］和王?之等［３］在玉米（犣犲犪犿犪狔狊）和陆地棉（犌狅狊
狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）原生质体培养中所得到的结果是一致的。
８５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
随着原生质体细胞壁的形成和细胞的持续分裂，
图２ 草地早熟禾新格莱德愈伤组织继代时间
对原生质活力的影响
犉犻犵．２ 犈犳犳犲犮狋狅犳犮犪犾狌狊犪犵犲狅狀狋犺犲狏犻犪犫犻犾犻狋狔狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋
犳狉狅犿犖狌犵犾犪犱犲（犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊）犲犿犫狉狔狅犵犲狀犻犮犮犪犾犻
渗透压的浓度需要不断的降低，这样才有利于细胞
的增长。
２．３．３ 植株再生 当原生质体来源的愈伤组织长
至２ｍｍ左右时将其挑出接种到固体培养基上继代
扩增，继代２次后可得胚性较强的愈伤组织（图１
１１）。培养３０ｄ后将其再转移至分化培养基上分化。
３０ｄ后供试的４９块愈伤组织中，有５块分化出了
芽，芽分化率为１０．２％，且进一步生根形成完整的植
株（图１１２）。
３ 讨论
３．１ 供体材料对原生质体培养的影响
有关草坪草原生质体的培养和体细胞杂交的研
究及其进展，在国外已有相关的报道［１，２，７，８１０］。Ｄａｌｔｏｎ［８］从悬浮培养高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）和多年生黑麦
草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）的原生质体中获得了再生植株；Ｗａｎｇ等［９］建立了牛尾草（犉犲狊狋狌犮犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊）的原生质体悬
浮培养体系，产生了可育的绿色小苗；Ｉｎｏｋｕｍａ等［１０］以根尖顶端分生组织为外植体，建立了结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪
狆狅狀犻犮犪）的原生质体植株再生体系。
禾本科植物原生质体培养获得成功的试验，几乎都是用幼胚、成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性悬浮细
胞来游离原生质体，但是建立胚性悬浮细胞途径存在两点不足：一是随培养时间的延长，细胞全能性迅速下降乃
至丧失；二是悬浮培养过程极易使培养物发生大量变异致使难以保证再生出正常可育植株，这样给试验带来很多
不便。Ｋｉｒｓｔｅｎ等［２］成功获得草地早熟禾品种“Ｇｅｒｏｎｉｍｏ”绿苗的关键是建立了愈伤组织胚性细胞悬浮系。本研
究从草地早熟禾成熟种子中诱导出愈伤组织，以继代１０～１２次后的胚性愈伤组织为材料获得了活力较强的原生
质体且进一步进行了培养，成功再生出新植株。
该研究认为，采用活力旺盛的胚性愈伤组织是草地早熟禾新格莱德原生质体再生植株的重要环节。经过多
次继代培养所得的松软淡黄色或鲜黄色的愈伤组织细胞系适宜于原生质体的游离和培养。但是此过程需要较长
时间。因此探讨采用何种措施来缩短继代培养的时间而获得适合于原生质体的游离细胞系是十分必要的。
３．２ 酶液组成、浓度和酶解时间对原生质体分离的影响
酶解液的组成、浓度和酶解时间在原生质体培养中也是一个重要的技术环节。若酶液浓度过高，会导致原生
质体的死亡；若浓度过低，却不利于原生质体的释放。王?之等［３］、姜淑慧等［１１］和王瑛华等［１２］在试验中通过筛选
得到了酶解陆地棉、播娘蒿（犇犲狊犮狌狉犪犻狀犻犪狊狅狆犺犻犪）和霸王（犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿）的最佳酶解组合。酶解时
间太短，游离的原生质体量少且不能满足试验的需求，时间过长又会对原生质体产生伤害［１３］。刘强等［１４］试验发
现采用２％纤维素酶＋０．５％半纤维素酶＋０．５％果胶酶的混合酶酶解１２ｈ可获得高质量的黄芪（犃狊狋狉犪犵犪犾狌狊
犿犲犿犫狉犪狀犪犮犲狌狊）的原生质体。因此，适当的酶液组合在最佳的时间可更有利于原生质体的释放，在本研究中得出
原生质体在１％纤维素酶＋１％离析酶＋０．３％崩溃酶＋０．５％果胶酶酶液组成在１４～１６ｈ可获得产量较高且活
力较强的原生质体。
３．３ 渗透压对原生质体培养的影响
在植物原生质体的培养中，培养基的渗透压一般需要逐步降低。在猕猴桃原生质体培养成功的几例报道
中［１５，１６］，培养基的浓度是逐步降低的。但Ｂｉｎｄｉｎｇ等［１７］在其试验中是一步降低的。本研究采取渗透压逐步降低
的方法获得了较好的效果。此外，渗透调节物质的组合使用可以提高愈伤组织的形成率，本试验中采用甘露醇、
葡萄糖和蔗糖组合来调节渗透压，使细胞维持在高渗状态下，导致质壁分离，利于酶解，并且得到了较多的愈伤组
织，这与何道一和孙山［１８］在苹果（犕犪犾狌狊犱狅犿犲狊狋犻犮犪）单倍体原生质体培养结果相似。
９５第１９卷第２期 草业学报２０１０年
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ＺＨＡＯＸｉａｏｑｉａｎｇ１，２，３，ＭＡＨｕｉｌｉｎｇ１，２，３，ＬＩＮＤｏｎｇ１，２，３，ＺＨＯＵ Ｗａｎｈａｉ１，２，３，ＷＵＸｉａｎｇ１，２，３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ
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犃犫狊狋狉犪犮狋：ＥｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍｍａｔｕｒｅｓｅｅｄｓｏｆＮｕｇｌａｄｅ（犘狅犪犘狉犪狋犲狀狊犻狊）ｏｎＭＢ５ｍｅｄｉｕｍｓｕｐ
ｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ３．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ，０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃａｌｉａｆｔｅｒ
ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒ７－９ｍｏｎｔｈｓ．ＴｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＫＭ８Ｐｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ３．０ｍｇ／Ｌ２，
４Ｄ，０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ，１００ｍｇ／Ｌｃａｓｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，１００ｍｇ／Ｌｌａｃｔａｂｌｕｍｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，１％ （Ｗ／Ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅ
ａｎｄ０．４ｍｏｌ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌ．Ｔｈｅｆｉｒｓｔｄｉｖｉｓｉｏｎｓｈａｐｐｅｎｅｄａｆｔｅｒ３ｄａｙｓａｎｄｓｍａｌｃｅｌｃｌｕｓｔｅｒｓａｐｐｅａｒｅｄａｆｔｅｒ２ｔｏ３
ｗｅｅｋｓｉｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｓｃｏｕｌｄｋｅｅｐｄｉｖｉｄｉｎｇｓｕｓｔａｉｎａｂｌｙａｎｄｆｏｒｍｉｎｇｃａｌｉｂｙ
ａｄｄｉｎｇｆｒｅｓｈｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｌｉｑｕｉｄｓｏｎｃｅｏｒｔｗｉｃｅｔｏｌｏｗｅｒｏｓｍｏｔｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｃａｌｉ，３ｔｏ５
ｍｍｉｎｄｉａｍｅｔｅｒ，ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏｓｏｌｉｄｍｅｄｉｕｍ（ＭＳｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈ３．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ，０．５ｍｇ／Ｌ
６ＢＡｔｈｅｎＭＳｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈ０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ，５．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ）ｔｏｃａｒｒｙｏｕｔｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒｃｅｌ
ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｐｌａｎｔｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊；Ｎｕｇｌａｄｅ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅ；ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
０６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２