全 文 ：书结缕草属植物犛犚犃犘－犘犆犚体系的建立和优化
薛丹丹１，２，郑轶琦２，王志勇２，郭海林２，陈宣２，刘建秀２
（１．南京农业大学园艺学院，江苏 南京２１００９５；２．江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京２１００１４）
摘要：以ＳＤＳ法提取的结缕草属植物叶片ＤＮＡ为模板，分别采用单因子试验和正交设计试验２种方法，对影响结
缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ的 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ聚合酶和模板ＤＮＡ五个因素进行优化试验。单因子试
验分别研究各因素在多水平条件下对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系的影响，得到最佳反应条件。正交设计采用Ｌ１６（４５）
方案，综合考虑各因素间的相互作用，通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据４对引物对６份结
缕草属植物材料扩增结果的验证比较，２种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析２
种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率，最终建立了结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ的最佳
反应体系：Ｍｇ２＋２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ、２
μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ，总体积为２０μＬ。这一优化体系的建立为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、
种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。
关键词：结缕草属植物；ＳＲＡＰ标记；单因子试验；正交设计；体系优化
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０１；Ｑ９４６３３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００８）０６００９３０９
结缕草属（犣狅狔狊犻犪）为禾本科画眉草亚科的多年生草本植物，是一种优良的暖季型草坪草，广泛分布于太平洋
西岸和北岸沿海地区，主要分布于亚洲，在澳洲等温暖地区亦有分布。目前一般认为结缕草属植物分为１１个种
和若干变种、变形。我国有５种，２变种，１变型，５种分别为大穗结缕草（犣．犿犪犮狉狅狊狋犪犮犺狔犪）、中华结缕草（犣．狊犻狀犻
犮犪）、日本结缕草（犣．犼犪狆狅狀犻犮犪）、沟叶结缕草（犣．犿犪狋狉犲犾犾犪）、细叶结缕草（犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪），２变种为长花结缕草（犣．
狊犻狀犻犮犪ｖａｒ．ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）和青结缕草（犣．犼犪狆狅狀犻犮犪ｖａｒ．ｐｏｌｉｄａ），１变型为大穗日本结缕草（犣．犼犪狆狅狀犻犮犪ｆ．ｍａｃ
ｒｏｓｔａｃｈｙａ）［１，２］。结缕草属植物具有发达的地下茎和匍匐茎，耐旱、耐寒、耐盐碱，病虫害较少，弹性和耐磨性较
强，是国内外公认的典型的环保型草坪草，可广泛应用于观赏草坪、休憩草坪、运动草坪以及保土草坪上。
近年来随着分子生物学和生化技术的不断发展，分子标记技术在草坪草研究中的应用也越来越广泛。在结
缕草属植物的研究中，ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，限制片段长度多态性）［３］、ＲＡＰＤ（ｒａｎ
ｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ）［４～７］、ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＤＮＡ简单序列重
复）［８，９］、ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，扩增片段长度多态性）［１０～１２］、ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，简单序列重复区间扩增）［１３，１４］标记在亲缘关系鉴定［４］、遗传分析［５～７，１２，１４］、指纹图谱［８，１３］及遗传
连锁图谱［３，９～１１］、体系优化［１５］等应用中均有报道。这些标记虽使草坪草分子标记技术得到了突飞猛进的发展，但
各有优缺点。一种基于ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，聚合酶链式反应）的新型分子标记技术———ＳＲＡＰ（ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，相关序列扩增多态性）标记［１６］的发明和应用弥补了以上分子标记的不足
且具备了它们的优点。ＳＲＡＰ标记是根据基因外显子中丰富的ＧＣ（鸟嘌呤、胞嘧啶）含量和内含子、启动子中丰
富的ＴＡ（腺嘌呤、胸腺嘧啶）含量的特点，利用独特的引物设计对ＯＲＦｓ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，开放阅读框架）进
行扩增，因不同个体间的外显子、内含子和启动子的不同而产生多态性。ＳＲＡＰ标记简单、稳定可靠、重复性好、
多态性高、在基因组中分布均匀、引物非特异性等优点使其在多种植物中得到广泛的应用，目前已在水稻（犗狉狔狕犪
狊犪狋犻狏犪）［１７］、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［１８］、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［１９］、甘薯（犇犻狅狊犮狅狉犲犪犲狊犮狌犾犲狀狋犪）［２０］、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿
第１７卷 第６期
Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
９３－１０１
１２／２００８
收稿日期：２００７１２２４；改回日期：２００８０３０７
基金项目：江苏省科技攻关项目（ＢＥ２００６３３９），国家自然科学基金项目（３０５７１３０７）和江苏省高技术项目（ＢＧ２００６３２０）资助。
作者简介：薛丹丹（１９８２），女，河南济源人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙｚ１２９＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
犺犻狉狊狌狋狌犿）［２１］、油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）［２２］、黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）［２３］、野牛草（犅狌犮犺犾狅犲犱犪犮狋狔犾狅犻犱犲狊）［２４，２５］等植
物中使用，主要应用遗传多样性、指纹图谱、纯度鉴定、资源亲缘关系分析、连锁图谱构建、基因定位、比较基因组
学研究等领域。目前在草坪草的研究中，ＳＲＡＰ分子标记技术应用的相关报道甚少。
ＰＣＲ反应体系优化的方法主要有单因子试验和正交设计试验。单因子试验是通过研究ＰＣＲ反应中的各影
响因素的影响情况，获得各自的最适条件，通过各因素的组合建立ＰＣＲ的最佳反应体系。目前，该方法已普遍应
用于不同标记的ＰＣＲ体系优化。正交设计试验是由何正文等［２６］最先提出用于ＰＣＲ体系优化中的，该方法综合
考虑ＰＣＲ反应体系中各因素的相互作用，并可以快速找到最佳的反应条件，获得满意的优化体系并且可以缩短
试验时间和成本。目前，这２种方法同时在ＰＣＲ体系优化中的应用较少，仅在紫椴（犜犻犾犻犪犪犿狌狉犲狀狊犻）［２７］的ＩＳＳＲ
－ＰＣＲ优化中有相关报道，而在ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系中尚未见到相关文章。
本研究首次利用单因子试验和正交设计２种方法对结缕草属植物ＳＲＡＰ体系中的 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物浓度、
Ｔａｑ酶及模板ＤＮＡ浓度进行优化，试图建立起一个能够稳定扩增、条带清晰、多态性高的体系，并通过比较２种
优化方法，以期筛选出较为理想的优化体系，从而建立结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ的最佳反应体系，为以后ＰＣＲ
反应体系的优化提供一定的参考。同时，该研究也将为ＳＲＡＰ标记在进行结缕草属植物种源鉴定、遗传多样性、
指纹图谱、连锁图谱及基因定位等方面的研究提供较为可靠的技术支持。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
试验材料为结缕草属植物结缕草、中华结缕草、沟叶结缕草的３个种５份种源和１份杂交后代（表１），均取
自江苏省中国科学院植物研究所草业中心种质资源圃（北纬３２°０２′，东经１１８°２８′，海拔３０～４０ｍ）。其中Ｚ３１３
用于体系优化，其他材料用作体系验证。
表１ 试验材料的名称和来源
犜犪犫犾犲１ 犖犪犿犲狊犪狀犱狊狅狌狉犮犲狊狅犳犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犿犪狋犲狉犻犪犾狊
编号Ｃｏｄｅ 种名Ｓｐｅｃｉｅｓ 来源Ｓｏｕｒｃｅｓ 北纬Ｌａｔｉｔｕｄｅ 东经Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
Ｚ０２２ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 山东胶州湾Ｊｉａｏｚｈｏｕｗａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ ３６°２６′ １２０°００′
Ｚ０６８ 中华结缕草犣．狊犻狀犻犮犪 安徽南陵Ｎａｎｌｉｎｇ，Ａｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅ ３０°５４′ １１８°１０′
Ｚ１０５ 中华结缕草犣．狊犻狀犻犮犪 山东烟台Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ ３７°３０′ １２１°２４′
Ｚ１１９ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 江苏响水 Ｘｉａｎｇｓｈｕｉ，Ｊｉａｎｇｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅ ３４°１２′ １１９°３４′
Ｚ１２３ 沟叶结缕草犣．犿犪狋狉犲犾犾犪 美国引进 Ａｍｅｒｉｃａ － －
Ｚ３１３ 日本结缕草×细叶结缕草
犣．犼犪狆狅狀犻犮犪×犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪
日本结缕草（江西）和细叶结缕草（南京）的杂交后代
Ｈｙｂｒｉｄｏｆ犣．犼犪狆狅狀犻犮犪（Ｊｉａｎｇｘｉ）ａｎｄ犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪（Ｎａｎｊｉｎｇ）
－ －
１．２ 试验方法
１．２．１ 基因组ＤＮＡ的提取和检测 材料ＤＮＡ的提取采用ＳＤＳ法（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，十二烷基磺酸钠），
并稍做修改。采用０．８％琼脂糖凝胶电泳检测基因组ＤＮＡ的质量和浓度（电泳仪为ＤＹＣＰ３４型，电泳槽为
ＤＹＹ５型）。电泳结束后，在自动凝胶图像分析仪（上海培清科技有限公司ＪＳ３８０）上观测，确定ＤＮＡ浓度并拍
照。最后将样品ＤＮＡ浓度稀释到５０ｎｇ／μＬ并于－２０℃保存。
１．２．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ单因子试验 对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系中的５个因素分别进行多水平的优化，其中 Ｍｇ２＋有１０
个水平梯度、ｄＮＴＰ和ＤＮＡ有９个浓度梯度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶和引物２因素在８个水平上筛选，方案如表２。
ＳＲＡＰ引物购自上海博亚生物技术有限公司，ｄＮＴＰ和ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自南京申能博彩公司，ＤＮＡｍａｒｋｅｒ
购自南京ＴａＫａＲａ公司。
１．２．３ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系正交设计 采用Ｌ１６（４５）正交试验设计，对Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、
ＤＮＡ进行５因素４水平筛选，方案如表３和４。
４９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
表２ 犛犚犃犘－犘犆犚体系单因子试验
犜犪犫犾犲２ 犛犻狀犵犾犲犳犪犮狋狅狉狋犲狊狋狅犳犛犚犃犘－犘犆犚狊狔狊狋犲犿
因素Ｆａｃｔｏｒｓ 水平Ｌｅｖｅｌｓ
Ｍｇ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．２５ ０．５０ ０．７５ １．００ １．２５ １．５０ １．７５ ２．００ ２．５０ ３．００
引物Ｐｒｉｍｅｒ（μｍｏｌ／Ｌ） ０．０５ ０．１０ ０．１５ ０．２０ ０．２５ ０．３０ ０．３５ ０．４０
ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ）
０．２５ ０．５０ ０．７５ １．００ １．２５ １．５０ １．７５ ２．００
ｄＮＴＰ（μｍｏｌ／Ｌ） １５０ １８０ ２００ ２２０ ２４０ ２６０ ２８０ ３００ ３２０
ＤＮＡ（ｎｇ） １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０
表３ 犛犚犃犘－犘犆犚体系的因素－水平
犜犪犫犾犲３ 犉犪犮狋狅狉狊犪狀犱犾犲狏犲犾狊狅犳犛犚犃犘－犘犆犚狊狔狊狋犲犿
水平
Ｌｅｖｅｌｓ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ
Ｍｇ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ） ｄＮＴＰ（μｍｏｌ／Ｌ） 引物Ｐｒｉｍｅｒ（μｍｏｌ／Ｌ） ＴａｑＤＮＡ聚合酶 ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ） ＤＮＡ（ｎｇ）
１ １．２５ ２００ ０．１０ ０．５０ ３０
２ １．５０ ２２０ ０．１５ ０．７５ ４０
３ １．７５ ２４０ ０．２０ １．００ ５０
４ ２．００ ２６０ ０．２５ １．５０ ６０
表４ 犛犚犃犘－犘犆犚［犔１６（４５）］正交试验设计
犜犪犫犾犲４ ［犔１６（４５）］犗狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犳狅狉犛犚犃犘－犘犆犚
编号
Ｎｏｔｅ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ
Ｍｇ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ） ｄＮＴＰ（μｍｏｌ／Ｌ） 引物Ｐｒｉｍｅｒ（μｍｏｌ／Ｌ） ＴａｑＤＮＡ聚合酶 ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ） ＤＮＡ（ｎｇ）
１ １．２５ ２００ ０．１０ ０．５０ ３０
２ １．２５ ２２０ ０．１５ ０．７５ ４０
３ １．２５ ２４０ ０．２０ １．００ ５０
４ １．２５ ２６０ ０．２５ １．５０ ６０
５ １．５０ ２００ ０．１５ １．００ ６０
６ １．５０ ２２０ ０．１０ １．５０ ５０
７ １．５０ ２４０ ０．２５ ０．５０ ４０
８ １．５０ ２６０ ０．２０ ０．７５ ３０
９ １．７５ ２００ ０．２０ １．５０ ４０
１０ １．７５ ２２０ ０．２５ １．００ ３０
１１ １．７５ ２４０ ０．１０ ０．７５ ６０
１２ １．７５ ２６０ ０．１５ ０．５０ ５０
１３ ２．００ ２００ ０．２５ ０．７５ ５０
１４ ２．００ ２２０ ０．２０ ０．５０ ６０
１５ ２．００ ２４０ ０．１５ １．５０ ３０
１６ ２．００ ２６０ ０．１０ １．００ ４０
１．２．４ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增程序及扩增产物的检测 ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１
ｍｉｎ，３７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，３５个循环；循环
结束后，７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。扩增反应在英国ＴＥＣＨＮＥ公司的ＴＣ４１２型ＰＣＲ仪上进行。
５９第１７卷第６期 草业学报２００８年
扩增结束后，在扩增产物中加入２μＬ６×ｌｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ缓冲液混匀，上样于１０％的聚丙烯酰胺凝胶进行分
离（电泳仪为ＤＹＹ８Ｂ型，电泳槽为ＪＹＳＣＺ６型），电泳结束后快速银染检测。
１．２．５ ＳＲＡＰ引物组合的筛选 在体系优化前，先用 Ｍｇ２＋１．５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２８５μｍｏｌ／Ｌ、引物０．１５
μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ酶１．０Ｕ、ＤＮＡ５０ｎｇ体系进行引物的初步筛选，用于筛选的模板ＤＮＡ为Ｚ３１３和Ｚ１２３。引
物为５条正向引物和１０条反向引物，共组合成５０对ＳＲＡＰ引物，其序列见表５。筛选出较好的引物组合之一
Ｍｅ５＋Ｅｍ７用于体系优化。
２ 结果与分析
２．１ 参试材料基因组ＤＮＡ的检测结果
对６份材料的ＤＮＡ浓度和质量进行检测，结果表明，参试材料的基因组ＤＮＡ质量和浓度都较好，满足本试
验的要求（图１）。
２．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ单因子试验扩增结果分析
２．２．１ Ｍｇ２＋浓度对ＳＲＡＰ体系的影响 Ｍｇ２＋是ＰＣＲ反应体系中的重要影响因子之一。Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ扩
增效率和特异性都有影响，它是Ｔａｑ酶的激活剂，影响Ｔａｑ酶的活性，同时又与ｄＮＴＰ和模板结合，降低了酶活
性所需要的游离 Ｍｇ２＋的量。Ｍｇ２＋过多会增加产量，但会出现非特异扩增；过少会降低Ｔａｑ酶的活性，使反应产
物减少。因此ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系中 Ｍｇ２＋浓度就显得很重要。在该体系中 Ｍｇ２＋有１０个浓度梯度（图２Ａ）。
Ｍｇ２＋浓度为０．２５～１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ（泳道１～５）几乎无扩增产物，当浓度为１．５０ｍｍｏｌ／Ｌ时仅有２条很弱的条带；
随着浓度的逐渐升高，扩增条带逐渐丰富且清晰，１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ的多态性好但条带比较细，说明该浓度较低，扩
增产物的量较少，当 Ｍｇ２＋浓度为２．００，２．５０和３．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，３个水平的扩增结果无显著差异，综合比较，
Ｍｇ２＋浓度为２．００ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增效果最好，条带清晰，带型丰富，多态性好。
表５ 犛犚犃犘引物序列
犜犪犫犾犲５ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犳狅狉犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犻狊
编号Ｃｏｄｅ 正向引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ 编号Ｃｏｄｅ 反向引物Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍｅ１ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ３′ Ｅｍ１ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
Ｍｅ２ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′ Ｅｍ２ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ３′
Ｍｅ３ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ３′ Ｅｍ３ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
Ｍｅ４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡ３′ Ｅｍ４ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
Ｍｅ５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ Ｅｍ５ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
Ｅｍ６ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
Ｅｍ７ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ３′
Ｅｍ８ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ３′
Ｅｍ９ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＡ３′
Ｅｍ１０ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴ３′
图１ 参试材料犇犖犃原液（左）及稀释为５０狀犵／μ犔（右）的犇犖犃电泳检测
犉犻犵．１ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃（犾犲犳狋）犪狀犱犻狋狊５０狀犵／μ犔犱犻犾狌狋犻狅狀（狉犻犵犺狋）狅犳犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犿犪狋犲狉犻犪犾
图中编号１～６分别为材料Ｚ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ３１３，编号７为λＤＮＡ
Ｎｕｍｂｅｒ１－６ｒｅｆｅｒｔｏＺ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ３１３，７ｒｅｆｅｒｓｔｏλＤＮＡ
６９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
２．２．２ ｄＮＴＰ浓度对ＳＲＡＰ体系的影响 高浓度的ｄＮＴＰｓ会对ＰＣＲ扩增反应起到抑制作用，而浓度过低又会
影响扩增产率。本研究在其他条件不变的前提下设定９个ｄＮＴＰｓ浓度梯度（图２Ｂ）。在浓度为１５０，１８０和２００
μｍｏｌ／Ｌ时条带清晰，２２０和２４０μｍｏｌ／Ｌ条带减少，仅１条。浓度超过２４０μｍｏｌ／Ｌ扩增条带有所增加但比较模
糊。经比较在２０μＬ体系中ｄＮＴＰ浓度为２００μｍｏｌ／Ｌ时扩增条带清晰且丰富。
２．２．３ 引物浓度对ＳＲＡＰ体系的影响 引物浓度会影响ＰＣＲ扩增的特异性。较高的引物浓度会导致非特异性
产物扩增；过低则影响扩增效果。本研究设置８个引物浓度梯度（图２Ｃ）。浓度为０．０５μｍｏｌ／Ｌ时条带少且不清
晰，说明扩增产率低，浓度为０．１０～０．４０μｍｏｌ／Ｌ时随浓度的逐渐增加，扩增条带也逐渐清晰且稳定。为节省起
见，本研究采用在２０μＬ体系中加入０．１５μｍｏｌ／Ｌ引物的设计。
２．２．４ ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度对ＳＲＡＰ体系的影响 ＴａｑＤＮＡ酶浓度过低不能扩增，浓度太高产生非特异性扩
增。选择ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度时主要考虑到扩增效果和成本。本研究设定８个ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度梯度（图
２Ｄ），ＴａｑＤＮＡ聚合酶为０．２５Ｕ时扩增产物少，条带少；０．５０，０．７５和１．２５Ｕ的条带增加且较清晰；１．００Ｕ的
条带丰富且清晰；１．５０，１．７５和２．００Ｕ虽条带丰富但稍弱。综合考虑其扩增效果和成本，本体系确定ＴａｑＤＮＡ
聚合酶浓度为１．００Ｕ。
２．２．５ ＤＮＡ浓度对ＳＲＡＰ体系的影响 在本研究中设定了９个ＤＮＡ浓度梯度（图２Ｅ），除了ＤＮＡ浓度为１０
和２０ｎｇ时扩增条带少且有非特异带出现外，３０～９０ｎｇ的扩增结果都无太大的差异，条带都较清晰和稳定。这
说明ＳＲＡＰ标记对模板ＤＮＡ浓度的范围要求较宽，经过比较和综合考虑，最后确定ＤＮＡ浓度为５０ｎｇ。
图２ 不同浓度水平 犕犵２＋、犱犖犜犘狊、引物、犜犪狇犇犖犃聚合酶和犇犖犃的犛犚犃犘－犘犆犚电泳图谱
犉犻犵．２ 犛犚犃犘－犘犆犚狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅犳犕犵２＋、犱犖犜犘狊、狆狉犻犿犲狉狊、犜犪狇犇犖犃狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犪狀犱犇犖犃
Ｍ：Ｍａｒｋ；Ａ：１～１０泳道分别为 Ｍｇ２＋浓度 Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅ１ｔｏ１０ａｒｅ０．２５，０．５０，０．７５，１．００，１．２５，１．５０，１．７５，２．００，２．５０，３．００
ｍｍｏｌ／Ｌ）；Ｂ：１～９泳道分别为ｄＮＴＰ浓度ｄＮＴＰｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅ１ｔｏ９ａｒｅ１５０，１８０，２００，２２０，２４０，２６０，２８０，３００，３２０μｍｏｌ／Ｌ；Ｃ：１～８泳道
分别为引物浓度Ｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅ１ｔｏ８ａｒｅ０．０５，０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．３０，０．３５，０．４０μｍｏｌ／Ｌ；Ｄ：１～８泳道分别为ＴａｑＤＮＡ聚
合酶浓度 ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅ１ｔｏ８ａｒｅ０．２５，０．５０，０．７５，１．００，１．２５，１．５０，１．７５，２．００Ｕ；Ｅ：１～９泳道分别为ＤＮＡ浓度
ＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅ１ｔｏ９ａｒｅ１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０ｎｇ
７９第１７卷第６期 草业学报２００８年
２．３ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ正交设计试验结果分析
图３ 犛犚犃犘－犘犆犚体系正交试验设计扩增结果
犉犻犵．３ 犃犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狊狅犳犛犚犃犘－犘犆犚
狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犱犻犪犵狉犪犿
１～１６为处理编号，见表４
１－１６ａｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｄｅ，ｓｈｏｗｎｉｎｔａｂｌｅ４；Ｍ：Ｍａｒｋ
结缕草ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化的正交试验１６
个组合的扩增结果如图３所示。参照何正文等［２６］
的方法，对扩增结果进行直观分析，依据谱带的强弱
及杂带的多少，将１６个处理结果划分为１６个评分
等级以便统计分析，从１～１６泳道依次计分为６，１，
８，２，３，９，４，７，５，１６，１１，１０，１３，１４，１５和１２。得分最
高的１０和１５组合因有杂带，不宜采用；得分较高的
１３和１４组合带型清晰，亮度高，且杂带少，扩增效
果最好；但比较分析２个组合不同组分浓度差异，组
合１３的２０μＬ反应体系中ＴａｑＤＮＡ 聚合酶的用
量为０．７５Ｕ，而组合１４为０．５０Ｕ，综合考虑试验的
效果和成本，最终选择第１４组合为结缕草基因组
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ的最佳反应体系，即２０μＬ反应体系中含有 Ｍｇ
２＋ ２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０
μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５０Ｕ、ＤＮＡ６０ｎｇ。
根据穆立蔷等［２７］的方法，对正交设计试验中的各组分浓度组合进行分析（表６）。其中犓 值表示各因素同一
水平下的试验值之和；犽值代表每一因素水平下的平均值；犚值为极差，即各因素在不同水平下的最大平均值与
最小平均值之差。极差犚值的大小反应了影响因子对反应体系结果的影响大小，犚值越大，影响越显著。在选
定的４个水平范围内，Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶和模板ＤＮＡ五个因素对结果的影响由大到小依次
为：Ｍｇ２＋＞ＤＮＡ＞ｄＮＴＰ＞引物＞ＴａｑＤＮＡ聚合酶。犽值反应了影响因素各水平对反应体系的影响情况，犽值
越大，反应水平越好。Ｍｇ２＋以水平４好，ｄＮＴＰ以水平２好，引物以水平１好，ＴａｑＤＮＡ聚合酶以水平３好，
ＤＮＡ以水平１好（表６）。这五因素的最佳反应体系为：Ｍｇ２＋ ２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．１０
μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．００Ｕ，模板ＤＮＡ３０ｎｇ。此最佳水平组合没有在正交设计表中出现，但与直观分析
中分值最高的１０组合最接近，仅Ｍｇ２＋和引物浓度不同；其次和１４，１５组合较接近。该结果与直观分析法的结果
基本一致，进一步确定组合１４为最优组合体系。
２．４ ２种方法反应体系的验证结果
根据以上２种方法的最佳优化体系，用４对引物 Ｍｅ１＋Ｅｍ２、Ｍｅ２＋Ｅｍ３、Ｍｅ４＋Ｅｍ３、Ｍｅ１＋Ｅｍ８，６份材料
（Ｚ３１３、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５）对两体系进行验证，两体系的扩增结果如图４所示。经直观比较，２个优
化反应体系差别不是很大，都能扩增出清晰丰富、特异性高且具有很好稳定性的条带。为了更好地验证２种方法
表６ 正交试验结果的统计分析
犜犪犫犾犲６ 犛狋犪狋犻狊狋犻犮狉犲狊狌犾狋狅犳狋犺犲狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀
结果Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｍｇ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ） ｄＮＴＰ（μｍｏｌ／Ｌ） 引物Ｐｒｉｍｅｒ（μｍｏｌ／Ｌ） ＴａｑＤＮＡ聚合酶ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ） ＤＮＡ（ｎｇ）
犓１ １７．００ ２７．００ ３８．００ ３４．００ ４４．００
犓２ ２３．００ ４０．００ ２９．００ ３２．００ ２２．００
犓３ ４２．００ ３８．００ ３４．００ ３９．００ ４０．００
犓４ ５４．００ ３１．００ ３５．００ ３１．００ ３０．００
犽１ ４．２５ ６．７５ ９．５０ ８．５０ １１．００
犽２ ５．７５ １０．００ ７．２５ ８．００ ５．５０
犽３ １０．５０ ９．５０ ８．５０ ９．７５ １０．００
犽４ １３．５０ ７．７５ ８．７５ ７．７５ ７．５０
犚 ９．２５ ３．２５ ２．２５ ２．００ ５．５０
８９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
所得出的２种反应体系，本试验通过４对引物组合对６份结缕草属植物材料所扩增出的条带数和多态性进行比
较（表７）。结果表明，１）在这４对引物组合中，正交设计试验的扩增条带数大多多于或等同于单因子试验，仅引
物组合６的条带数比单因子试验少１条，但其多态性比率（６６．７％）却高于单因子试验（５７．１％）。２）正交设计试
验扩增出的多态性条带数都多于或等同于单因子试验。３）在２种方法的多态性比率的比较中，正交设计试验中
仅引物组合１４的比率（４４．４％）稍低于单因子试验（５０．０％），其他３对引物组合的多态性比率均高于单因子试
验。
因此，最终确定本研究的最佳优化体系为正交设计试验的反应体系即 Ｍｇ２＋２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０
μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ、２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ。在４对不同引物的扩增条
件下，６份结缕草属植物材料都在分子水平上表现出明显的多态性差异，多态性位点数目多，表明该体系可以有
效地反应出结缕草属种源和后代间的差异，同时也可以对不同结缕草属植物的基因组进行ＳＲＡＰ扩增。
图４ ２种不同方法的优化反应体系比较结果
犉犻犵．４ 犆狅犿狆犪狉犪狋犻狏犲狉犲狊狌犾狋狊狅犳狋狑狅犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲狋犺狅犱狊犻狀狅狆狋犻犿犻狕犲犱狊狔狊狋犲犿
Ｍ：Ｍａｒｋ；４对引物Ｆｏｕｒｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ：Ｍｅ１＋Ｅｍ２、Ｍｅ２＋Ｅｍ３、Ｍｅ４＋Ｅｍ３、Ｍｅ１＋Ｅｍ８；６份材料依次Ｓｉｘ犣狅狔狊犻犪ｍａｔｅｒｉａｌｓａｒｅ：Ｚ３１３、Ｚ１１９、
Ｚ１２３、Ｚ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５；Ｍａｒｋ的左边为单因素－多水平体系，右边为正交试验设计体系ＬｅｆｔｏｆＭａｒｋｉｓｓｉｎｇｌｅ－ｍｕｌｔｉｌｅｖｅｌｓｓｙｓｔｅｍ；ＲｉｇｈｔｏｆＭａｒｋｉｓ
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｓｙｓｔｅｍ
表７ ２种不同方法的优化体系中４对引物组合的扩增结果多态性比较
犜犪犫犾犲７ 犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿犮狅犿狆犪狉犲狅犳狋犺犲狉犲狊狌犾狋犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔犳狅狌狉狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊
狑犻狋犺狋狑狅犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲狋犺狅犱狊犻狀狅狆狋犻犿犻狕犲犱狊狔狊狋犲犿
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
单因子试验Ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔ
扩增条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｂａｎｄｓ
多态性条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｒａｔｅ（％）
正交设计试验Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｔｅｓｔ
扩增条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｂａｎｄｓ
多态性条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｒａｔｅ（％）
Ｍｅ１＋Ｅｍ２ ７ ４ ５７．１ ６ ４ ６６．７
Ｍｅ２＋Ｅｍ３ ７ ３ ４２．９ ８ ５ ６２．５
Ｍｅ４＋Ｅｍ３ ８ ４ ５０．０ ９ ４ ４４．４
Ｍｅ１＋Ｅｍ８ ８ ４ ５０．０ ８ ７ ８７．５
３ 讨论
３．１ 单因子试验和正交试验在结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化中的应用
本研究针对目前２种主要的ＰＣＲ体系优化方法对结缕草属植物的ＳＲＡＰ反应体系进行了优化，结果发现二
者扩增结果存在的差异较小。单因子试验通过 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ等因素的多个水平
来确定各因素的最佳扩增结果，从而使各因素的最佳水平组合起来得到ＳＲＡＰ优化体系，但该方法在优化各因
９９第１７卷第６期 草业学报２００８年
素的最佳水平时都要逐一变化其中一种因素浓度而固定其余４种，当变化一种因素的浓度时，固定的其余４种因
素的浓度往往靠经验或参考相近物种考虑，这样既不能考察ＰＣＲ体系中各组分的交互作用，也不能完全保证各
组分最佳的组合就是最佳反应体系，且完成时间较长，成本较高。正交设计试验通过各因素的相互作用得到最佳
优化体系，与单因素试验相比，能通过直观分析法，快速获得满意的试验结果，减少处理组合，节约时间，减少工作
量也降低了试验经费。但也有学者指出该方法存在一定的局限性，如对试验结果的评价带有主观性，打分的次序
会直接影响分析结果，也不能很好地估计误差［２７］。本研究中２种方法得到的各因素最佳水平不完全相同，这可
能与２种方法的优缺点有关。因此，今后ＰＣＲ扩增条件及结果的客观评价体系的建立将是ＰＣＲ反应体系优化
的重要依据，也将会更好地促进正交试验设计的应用。
３．２ 结缕草属ＳＲＡＰ－ＰＣＲ优化体系的建立
在ＰＣＲ反应体系中各个影响因素之间都相互作用，影响最大的是体系中的 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物的浓度［２８，２９］。
本研究的正交设计试验中各因素对反应体系的影响大小为：Ｍｇ２＋＞ＤＮＡ＞ｄＮＴＰ＞引物＞ＴａｑＤＮＡ 聚合酶，此
结果表明结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系中各因素的影响作用与前人的结果基本一致。本研究通过单因
子试验和正交设计试验对结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系进行优化后，得到的最佳反应体系为：Ｍｇ２＋２．００
ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ，２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ，总
体积为２０μＬ。此最佳体系与标准ＰＣＲ及他人的研究在各因素的浓度方面存在差异，这可能是由于不同植物的
基因组和标记类型不同造成的［２７］。该反应体系的成功建立为今后ＳＲＡＰ标记在结缕草属植物的种源鉴定、遗传
多样性分析、指纹图谱及遗传图谱构建等方面的广泛应用奠定了重要基础，也促进了分子标记技术在草业遗传育
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犈狊狋犪犫犾犻狊犺犿犲狀狋犪狀犱狅狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅犳犛犚犃犘－犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿犳狅狉犣狅狔狊犻犪
ＸＵＥＤａｎｄａｎ１，２，ＺＨＥＮＧＹｉｑｉ２，ＷＡＮＧＺｈｉｙｏｎｇ２，ＧＵＯＨａｉｌｉｎ２，ＣＨＥＮＸｕａｎ２，ＬＩＵＪｉａｎｘｉｕ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ
Ｂｏｔａｎｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅａｎｄＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＧｅｎｅｔｉｃＤＮＡｏｆ犣狅狔狊犻犪ｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅＳＤＳｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅｍａｊｏｒｆａｃｔｏｒｓｏｆ
ＳＲＡＰ，ｓｕｃｈａｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭｇ２＋，ｄＮＴＰｓ，ｐｒｉｍｅｒｓ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ａｎｄＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ，ｗｅｒｅｏｐ
ｔｉｍｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｏｆｆｉｖｅｆａｃｔｏｒｓａｔｆｏｕｒｌｅｖｅｌｓ．Ｉｎｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒ
ｔｅｓｔｓ，ｔｈｅｉｍｐａｃｔｓｏｆｔｈｅＳＲＡＰ－ＰＣＲｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒｅａｃｈｆａｃｔｏｒａｔｖａｒｉｏｕｓｌｅｖｅｌｓ．Ｉｎｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
ｄｅｓｉｇｎｔｅｓｔ，ｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＳＲＡＰｗｅｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙ，ａｎｄａｓｕｉｔａｂｌｅｌｅｖｅｌｏｆｅａｃｈｆａｃｔｏｒｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｉｎｔｕｉｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｏｕｒｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｓｉｘｍａｔｅｒｉａｌｓｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ａ
ｆｅｗｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｔｗｏｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｄｅｅｐ
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｂａｎｄｓ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒａｔｅｉｎｔｈｅｔｗｏａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎａｎｏｐ
ｔｉｍｉｓｅｄＳＲＡＰ－ＰＣＲｓｙｓｔｅｍｆｏｒ犣狅狔狊犻犪ｂｅｉｎｇｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ：Ｍｇ２＋２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ，ｐｒｉｍｅｒ０．２
μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５Ｕ，ＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ６０ｎｇ，１０×ｂｕｆｆｅｒ２μＬｉｎｔｈｅ２０μＬｖｏｌｕｍｅｒｅａｃｔｉｏｎ．
ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄＳＲＡＰ－ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓｃｏｕｌｄｂｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ，ｇｅｒｍｐｌａｓｍｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐｓａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎ犣狅狔狊犻犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狅狔狊犻犪；ＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓ；ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ；ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｙｓｔｅｍ
１０１第１７卷第６期 草业学报２００８年