全 文 ：书高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因犉犪犛犃犕犇犆的
克隆与差异表达分析
王小利，刘晓霞，王舒颖，杨义成，吴佳海
（贵州省草业研究所，贵州 贵阳５５０００６）
摘要：在进行高羊茅光敏色素Ｃ基因５′端克隆时，筛选到腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的５′端序列，根据５′端序列设计
引物，扩增出该基因的３′端，拼接得到高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因全序列，命名为犉犪犛犃犕犇犆（ＧｅｎＢａｎｋ登录
号：ＨＱ６０６１３９），利用实时荧光定量ＰＣＲ技术研究犉犪犛犃犕犇犆基因在长日照与短日照条件下昼夜２４ｈ的表达差
异，为进一步揭示不同光周期调控犉犪犛犃犕犇犆基因的表达奠定理论基础。犉犪犛犃犕犇犆的ｃＤＮＡ全长１９６４ｂｐ，具
有微型上游阅读框、小型上游阅读框和主阅读框３个开放阅读框，分别位于２２６～２３４，２３４～３８０和５５５～１７４２ｂｐ，
微型上游阅读框和小型上游阅读框存在１个碱基重叠，主阅读框编码３９５个氨基酸，含有保守功能域：酶原剪切位
点功能域和ＳＡＭＤＣ蛋白快速降解有关的ＰＥＳＴ功能域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明，ＦａＳＡＭＤＣ
与其他单子叶植物ＳＡＭＤＣ蛋白的亲缘关系较近。在长日照和短日照处理条件下，犉犪犛犃犕犇犆都具有３个表达
峰。短日照处理条件下的表达峰比长日照处理条件下的表达峰早几个小时，但峰高低于长日照条件。由此说明，
犉犪犛犃犕犇犆基因的表达受光周期调控，与生物钟控制的昼夜节律有关。
关键词：高羊茅；腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因；克隆；表达分析
中图分类号：Ｓ５４０．３５３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０４０１６９１１
Ｓ腺苷甲硫氨酸脱羧酶（Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＳＡＭＤＣ）是植物多胺生物合成途径中一个关
键酶，它以Ｓ腺苷甲硫氨酸（Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）为底物催化形成脱羧Ｓ腺苷甲硫氨酸（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ
Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ｄｃＳＡＭ），为精胺和亚精胺的合成提供氨丙基，是精胺和亚精胺合成的限速酶［１］。
到目前为止，已从康乃馨（犇犻犪狀狋犺狌狊犮犪狉狔狅狆犺狔犾犾狌狊）、拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、水
稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、芥菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犼狌狀犮犲犪）、番茄（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）等植物中克隆出腺苷甲硫氨酸脱羧酶
编码基因［２５］，在ＧｅｎＢａｎｋ注册的腺苷甲硫氨酸脱羧酶编码基因约有１８０个，其中从植物中分离的有４０多个［６］。
原核生物和真核生物中分离得到的腺苷甲硫氨酸脱羧酶几乎没有序列相似性，但是在植物中，该酶具有很高的序
列相似性［７］。
目前，在植物中对腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因功能的研究主要集中在２个方面，一是增强植物的抗逆性，
ＳＡＭＤＣ是多胺生物合成途径中的一个关键酶，而多胺作为渗透调节物质在植物受到环境胁迫时起作用，多胺含
量的增加能增强植物的抗逆性［３，８，９］；二是与植物的衰老进程相关，ＳＡＭＤＣ的底物ＳＡＭ 也是乙烯的合成前体物
质，乙烯也与植物的成熟衰老进程密切相关［１０，１１］。近年来对犛犃犕犇犆基因的分子结构已有较多报道，研究发现，
犛犃犕犇犆基因受光快速调控，表达具有昼夜节律，受生物钟控制［１２１４］。本研究在克隆了高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧
酶基因全序列的基础上，利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术研究犉犪犛犃犕犇犆基因在长日照
与短日照条件下昼夜２４ｈ的表达差异，为进一步揭示不同光周期调控犉犪犛犃犕犇犆基因的表达奠定理论基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 供试材料 黔草１号高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪ｃｖ．ＱｉａｎｃａｏＮｏ．１），是贵州省草业研究所２００５年育成
的国家牧草新品种，登记号：２９９；该品种抗逆性强、适应性广、坪用性好、耐践踏、持续性好、绿期长，种子成熟期集
第２０卷 第４期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１６９－１７９
２０１１年８月
收稿日期：２０１１０１１３；改回日期：２０１１０３１８
基金项目：黔农科院（院专项）［２００９］０３８号和黔农科合（创新基金）０９００７号资助。
作者简介：王小利（１９７７），男，甘肃镇原人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｏｌｉｚｈｅｎｙｕａｎ＠１２６．ｃｏｍ
中，产量高，适应我国长江中下游低山、丘陵等地区种植，是运动场草坪、环境绿化、生态治理的优良草种。
１．１．２ 主要试剂 大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞购自天根生化（北京）有限公司；克隆载体ｐＭＤ１９Ｔ、ＲＮＡ提取
试剂盒（ＴａＫａＲａＲＮＡｉｓｏＲｅａｇｅｎｔ）、ＲＮＡ反转录试剂盒（ＴａＫａＲａＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴＰＣＲＫｉｔ）、３′ＲＡＣＥ试剂盒
（３′ＦｕｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔＶｅｒ．２．０）、ＤＮＡ标准分子量（ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００、１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ）、高保
真酶、ＳＹＢＲ（Ｒ）ＧｒｅｅｎＩ嵌合荧光法实时定量ＰＣＲ试剂盒（ＳＹＢＲ? ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴＰＣＲＫｉｔ）、梯度稀释液
（ＥＡＳＹＤｉｌｕｔｉｏｎ）、脱氧核糖核酸酶Ｉ、体外转录试剂盒（犐狀犞犻狋狉狅ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＴ７ｋｉｔ）均购自大连宝生物工程有
限公司；５′ＲＡＣＥ试剂盒（ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）、Ｔａｑ酶（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲｋｉｔ）均购于
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；琼脂糖ＤＮＡ回收试剂盒购自ＯｍｅｇａＢｉｏＴｅｋＩｎｃ；酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖购自Ｏｘｏｉｄ公司；
５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷、异丙基βＤ硫代半乳糖苷、青霉素购自北京索莱宝科技有限公司。
１．２ 方法
１．２．１ 材料处理与总ＲＮＡ提取 于２０１０年３月将“黔草１号”高羊茅种子播种在花盆中，置于光照培养箱中，
长日照条件：生长温度２２℃，光照１６ｈ，黑暗８ｈ；短日照条件：生长温度２２℃，光照８ｈ，黑暗１６ｈ；待种子发芽长
成幼苗１个月之后开始取样，在昼夜２４ｈ期间，每２ｈ从生长在长日照和短日照条件下的高羊茅植株上采集叶
片，用宝生物工程有限公司生产的总ＲＮＡ提取试剂盒提取“黔草１号”高羊茅叶片总ＲＮＡ，保存在－８０℃的冰
箱中待测。将提取的总ＲＮＡ稀释后分别在２６０，２８０和３２０ｎｍ紫外光测定ＯＤ值。并用１．２％的琼脂糖凝胶电
泳检测ＲＮＡ的完整性。
１．２．２ 引物设计 以实验中获得的５′端序列为模板，设计２个上游引物，在实验中分别命名为ＦａＳＡＭＤＣ
ｆｗｄ１、ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ２，与３′ＲＡＣＥ试剂盒中的引物相结合克隆其３′端。在犉犪犛犃犕犇犆基因上设计构建标准品
用引物，在实验中分别命名为ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ３、ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ３，并在构建标准品用上游引物ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ３
的５′端加上Ｔ７启动子序列，Ｔ７启动子序列为：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ，下游引物ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ３的
５′端加上２５个Ｔ。在构建标准品用引物扩增序列的内侧设计实时荧光定量ＰＣＲ用引物，在实验中分别命名为
ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ４、ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ４。以上引物皆由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列及在各个扩增反
应中相互之间的组合见表１。
１．２．３ 高羊茅犉犪犛犃犕犇犆基因全长ｃＤＮＡ克隆 实验中设计的引物与３′ＲＡＣＥ、５′ＲＡＣＥ试剂盒中的引物相
结合克隆该序列的５′和３′端。３′ＲＡＣＥ与５′ＲＡＣＥ具体步骤均按照其说明书进行，ＰＣＲ产物回收后经Ｔ载体克
隆、测序、使用ＤＮＡＭＡＮ软件与已知序列进行拼接，得到全长的ｃＤＮＡ序列。
表１ 扩增犉犪犛犃犕犇犆基因犮犇犖犃序列和荧光定量犘犆犚中所用的引物
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犳狅狉犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犘犆犚
扩增类别
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｒｔ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′３′）
５′ＲＡＣＥ
ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ１ ５′ＧＡＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＡＴＣ３′
５′ＲＡＣＥ通用混合引物 ５′ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ３′
１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒａｍｉｘ ５′ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３′
３′ＲＡＣＥ ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ１ ５′ＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣ３′
３′ＲＡＣＥ外引物３′ＲＡＣＥｏｕｔｐｒｉｍｅｒ ５′ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴ３′
ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ２ ５′ＧＧＴＴＴＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣ３′
３′ＲＡＣＥ内引物３′ＲＡＣＥｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒ５′ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ３′
构建标准品 ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ３ ５′ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＧＡＴＣＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣＡ３′
ＳｔａｎｄａｒｄＲＮＡｓａｍｐｌｅＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ３ ５′ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧ３′
ＦＱＰＣＲ ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ４ ５′ＣＣＴＣＧＧＴＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡ３′
ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ４ ５′ＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡ３′
０７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
１．２．４ 高羊茅犉犪犛犃犕犇犆基因编码蛋白质功能分析 利用ＤＮＡＭＡＮ软件分析进行序列拼接，氨基酸序列同
源性分析，联网（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）寻找开放阅读框，利用网站（ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．Ｅｘ
ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）预测其相对分子量和等电点；通过ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ
ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）进行蛋白质的疏水性分析，输入ｈｔｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔｔ．ｓｅｑ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／进行亚细胞定位分析；应用
ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｎｐｓａａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ）预测其编码蛋白的二级结构；通过蛋白质结构功
能域分析网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）进行蛋白质结构功能域的分析。申请
ＧｅｎＢａｎｋ新基因登录号。
１．２．５ 体外转录获得ＲＮＡ标准品 提取的总 ＲＮＡ样品ＰＣＩ（ｐｈｅｎｏｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ）精制，对精制
后的总ＲＮＡ样品分别在２６０和２８０ｎｍ测定其ＯＤ值。计算ＯＤ２６０与ＯＤ２８０的比值与ＲＮＡ浓度。并用１．２％的
琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ的完整性。检测完待分析ＲＮＡ样品的完整性后进行反转录，反应体系：５×Ｐｒｉｍｅ
ＳｃｒｉｐｔＢｕｆｆｅｒ２μＬ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘＩ０．５μＬ，ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（５０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，Ｒａｎｄｏｍ６ｍｅｒｓ
（１００μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，总ＲＮＡ１μＬ（２０ｎｇ），ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２Ｏ５．５μＬ，总体积１０μＬ；反应程序：３７℃１５ｍｉｎ，
８５℃５ｓ。选取浓度较高的ＲＮＡ样品反转录得到ｃＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ；反应体系：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋）
５μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，ＴａＫａＲａＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，ＦａＳＡＭＤＣ
ｆｗｄ３（２０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ３（２０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，反转录反应液２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３３．７５μＬ，ＰＣＲ反应的总
体积为５０μＬ。扩增程序：９５℃预变性２ｍｉｎ，然后９４℃变性３０ｓ；５５℃退火３０ｓ；７２℃延伸３０ｓ，进行３０个循环。
ＰＣＲ产物乙醇精制后进行标准品的构建，按照ｓｉＲＮＡ 合成试剂盒操作说明，以精制好的ＰＣＲ产物为模板进行
体外转录，转录后的ＲＮＡ样品进行ＤＮａｓｅＩ处理，并进行精制。得到ＲＮＡ标准品。
１．２．６ 实时荧光定量ＰＣＲ标准曲线建立 测定标准品Ａ２６０值和Ａ２８０值，根据Ａ２６０值计算标准品浓度，换算成拷
贝数后，将构建的ＲＮＡ标准品（１０５ 拷贝数／μＬ）反转录获得的ｃＤＮＡ作为标准品，用ＥＡＳＹＤｉｌｕｔｉｏｎ按１０倍梯
度稀释（１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８ 倍）作为模板，在ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ荧
光定量ＰＣＲ仪上进行扩增，反应体系：ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（２Ｘ）１２．５μＬ，ＦａＳＡＭＤＣｆｗｄ４（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５
μＬ，ＦａＳＡＭＤＣｒｅｖ４（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，模板２μＬ（制作标准曲线时，添加梯度稀释的ｃＤＮＡ），ｄｄＨ２Ｏ８．５μＬ，
总体积：２５μＬ；反应程序：９５℃１０ｓ；９５℃５ｓ，６０℃３０ｓ，共４０个循环；在每个循环内加入读板步骤，总延伸结束
后，加入融解曲线分析（５５．０～９５．０℃，每０．５℃读板１次）步骤，反应结束后，计算机利用分析软件自动得到
犉犪犛犃犕犇犆基因标准曲线和直线回归方程。
１．２．７ 实时荧光定量ＰＣＲ检测 应用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料嵌合法，在宝生物工程有限公司生产的实时荧光
定量ＰＣＲ仪（ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ）上扩增并检测荧光，反应体系与反应程序见
１．２．６，利用标准曲线分别对样品犉犪犛犃犕犇犆基因进行定量，得到样品绝对定量结果，根据３次重复计算标准差，
验证其是否处于误差范围中。
２ 结果与分析
２．１ 犉犪犛犃犕犇犆基因全长克隆与核酸序列分析
提取的总ＲＮＡ经ＯＤ值检测发现，ＯＤ２６０与ＯＤ２８０的比值均在１．８０左右。琼脂糖凝胶电泳检测发现，２８Ｓ与
１８Ｓ两条带清晰可见（图１，２），无ＤＮＡ污染的迹象，说明提取的ＲＮＡ样品纯度高，完整性好，没有发生降解与
ＤＮＡ污染。将实验中扩增获得的５′端片段测序（图３），结果在ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ）上比对，发现与腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因犛犃犕犇犆有较高同源性，以所获得５′端序列设计引物克隆其３′
端；扩增出的片段经测序为１４１５ｂｐ（图４），与已知的５′端序列有重叠，获得了高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶犛犃犕
犇犆基因完整的ｃＤＮＡ序列，去除ｐｏｌｙＡ后，全长为１９６４ｂｐ，在实验中命名为犉犪犛犃犕犇犆，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为
ＨＱ６０６１３９。
２．２ 犉犪犛犃犕犇犆基因编码蛋白质分析
分析高羊茅犉犪犛犃犕犇犆基因ｃＤＮＡ全序列，经ＯＲＦ搜索以及与其他植物犛犃犕犇犆基因比对分析，确定该
基因编码３个ＯＲＦ，依次为微型上游阅读框（ｔｉｎｙｕｐｓｔｒｅａｍＯＲＦ，ｔｉｕＯＲＦ）、小型上游阅读框（ｓｍａｌｕｐｓｔｒｅａｍ
１７１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
ＯＲＦ，ｓｍｕＯＲＦ）以及主阅读框（ｍａｉｎＯＲＦ，ｍＯＲＦ），分别分布在该基因的２２６～２３４，２３４～３８０和５５５～１７４２
ｂｐ位置，ｔｉｕＯＲＦ和ｓｍｕＯＲＦ存在１个碱基重叠，即前者终止密码子ＴＡＡ最后一个碱基Ａ同时是后者起始密
码子ＡＴＧ的第１个碱基（图５）。分析高羊茅与其他９种植物犛犃犕犇犆基因ｔｉｕＯＲＦ和ｓｍｕＯＲＦ序列发现，在
这些植物中，ｔｉｕＯＲＦ和ｓｍｕＯＲＦ都存在１个碱基的重叠，即前者终止密码子ＴＡＡ最后１个碱基Ａ同时也是
后者起始密码子ＡＴＧ的第１个碱基（图５）。ｔｉｕＯＲＦ一般编码２～３个氨基酸，编码氨基酸可分为３种类型：第
１种类型编码２个氨基酸，终止密码子为ＴＡＡ；第２种类型也是编码２个氨基酸，但是终止密码子为ＴＧＡ；第３
种类型编码３个氨基酸，终止密码子为ＴＧＡ。ｍＯＲＦ编码蛋白含有３９５个氨基酸（图６，７）；预测ＦａＳＡＭＤＣ相
对分子量为４３．０４ｋＤａ，等电点ｐＩ＝４．７７；亚细胞定位分析发现该蛋白定位于细胞质，利用ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ
软件对ＦａＳＡＭＤＣ蛋白进行疏水性分析显示：疏水性最大值为２．０４４，最小值为－２．３２２，达１．５以上的疏水峰有
４处，达－１．５以下的亲水峰有５处（图８）；应用ＳＯＰＭＡ预测ＦａＳＡＭＤＣ蛋白的二级结构：ＦａＳＡＭＤＣ蛋白含有
约３６．２０％的α螺旋，１８．９９％的延伸链，４．３０％的β转角和４０．５１％的不规则卷曲（图９）。
图１ 犚犖犃完整性检测
犉犻犵．１ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犚犖犃犻狀狋犲犵狉犪犾犻狋狔
“Ｍ”代表ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，“１”代表２８Ｓ和１８Ｓ条带
“Ｍ”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，“１”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ
２８Ｓａｎｄ１８Ｓｆｒａｇｍｅｎｔ
图４ 犉犪犛犃犕犇犆基因５′犚犃犆犈扩增产物
犉犻犵．４ 犜犺犲５′犚犃犆犈狆狉狅犱狌犮狋狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
“Ｍ”代表ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，“１”代表ＰＣＲ扩增条带
“Ｍ”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，“１”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ
ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ
图３ 犉犪犛犃犕犇犆基因３′犚犃犆犈扩增产物
犉犻犵．３ 犜犺犲３′犚犃犆犈狆狉狅犱狌犮狋狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
“Ｍ”代表ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，“１”代表ＰＣＲ扩增条带
“Ｍ”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，“１”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ
ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ
图２ 犉犪犛犃犕犇犆标准品电泳
犉犻犵．２ 犜犺犲犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆狊狋犪狀犱犪狉犱犚犖犃狊犪犿狆犾犲
“Ｍ”代表１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ，“１”代表ＲＮＡ标准品
“Ｍ”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ，
“１”ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄＲＮＡｓａｍｐｌｅ
２．３ ＦａＳＡＭＤＣ保守结构域分析
犉犪犛犃犕犇犆基因ｓｍｕＯＲＦ长１４７ｂｐ，编码４８个氨基酸，与ＮＣＢＩ已公布的犛犃犕犇犆基因ｓｍｕＯＲＦ比对分
析发现，单子叶与双子叶植物中ｓｍｕＯＲＦ高度保守，一般编码４８～５４个氨基酸（图１０）。大部分基因５′端非翻
译区无功能，且不稳定，而犛犃犕犇犆基因５′端非翻译区ｓｍｕＯＲＦ高度保守，预示该ｓｍｕＯＲＦ可能具有某种特定
的生物学功能。
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图５ 不同植物犛犃犕犇犆的狋犻狌犗犚犉和狊犿狌犗犚犉之间链接区的犮犇犖犃序列
犉犻犵．５ 犮犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狋犺犲犼狌狀犮狋犻狅狀犫犲狋狑犲犲狀狋犺犲狋犻狌犗犚犉犪狀犱狊犿狌犗犚犉犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犾犪狀狋狊
小写字母为ｔｉｕＯＲＦ；大写字母为ｓｍｕＯＲＦ；黑体“Ａ”为２个ＯＲＦ的公用序列；下划线为ｔｉｕＯＲＦ的终止密码子ＳｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｉｕＯＲＦ；
ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｍｕＯＲＦ；ｔｈｅｂｏｌｄＡｉｓｔｈｅｃｏｍｍｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｔｗｏＯＲＦ；ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｏｐｃｏｄｅｏｆｓｍｕＯＲＦ
图６ 犉犪犛犃犕犇犆基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
犉犻犵．６ 犜犺犲狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
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图７ 高羊茅犉犪犛犃犕犇犆基因犿犚犖犃结构
犉犻犵．７ 犜犺犲狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犿犚犖犃狅犳狋犪犾犳犲狊犮狌犲犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
图８ 犉犪犛犃犕犇犆蛋白疏水性分析
犉犻犵．８ 犎狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅狀犉犪犛犃犕犇犆狆狉狅狋犲犻狀
图９ 犉犪犛犃犕犇犆蛋白二级结构预测
犉犻犵．９ 犘狉犲犱犻犮狋犲犱狊狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲犳狅狉犉犪犛犃犕犇犆狆狉狅狋犲犻狀
保守结构域功能分析发现：ＦａＳＡＭＤＣ是一个Ｓ
腺苷甲硫氨酸脱羧酶原蛋白。在多胺的生物合成中，
催化腺苷甲硫氨酸（Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）形
成脱羧的ＳＡＭ，为精胺和亚精胺的合成提供氨丙基。
它包含２个保守的结构域：酶原剪切位点（ＬＳＥＳＳＬＦ）
结构域［１５］，与ＳＡＭＤＣ蛋白快速降解有关的 ＰＥＳＴ
（ＴＩＨＩＴＰＥＤＧＦＳＹＡＳＦＥ）结构域［１６］（图１１）。多重序
列比对表明，植物ＳＡＭＤＣ的 Ｎ末端保守性较强，而
Ｃ末端的保守性较弱，功能结构域（酶原剪切位点和
ＰＥＳＴ结构域）高度保守，显示了ＳＡＭＤＣ酶进化的保
守性。相对于双子叶植物，单子叶植物ＳＡＭＤＣ拥有
较长的Ｃ末端（图１０，１２）。
２．４ 犉犪犛犃犕犇犆基因的同源性分析
基于氨基酸序列同源性分析表明，犉犪犛犃犕犇犆基
因推导的氨基酸与已知植物ＳＡＭＤＣ同源性较高，植
物ＳＡＭＤＣ基因编码蛋白的氨基酸相似性水平基本
上反映了这些物种间的亲缘关系，高羊茅作为一种单
子叶植物，ＦａＳＡＭＤＣ与单子叶植物ＳＡＭＤＣ蛋白亲
缘关系较近，与双子叶植物的亲缘关系较远（图１３）。与小麦、水稻、玉米、水仙ＳＡＭＤＣ蛋白氨基酸一致性水平
分别为８８．３８％，８０．２０％，７６．１２％和６０．０１％。与拟南芥ＳＡＭＤＣ蛋白氨基酸一致性水平为４５．５０％。所以根
据氨基酸序列的一致性水平，可以将植物ＳＡＭＤＣ划分为单子叶植物与双子叶植物２个分支（图１３）。
图１０ 高羊茅与８种植物犛犃犕犇犆基因５′端狊犿狌犗犚犉推导氨基酸序列比对分析
犉犻犵．１０ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狋犺犲狊犿犪犾狌犗犚犉犻狀狋犺犲犛犃犕犇犆５′犲狀犱
狅犳狋犪犾犳犲狊犮狌犲犪狀犱狅狋犺犲狉犲犻犵犺狋狆犾犪狀狋狊
２．５ 实时荧光定量ＰＣＲ标准曲线的建立
构建的ＲＮＡ标准品进行电泳检测（图２），测定ＯＤ值（表２），将构建的ＲＮＡ标准品（１０５ 拷贝数／μＬ）反转录
获得的ｃＤＮＡ作为标准品，１０倍梯度稀释作为模板，实时荧光定量ＰＣＲ扩增检测（图１４），检测结果显示，
犉犪犛犃犕犇犆基因的回归方程为狔＝－３．４３０ｌｏｇ狓＋４３．３８，犚２＝１．０００［狔代表犆狋值（ＰＣＲ扩增过程中，扩增产物
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图１１ 犉犪犛犃犕犇犆基因推导的氨基酸序列与其他植物犛犃犕犇犆的同源比对
犉犻犵．１１ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狆狉犲犱犻犮狋犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆狆狉狅狋犲犻狀狑犻狋犺狅狋犺犲狉狊犲狏犲狉犪犾狆犾犪狀狋狊
“
!
”表示酶原剪切位点；“－”表示ＰＥＳＴ结构域“!”ｄｅｎｏｔｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｃｌｅａｖａｇｅ；“－”ｄｅｎｏｔｅＰＥＳＴｍｏｔｉｆｓ
图１２ 犉犪犛犃犕犇犆蛋白的功能结构域分析
犉犻犵．１２ 犜犺犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犳狌狀犮狋犻狅狀犪犾犱狅犿犪犻狀狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆狆狉狅狋犲犻狀
图１３ 犉犪犛犃犕犇犆与其他植物中犛犃犕犇犆基因同源性分析
犉犻犵．１３ 犎狅犿狅犾狅犵狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆犪狀犱犛犃犕犇犆犵犲狀犲犳狉狅犿狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
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的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数）；狓代表样品中起始模板数，犚代表相关系数］，犚２ 大于
０．９８，这说明可以在很宽的范围内进行准确定量；犉犪犛犃犕犇犆基因：扩增效率（犈）＝９５．７％，０．８＜犈＜１．２，说明扩
增效率良好。融解曲线峰形单一（图１５），说明反应特异性好。负对照反应未检测出荧光信号表明反应体系无污
染。可用于待测样本初始模板含量的测定。
２．６ 实时荧光定量ＰＣＲ定量结果
实时荧光定量ＰＣＲ检测结果显示，检测样品均获得较好的Ｃｔ值（图１６），融解曲线峰形单一（图１７）；长日照
和短日照条件下犉犪犛犃犕犇犆基因的２４ｈ昼夜表达模式相似，都能检测到犉犪犛犃犕犇犆基因表达明显的摆动，都具
有３个表达最高峰，长日照条件下，植物暴露在光下６．５ｈ出现表达高峰，短日照条件下，植物暴露在光下０．５ｈ
就出现表达高峰（图１８）。长日照条件下３个表达高峰分别出现在一天当中的１４：３０（４３９４５００拷贝数／μＬ）、
２０：３０（１９４９０００拷贝数／μＬ）、０：３０（１４９１０００拷贝数／μＬ），短日照条件下３个表达高峰分别出现在一天当中的
８：３０（３８８６５００拷贝数／μＬ）、１４：３０（１４２６００拷贝数／μＬ）、２０：３０（１０４１００拷贝数／μＬ）。短日照条件下的表达高
峰都比长日照条件下早出现几小时（图１８）。但长日照条件下犉犪犛犃犕犇犆基因表达高峰高于短日照条件下，这
表明犉犪犛犃犕犇犆基因的表达受光周期调控，与生物钟控制的昼夜节律有关。
表２ 犉犪犛犃犕犇犆基因标准品犗犇值
犜犪犫犾犲２ 犗犇狏犪犾狌犲狊狅犳狊狋犪狀犱犪狉犱犚犖犃狊犪犿狆犾犲狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
标准品
ＳｔａｎｄａｒｄＲＮＡｓａｍｐｌｅｓ
Ａ２６０值
Ａ２６０ｖａｌｕｅ
Ａ２８０值
Ａ２８０ｖａｌｕｅ
Ａ２６０／Ａ２８０值
Ａ２６０／Ａ２８０ｖａｌｕｅ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｎｇ／μＬ）
拷贝数
Ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ
（拷贝数Ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）
犉犪犛犃犕犇犆基因标准品ＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄＲＮＡｓａｍｐｌｅｏｆ犉犪犛犃犕犇犆 ０．１３１ ０．０７３ １．８０ ５２４ ２×１０１２
图１４ 犉犪犛犃犕犇犆标准品扩增曲线
犉犻犵．１４ 犜犺犲犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犮狌狉狏犲狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆
狊狋犪狀犱犪狉犱犚犖犃狊犪犿狆犾犲
图１５ 犉犪犛犃犕犇犆标准品融解曲线分析
犉犻犵．１５ 犜犺犲犿犲犾狋犻狀犵犮狌狉狏犲狊犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆
狊狋犪狀犱犪狉犱犚犖犃狊犪犿狆犾犲
图１６ 犉犪犛犃犕犇犆基因扩增曲线
犉犻犵．１６ 犜犺犲犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犮狌狉狏犲狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
图１７ 犉犪犛犃犕犇犆基因融解曲线
犉犻犵．１７ 犜犺犲犿犲犾狋犻狀犵犮狌狉狏犲狊犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲
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图１８ 长日照与短日照条件下高羊茅叶片中犉犪犛犃犕犇犆基因昼夜转录水平
犉犻犵．１８ 犉犪犛犃犕犇犆犵犲狀犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犾犲狏犲犾犻狀狋犪犾犳犲狊犮狌犲犾犲犪狏犲狊犻狀犱犪狔
犪狀犱狀犻犵犺狋狌狀犱犲狉犾狅狀犵犪狀犱狊犺狅狉狋犱犪狔狊犮狅狀犱犻狋犻狅狀
３ 讨论与结论
３．１ 犉犪犛犃犕犇犆基因编码蛋白具有２个保守的功能域
犉犪犛犃犕犇犆具有植物犛犃犕犇犆基因的结构特点，如犉犪犛犃犕犇犆编码蛋白具有酶原剪切位点和与蛋白快速
降解有关的ＰＥＳＴ功能域，说明所克隆的犉犪犛犃犕犇犆基因在植物体内具有一定的生物学功能。ＰＥＳＴ序列是一
个富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的结构域，在细胞内半衰期少于２ｈ的真核蛋白氨基酸序列中常具有此
结构域，而在胞间半衰期长于２０ｈ的真核蛋白氨基酸序列中则很少出现这个基序［１６，１７］。ＰＥＳＴ结构的存在可能
导致ＳＡＭＤＣ的半衰期较短，这样就可以快速调控生物体内ＳＡＭＤＣ的活性，以适应细胞对多胺需求的变化。
３．２ 犉犪犛犃犕犇犆基因５′ＵＴＲ具有２个ｕＯＲＦ
真核生物上游开放阅读框对基因翻译具有重要的调控作用，具有ｕＯＲＦ的大多数基因都属于调节基因。多
胺合成途径中的关键酶，如精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、腺苷甲硫氨酸脱羧酶以及亚精胺合成酶都具有
ｕＯＲＦ［１８］。植物犛犃犕犇犆基因５′ＵＴＲ中含有２个ｕＯＲＦ，分别是ｔｉｕＯＲＦ和ｓｍｕＯＲＦ，并且这２个ＯＲＦ有１
个碱基的重叠，这种重叠结构对于基因表达的影响机制目前还不清楚。大多数植物的犛犃犕犇犆基因具有非常保
守的ｓｍｕＯＲＦ，其编码产物含有４８～５４个氨基酸，同源性高达７５％～１００％［１９］。犛犃犕犇犆的ｕＯＲＦ在哺乳动物
中主要涉及翻译抑制的调控［２０，２１］，而在植物中通过转录或转录后调控确保犛犃犕犇犆基因正确的行使功能［２２］。去
除犛犃犕犇犆基因上游ｕＯＲＦ将导致植物体内多胺水平混乱，Ｓ腺苷甲硫氨酸含量增加超过４００倍，严重影响植物
的生长和发育［２３］。本研究克隆的犉犪犛犃犕犇犆基因的５′ＵＴＲ具有编码４８个氨基酸残基的ｓｍｕＯＲＦ，表明ｓｍ
ｕＯＲＦ可能对犉犪犛犃犕犇犆基因的转录和转录后调控也具有重要的作用，是维持高羊茅体内多胺动态平衡和正常
生长发育所必需的。
３．３ 犛犃犕犇犆基因受光调控，生物钟控制它的昼夜表达节律
四倍体小麦中，犛犃犕犇犆基因的表达具有昼夜节律，受生物钟控制［１２］。牵牛花（犘犺犪狉犫犻狋犻狊狀犻犾）暴露在光下１５
ｍｉｎ，叶片中犛犃犕犇犆基因的ｍＲＮＡ水平开始增加，持续暴露４５ｍｉｎ时，犛犃犕犇犆基因ｍＲＮＡ水平到达高峰，随
后急剧下降，这表明犛犃犕犇犆基因的表达受光快速调控，犛犃犕犇犆基因ｍＲＮＡ水平变化表明，犛犃犕犇犆基因的光
响应表达主要在转录水平上调控［１３］。利用放线菌素Ｄ估测了犛犃犕犇犆基因ｍＲＮＡ的半衰期大约为３０ｍｉｎ，这
是犛犃犕犇犆基因ｍＲＮＡ水平在光诱导下达到高峰后急剧下降的部分原因。将牵牛花暴露在红光、绿光、蓝光和
紫外光下，犛犃犕犇犆基因的ｍＲＮＡ水平增加，但暴露在远红光下却没有增加。红光下短时间的照射就使犛犃犕
犇犆基因的表达水平增加。但这种诱导能够被随后的远红光照射还原。开始用红光照射，然后马上用蓝光照射，
能够更大程度上增加犛犃犕犇犆基因的ｍＲＮＡ水平。这表明犛犃犕犇犆基因的光调控涉及到蓝光光受体和光敏色
素介导的途径，并且它的昼夜表达节律受生物钟控制［１４］。本研究从高羊茅中克隆的犉犪犛犃犕犇犆基因在长日照
７７１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
与短日照条件下，它的昼夜表达节律都是先出现表达高峰，然后急剧下降，表达模式相似，这说明它的表达受生物
钟控制，长日照条件下，高羊茅暴露在光下６．５ｈ才出现表达高峰，而短日照条件下０．５ｈ就出现表达高峰，这说
明短日照条件下，犉犪犛犃犕犇犆基因能够受光快速调控。这可能与实验中所选的植物材料在贵州这种独特生态区
域下的适应机制有关［２４２６］，因为实验中所用的材料为“黔草１号”高羊茅。它是从贵州当地野生高羊茅材料中选
育出的一个高羊茅品种，贵州是一个短日照地区，当地植物在这样的生境中长期进化，可能形成了适应短日照的
光周期机制，短日照能够快速调控犉犪犛犃犕犇犆基因的表达，而长日照反而使犉犪犛犃犕犇犆基因的表达钝化。
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犱犲犮犪狉犫狅狓狔犾犪狊犲犵犲狀犲犉犪犛犃犕犇犆犻狀狋犪犾犳犲狊犮狌犲
ＷＡＮＧＸｉａｏｌｉ，ＬＩＵＸｉａｏｘｉａ，ＷＡＮＧＳｈｕｙｉｎ，ＹＡＮＧＹｉｃｈｅｎｇ，ＷＵＪｉａｈａｉ
（ＧｕｉｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００６，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｗｅｓｃｒｅｅｎｅｄ５′ｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｗｈｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ５′ｅｎｄｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｏｆｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｇｅｎｅｆｒｏｍｔａｌｆｅｓｃｕｅ．Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄａｍｐｌｉｆｉｅｄ３′ｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄ
ｏｎｔｈｅ５′ｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅ，５′ｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ３′ｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅ
ｊｏｉｎｔｅｄ，ａＳＡＭＤＣｏｆｃＤＮＡｆｒｏｍｔａｌｆｅｓｃｕｅｈａｓｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ａｎｄｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ犉犪犛犃犕犇犆（ＧｅｎＢａｎｋ
Ａｃｃｓｓｓｉｏｎ：ＨＱ６０６１３９）．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ犉犪犛犃犕犇犆ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｐｒｏ
ｖｉｄｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｓｔｕｄｙｏｆ犉犪犛犃犕犇犆ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｄｕｒｉｎｇ２４ｈｏｕｒｓｉｎｌｏｎｇｄａｙｓａｎｄｓｈｏｒｔｄａｙｕｓｉｎｇ
ｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＴｈｅｃＤＮＡｏｆ犉犪犛犃犕犇犆ｉｓ１９６４ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈａｎｄｃｏｎｔａｉｎｓｔｈｒｅｅｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，ｔｉｎｙｕｐｓｔｒｅａｍＯＲＦ（２２６－２３４ｂｐ），ｓｍａｌｕｐｓｔｒｅａｍＯＲＦ（２３４－３８０ｂｐ），ｍａｉｎＯＲＦ（５５５－
１７４２ｂｐ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＭａｉｎＯＲＦｅｎｃｏｄｅｓａｐｒｏｔｅｉｎｏｆ３９５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｅｎｃｏｄｅｄｂｙ犉犪犛犃犕犇犆ｇｅｎｅｓｃｏｎｔａｉｎｔｗｏｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓ：Ｐｒｏｅｎｚｙｍｅｓｐｌｉｃｅｓｉｔｅｄｏｍａｉｎｓａｎｄｉｎｖｏｌｖｉｎｇ
ＳＡＭＤＣｐｒｏｔｅｉｎｒａｐｉｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎＰＥＳＴｄｏｍａｉｎ．ＦａＳＡＭＤＣｓｈｏｗｅｄａｃｌｏｓｅｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅ
ｋｎｏｗｎＳＡＭＤＣｏｆｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｒｅｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｅａｋｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｂｏｔｈｌｏｎｇｄａｙｓａｎｄｓｈｏｒｔ
ｄａｙｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ犉犪犛犃犕犇犆ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｅａｋｕｎｄｅｒｌｏｎｇｄａｙｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｕｎ
ｄｅｒｓｈｏｒｔｄａｙｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｐｅａｋｏｆ犉犪犛犃犕犇犆ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｕｎｄｅｒｓｈｏｒｔｄａｙｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｅａｒｌｉｅｒｓｅｖ
ｅｒａｌｈｏｕｒｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｌｏｎｇｄａｙｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔ犉犪犛犃犕犇犆ｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｄｗｉｔｈａｃｉｒｃａｄｉａｎ
ｒｈｙｔｈｍａｎｄｗａｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔａｌｆｅｓｃｕｅ；Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ
９７１第２０卷第４期 草业学报２０１１年