全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（２）：２２７ ２３３
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０２０２２７０７
ｍｉＲ３９６在落叶松体细胞胚胎中的功能研究
肖 霞１，张立峰２，齐力旺２，韩素英１
（１．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 １０００９１；
２．中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室，北京 １０００９１）
收稿日期：２０１５０６０４
基金项目：国家高技术研究发展计划（２０１３ＡＡ１０２７０４和２０１１ＡＡ１００２０３）、国家自然科学基金（３１３３００１７）
作者简介：肖霞（１９８９—），女，湖南娄底人，在读硕士研究生，从事树木生物技术研究，Ｅ－ｍａｉｌ：９４４３７５３８８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：教授，硕士生导师，主要研究方向：树木生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙｈａｎ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃｎ
摘要：［目的］探讨ｍｉＲ３９６在落叶松体细胞胚胎发生中的功能。以期该研究能为解决体胚发育中子叶畸形胚与生
根率低的问题提供新的视角，同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络做基础铺垫。［方法］构建 ｐｒｅｍｉＲ３９６
超表达载体，通过农杆菌介导侵染，将 ｐｒｅｍｉＲ３９６转入落叶松胚性细胞中，筛选稳定抗性细胞系。在 ＤＮＡ与 ＲＮＡ
水平上，对抗性细胞系进行的鉴定、检测，同时统计比对其与野生细胞系间发芽率、叶片数目以及生根率的差异。
［结果］在抗性细胞系基因组中，扩增出ＨＴＰ与 ｍｉＲ３９６的特异性片段，且无农杆菌 Ｖｉｒｇ基因片段。ＲＮＡ表达水平
上，抗性系ｐｒｅｍｉＲ３９６与ｍｉＲ３９６表达皆增加，而靶基因ＬａＧＲＦｓ的表达量下调。统计表明抗性系胚的发芽率、生根
率、叶片数目畸形率分别为７０．６０％、０．６０％、３７％，而野生型分别为９２．５０％、１０．５５％、４％，抗性系胚的发芽率、生根
率显著降低（Ｓｉｇ．＝０．０００），叶片数目畸形率显著增加（Ｓｉｇ．＝０．０００）。［结论］ｍｉＲ３９６在落叶松体细胞胚胎发生过
程中，可能通过负调节靶基因ＬａＧＲＦｓ的表达或者通过ＬａＧＲＦｓ影响与它相互作用的基因，参与体胚子叶原基细胞代
谢，从而影响了子叶与叶片的发育；通过负调节ＬａＧＲＦｓ或者其它与根部发育相关的靶基因，影响了根端分生区细胞
的活动，参与调控根的发育。
关键词：落叶松，体细胞胚胎，转基因，ｍｉＲ３９６，生长调节因子，发芽率，生根率，叶片数目
中图分类号：Ｓ７９１２２ 文献标识码：Ａ
ＦｕｎｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉＲ３９６ｉｎＳｏｍａｔｉｃＥｍｂｒｙｏｓｏｆＬａｒｉｘｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ
ＸＩＡＯＸｉａ１，ＺＨＡＮＧＬｉｆｅｎｇ２，ＱＩＬｉｗａｎｇ２，ＨＡＮＳｕｙｉｎｇ１
（１．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔＥｃｏｌｏｇｙ，ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍｉＲ３９６ｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＬａｒｉｘｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ，
ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｗｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｆｏｒｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｏｆａｂｎｏｒｍａｌｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅｍｂｒｙｏｓｏｃｃｕｒｉｎｇｉｎｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｌｏｗｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅ．Ｉｔｉｓａｌｓｏｐｒｏｐｏｓｅｄｔｏｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔ
ｗｏｒｋｏｆｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ａｐｒｅ－ｍｉＲ３９６ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏ
ｔｈｅｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｓｏｆＬ．ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓｔｈｒｏｕｇｈａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎｔｈｅｃｅｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｕｎｔｉｌｓｔａｂｌｅ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔｌｉｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｃａｒｉｅｄｏｕｔａｔｔｈｅＤＮＡａｎｄＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅｒａｔｅｏｆｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｒｏｏｔｉｎｇａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｌｅａｖｅｓｗｅｒｅａｌｓｏｃｏｌｅｃｔｅｄｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｅｌ
ｌｉｎｅｓａｎｄｗｉｌｄｌｉｎｅｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｌｉｎｅｓ，ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＨＴＰａｎｄｍｉＲ３９６ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｈｉｌｅｔｈｅ
ｖｉｒｇｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｎｏｔｏｂｔａｉｎｅｄ；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｐｒｅ－ｍｉＲ３９６ａｎｄｍｉＲ３９６ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓＬａＧＲＦｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅ，ｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅａｎｄｌｅａｆｎｕｍｂｅｒｓａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｒａｔｅｏｆ
ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｓｗｅｒｅ７０．６０％，０．６０％ ａｎｄ３７％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｏｎｔｒａｓｔｔｏ９２．５０％，１０．５５％ ａｎｄ４％ ｉｎ
ｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅｓ．Ｔｈｅｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｉｎｅｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅ
林 业 科 学 研 究 第２９卷
（Ｓｉｇ．＝０．０００），ａｎｄｇｒｅａｔｌｙｈｉｇｈｅｒｌｅａｆｎｕｍｂｅｒｓａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｒａｔｅ（Ｓｉｇ．＝０．０００）ｔｈａｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅｓ．［Ｃｏｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ］ＤｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆＬ．ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｉＲ３９６ｍｉｇｈｔｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｓｏ
ｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｃｅｌｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓＬａＧＲＦｓｏｒｔｈｒｏｕｇｈＬａ
ＧＲＦｓｔｏｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｇｅｎｅｓｉｎｔｅｒａｃｔｅｄ，ｓｏａｓｔｏｍａｋｅｅｆｅｃｔｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｎｄｂｌａｄｅ，ａｎｄａｌｓｏｂｙ
ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｔｈｅＬａＧＲＦｓｏｒｏｔｈｅｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｒｏｏｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｏｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｃｅｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｐ
ｉｃａｌｒｏｏｔａｎｄｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｒｏｏｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌａｒｉｘｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ；ｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｔｒａｎｓｇｅｎｏｓｉｓ；ｍｉＲ３９６；ｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ；ｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅ；ｌｅａｆｎｕｍｂｅｒ
落叶松（Ｌａｒｉｘｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓｓｐｐ．）主要分布于我国
北方、日本以及欧洲，它可生长在高纬度高海拔地
区［１］，是一种重要的速生、优生、造林树种［２］，但其
基因组庞大［３］、生长周期长以及难以扦插，这些大大
限制了它的繁育，而植物体细胞胚胎发生是有效解
决该问题的重要途径之一［４］。体细胞胚胎发生是指
已经分化的植物细胞，在激素的诱导下，脱分化成胚
性愈伤，再经历类似于合子胚的发育过程，生长发育
为成熟体胚，进而萌发为完整植株。然而在落叶松
体细胞胚胎发生过程中存在畸形胚发生率高、胚性
不稳定、生根率低等问题［５］，目前关于这方面的机理
研究还很有限，因此，亟需更多的研究数据来阐明其
发育机制。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是生物体内一段２１ ２４ｎｔ
的非编码小ＲＮＡ分子，可对基因进行转录后表达水
平的调控，它在动植物胚胎发育［６］、细胞增殖［７］、分
化与死亡［８］等方面都发挥着重要作用，因此，推测其
在落叶松体细胞胚胎发育中也可能扮演着同样重要
的角色。
本实验室张等［５］以落叶松体胚为材料，构建小
ＲＮＡ文库，鉴定了８３个不同发育阶段中保守 ｍｉＲ
ＮＡｓ，发现其中ｍｉＲ３９６在拟南芥、水稻、落叶松等１５
种植物中都具有高度保守性。研究表明，ｍｉＲ３９６通
过负调节靶基因ｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＧＲＦ）的表
达，对子叶与叶片的发育起重要的调控［９－１１］。
Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ等［１２］发现Ａｔｇｒｆ５突变体表现出叶片窄小，
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ［１３］的研究中表明 ｍｉＲ３９６与 ＧＲＦｓ共同调
控着叶片细胞的数目。过表达 ｍｉＲ３９６植株除有茎
端分生组织（ＳＡＭ）、叶片窄小等现象［９－１１］，还出现
顶端优势受到抑制现象，侧芽发育增强，叶片数增加
等状况［１４］。
最近的研究表明 ｍｉＲ３９６还参与了根细胞的发
育。过表达 ｍｉＲ３９６ａ植株根部短小［１５－１６］。拟南芥
根部受胞囊线虫侵染时，ＭｉｃｒｏＲＮＡ３９６ＧＲＦ１／ＧＲＦ３
调控模块扮演发育调节因子，重新编排根细胞程
序［１７－１８］。因此，我们猜测 ｍｉＲ３９６在落叶松体胚发
育中可能也有类似的功能，参与调控子叶与根的发
育。基于此，本研究构建了 ｍｉＲ３９６超表达载体，通
过农杆菌介导侵染，将其转入落叶松胚性细胞系中，
对ｍｉＲ３９６进行功能探讨，以期该研究能为解决体胚
发育中子叶畸形胚与生根率低的问题提供新的视
角，同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络
做基础铺垫。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本实验以日本落叶松胚性细胞系 Ｓ２８７作为实
验材料。将生长继代培养基上的胚性细胞（约 １６
天）夹碎置于液体培养基中，２５±２℃ 暗培室，１００ｒ
·ｍｉｎ－１进行悬浮培养。每７天，继代与扩大培养一
次；ｐＳｕｐｅｒ１３００＋表达载体（中国农业大学杨淑华教
授赠予），带有 ３５Ｓ启动子驱动潮霉素磷酸转移酶
（ＨＴＰ）抗性筛选基因；农杆菌菌株 ＧＶ３１０１，具有庆
大霉素与利福平抗性。
１．２ 实验方法
１．２．１ 表达载体构建 将 ｐｒｅｍｉＲ３９６片段转入载
体超表达ｍｉＲ３９６，而为了防止前体序列的识别与剪
切，选择在前体序列两端各２００ｂｐ左右的长度设计
酶切位点。因此，先需对已知的 ｐｒｅｍｉＲ３９６序列进
行ＲＡＣＥ反应。
（１）总 ＲＮＡ提取：各个时期的总 ＲＮＡ参照
ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ和 ＲＮＡｉｓｏｍａｔｅｆｏｒＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅｋｉｔｓ（宝
生物，日本）说明书提取，并于ＮＤ１０００检测ＲＮＡ的
纯度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８ ２．０适宜）以及浓度。
（２）５’ｃＤＮＡ与３’ｃＤＮＡ合成：各时期的 ＲＮＡ
等量混合，根据 ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）说明书分别合成５’ｃＤＮＡ
与３’ｃＤＮＡ。
８２２
第２期 肖 霞，等：ｍｉＲ３９６在落叶松体细胞胚胎中的功能研究
（３）根据已有 ｐｒｅｍｉＲ３９６序列设计引物，进行
ＲＡＣＥ反应，转化，测序，拼接。
（４）根据扩增得到的全长序列，在 ｐｒｅｍｉＲ３９６
两端各２００ｂｐ左右设计带有酶切位点的引物：Ｈｉｎｄ
ＩＩ：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧ；Ｋｐｎ
Ｉ：ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＡＴＡＣＴＡ。经验证
为目地片段后与表达载体同时进行双酶切，将切下
的目的片段插入 ｐＳｕｐｅｒ１３００＋表达载体（３５Ｓ启动
子）多克隆位点构成重组质粒。再将重组质粒转入
农杆菌ＧＶ３１０１中，获得转化工程菌并保存。
１．２．２ 农杆菌介导的遗传转化 农杆菌介导的落
叶松体细胞的遗传转化方法是在已有的实验基
础［１９－２０］，稍加改进。
（１）各培养基的配置与材料的培养：参照李水
根［２０］，其中 Ｓ２、Ｓ３培养基中头孢浓度改为 ６００ｍｇ
·Ｌ－１。
（２）农杆菌菌液的准备：首先将保存于 －８０℃
的农杆菌工程菌进行活化，挑取单菌落并验证后，加
入含有三种抗生素（卡那霉素、庆大霉素、利福平各
５０ｍｇ·Ｌ－１）的ＹＥＢ液体培养基中扩大培养，２８℃，
２００ｒ·ｍｉｎ－１，过夜培养。生长至ＯＤ６００＝０．４ ０．６
时，在超净台中用５０ｍＬ无菌离心管收集，每管３０
ｍＬ菌液。４０００ｒ·ｍｉｎ－１，室温，离心１０ｍｉｎ。倒掉
上清液，用６ｍＬＹ１［２０］重悬，轻轻吹打均匀备用。
（３）转化与共培养：①将悬浮培养的细胞过滤
并用滤纸吸干残留培养液，均匀平铺在Ｓ１［２０］培养基
上②将灭菌并烘干的滤纸（滤纸半径与培养皿一
样）用重悬菌液全部浸湿，至夹起刚好不滴菌液状即
可③将被菌液浸湿的滤纸片平铺在细胞上，轻轻压
服滤纸片，尽量都贴附在细胞上④将培养皿置于暗
培室，２５℃共培养２天，此时可见滤纸片上细菌呈水
渍状。
（４）脱菌：弃滤纸片，将培养板上的细胞（约 １
ｇ）夹入装有２００ｍＬ无菌水的三角瓶中，反复摇匀，
清洗２ｍｉｎ，用筛子（３００目，已灭菌）过滤，将收集
到的细胞重新放入加有无菌水的锥形瓶中，再次清
洗。重复５次，至上层溶液清澈无浑浊状。
（５）恢复培养：用滤纸将收集到的细胞的残留
水吸干，镊子轻轻夹取，均匀将其接种在 Ｓ２［２０］培养
基上，暗培室，２５℃，培养７天。若脱菌不成功，此步
骤时细胞将会被农杆菌污染。
（６）抗性筛选：将经过恢复培养后且没有被农
杆菌污染的细胞转移至筛选培养基 Ｓ３［２０］上进行抗
性筛选，至长出白色健康细胞，再将这些细胞转接到
新的筛选培养基上（至少筛选两代）至抗性稳定。
１．２．３ 抗性细胞系的分子检测
（１）ＰＣＲ检测：①基因组 ＤＮＡ提取：按照植物
基因组ＤＮＡ提取试剂盒（鼎国，北京）说明书进行②
设计引物（表１）进行 ＨＴＰ、目的基因 ｍｉＲ３９６、Ｖｉｒｇ
基因检测并测序。其中目的基因的特异性引物（位
于载体上，但跨目的片段），而 Ｖｉｒｇ基因位于 ＴＤＮＡ
之外，可用来检测农杆菌是否污染。
表１ ＨＴＰ，ｍｉＲ３９６与Ｖｉｒｇ引物表
引物 序列 （５’
"
３’）
ＨＴＰＦ： ＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＣＴＣＧＴＡＴ
ＨＴＰＲ： ＡＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴ
ＰＦ ＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＡＴＧＣ
ＰＲ ＣＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＴＧＡＴＴＡＴ
ＣＶｉｒＦ ＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴ
ＶｉｒＲ ＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣ
（２）ｑＲＴＰＣＲ检测：①总ＲＮＡ的提取：同１．２．１
②反转录 ｃＤＮＡ的合成：按照 ＤＮａｓｅ（Ｌｉｔｈｕａｎｉａ，
ＥＵ）说明书进行基因组 ＤＮＡ消化。然后按照反转
录试剂盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）进行 ＲＮＡ反转录，按照 ｍｉＲ
ｃｕｔｅｍｉＲＮＡｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（天根，北京）说明书
进行ｍｉＲＮＡ的反转录③ｑＲＴＰＣＲ检测于 ＣＦＸ９６ＴＭ
ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＲＡＤ，ＵＳＡ）进
行。ＬａＧＲＦｓ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＫＭ０００７２
ｔｏＫＭ０００７４）与 ＰｒｅｍｉＲ３９６的 ｑＲＴＰＣＲ检测按照
试剂盒 ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑｋｉｔ（宝生物）进行，
ＬａＥＦ１Ａ１［２１］为 ＬａＧＲＦｓ检测内参基因，ＥＦ１［５］为
ＰｒｅｍｉＲ３９６检测内参基因。为了确保 ｍＲＮＡｓ没有
被切割，所有的引物都跨 ｍｉＲ３９６结合位点的两侧，
定量引物如表 ２，每个样品重复 ４次，取平均值。
ｍｉＲ３９６的ｑＲＴＰＣＲ检测按照试剂盒 ｍｉＲｃｕｔｅｍｉＲ
ＮＡｑＲＴＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（天根）操作。ｍｉＲ３９６的
正向引物是基于ｍｉＲ３９６自身序列设计（表２），反向
引物为试剂盒提供，５．８ｓｒＲＮＡ［５］做为内参基因，每
个样品重复４次，取平均值。
１．２．４ 抗性细胞系胚的发芽率、生根率以及叶片数
目统计 将约 ２００个的发育成熟的体细胞胚胎，
４℃，暗培养７天。然后接种于生根培养基上，２５℃，
光照（１６ｈ／８ｈ）培养［２０］，２０天后进行发芽统计，并
随机选取１００个发芽胚，进行叶片数目统计；４５天
后生根统计。用ＳＰＳＳ软件进行数据分析。
９２２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
表２ ｑＲＴＰＣＲ用到的引物
引物 序列 （５’
"
３’） 用途
ｑＬａＧＲＦ１Ｆ ＧＣＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＡＴＧＣ ＬａＧＲＦ１实时定量
ｑＬａＧＲＦ１Ｒ ＡＧＧＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＡＴＡＴ ＬａＧＲＦ１实时定量
ｑＬａＧＲＦ２Ｆ ＣＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧＧＴＡＡＧＡ ＬａＧＲＦ２实时定量
ｑＬａＧＲＦ２Ｒ ＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡ ＬａＧＲＦ２实时定量
ｑＬａＧＲＦ３Ｆ ＡＡＣＡＧＡＣＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＧ ＬａＧＲＦ３实时定量
ｑＬａＧＲＦ３Ｒ ＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＧＧＧＣ ＬａＧＲＦ３实时定量
ＬａＥＦ１Ａ１Ｆ ＧＡＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧ 内参基因
ＬａＥＦ１Ａ１Ｒ ＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴ 内参基因
３Ｆ： ＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧ ＰｒｅｍｉＲ３９６实时定量
３Ｒ： ＣＣＴＧＴＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＧ ＰｒｅｍｉＲ３９６实时定量
ＥＦ１Ｆ ＴＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＣＣ 内参基因
ＥＦ１Ｒ ＣＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＣ 内参基因
ＭｉＲ３９６ ＣＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＡＡＣＴＴＡ ｍｉＲ３９６实时定量
２ 结果与分析
２．１ 表达载体的构建
通过 ＲＡＣＥ技术，拼接获得８１６ｂｐｐｒｅｍｉＲ３９６
及其侧翼序列。在此序列的基础上构建了 ｍｉＲ３９６
的表达载体（前体序列两端各约２００ｂｐ处）。并通
过ＰＣＲ扩增、转化、测序确定为目的片段（图１）。
注：Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；ＭｉＲ３９６为目的片段
图１ 表达载体中ｍｉＲ３９６的扩增电泳图
２．２ 抗性细胞系的分子检测
２．２．１ 抗性材料基因组 ＰＣＲ检测 对 ＨＴＰ，目的
基因 ｍｉＲ３９６，Ｖｉｒｇ三个基因进行了 ＰＣＲ扩增。在
抗性材料中得到了ＨＴＰ与目的基因 ｍｉＲ３９６的特异
性片段（图２ａ，２ｂ），且测序确认为目的片段。而农
杆菌Ｖｉｒｇ基因片段只在加有农杆菌菌液的样品中出
现（图２ｃ）。
２．２．２ 抗性材料的 ｑＲＴＰＣＲ检测 为了检测抗性
细胞系的ｍＲＮＡ表达水平，分别采用野生型与抗性
材料的胚性组织，进行 ＲＮＡ提取，ｃＤＮＡ反转录，对
ｐｒｅｍｉＲ３９６、ｍｉＲ３９６以及靶基因ＬａＧＲＦｓ进行表达分
析，结果如图３。从图中可看出，在转基因细胞中，
ｐｒｅｍｉＲ３９６与 ｍｉＲ３９６的表达明显上调，而靶基因
ＬａＧＲＦｓ的表达则下调。
２．３ 抗性细胞系的表型分析
将抗性细胞系与野生型细胞系的体细胞胚转接
于生根培养基上，各约２００个，２０天，统计二者的发
芽情况，从中随机选取１００个发芽的胚，统计其叶片
数目。４５天，统计生根个数。结果如表３，表４。野
生型系胚的发芽率、生根率以及叶片数目畸形率分
别为９２．５０％、１０．５５％、４％，而抗性细胞系胚表现出
低的发芽率（７０．６０％）与生根率（０．６０％），以及高
的叶片数目畸形率（３７％）。
３ 讨论
裸子植物由于其生长周期长，基因组大（１８
３５Ｇ）［３］，且缺乏合适的转化研究体系，加之其遗传
操作困难，因此，关于ｍｉＲ３９６的功能研究，虽已在被
子植物中研究比较广泛，而在裸子植物中仍未见报
道，本研究首次在裸子植物对 ｍｉＲ３９６进行功能
探究。
注：Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；Ｇ１：抗性细胞系；ＣＫ＋：对照细胞系；ＧＶ：农杆菌液；ＣＫ：ｄｄＨ２Ｏ
ａ：ＨＴＰ扩增电泳图；ｂ：ｍｉＲ３９６扩增电泳图（引物跨载体与目的基因）；ｃ：农杆菌Ｖｉｒｇ扩增电泳图
图２ 抗性材料的ＰＣＲ扩增电泳图
０３２
第２期 肖 霞，等：ｍｉＲ３９６在落叶松体细胞胚胎中的功能研究
表３ 生长２０天的发芽率与生长４５天的生根率
细胞系 接种胚数／个 发芽率／％ Ｓｉｇ．（２ｔａｉｌｅｄ） 生根率／％ Ｓｉｇ．（２ｔａｉｌｅｄ）
Ｓ２８７ １９９ ９２．５０ －－－－ １０．５５ －－－－
Ｇ２８７ １６７ ７０．６０ ０．０００ ０．６０ ０．０００
表４ 生长２０天（生根培养基）的叶片数目统计
叶片数目／片
０ ３ ４ １０ ＞１０ 畸形率 Ｓｉｇ．（２ｔａｉｌｅｄ）
所占比例／％
Ｇ２８７ ３６ ６３ １ ３７ －－－－
Ｓ２８７ ４ ９６ ０ ４ ０．０００
在课题组已有的优良再生体系与较成熟的转化
条件上［１９－２０］，构建了ｍｉＲ３９６过表达载体，通过农杆
菌介导侵染，成功将 ｍｉＲ３９６转入落叶松体细胞胚
中，获得到１个稳定抗性细胞系。利用 ＰＣＲ技术，
对其基因组进行检测，发现在抗性细胞系中含有抗
性筛选标记基因ＨＴＰ与目的基因 ｍｉＲ３９６的特异性
片段，而农杆菌Ｖｉｒｇ基因片段仅在加有农杆菌菌液
的样品中获得，故而基本排除农杆菌污染，确定为转
基因阳性系。利用ｑＲＴＰＣＲ，在ＲＮＡ水平上对抗性
系进行检测，结果表明，抗性细胞中 ｐｒｅｍｉＲ３９６与
ｍｉＲ３９６的表达量皆增加，而ＬａＧＲＦ１，ＬａＧＲＦ２和Ｌａ
ＧＲＦ３的表达明显则下降，这暗示 ｍｉＲ３９６的过表达
抑制了 ＬａＧＲＦｓ的表达。而关于 ｍｉＲ３９６负调节
ＧＲＦ的研究已有很多报道［９－１０，２２－２４］。
为进一步探究 ｍｉＲ３９６的功能，我们对 ｍｉＲ３９６
过表达细胞系胚的发芽、生根以及叶片数目进行了
统计，结果显示，相比野生型，过表达ｍｉＲ３９６细胞系
胚表现出低的发芽率与生根率，以及高的叶片数目
畸形率。
ＭｉＲ３９６如何影响体胚的发芽、生根以及叶片数
目？被子植物中的研究表明，ｍｉＲ３９６过表达植株出
现子叶融合、茎端分生组织（ＳＡＭ）缺失等表型［５］。
ｍｉＲ３９６过表达，抑制 ＧＲＦ的表达［９－１１，１３，１６，１８，２４］，而
ＧＲＦ与 ＧＲＦｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＧＩＦ）协同作用，影响
叶片细胞数量［１０，１２］或者细胞大小［２５］，ｇｒｆ突变体表
现出叶片窄小等现象。杨［１４］等发现过表达 ｍｉＲ３９６
植株出现顶端优势受抑制现象，侧芽发育明显增强，
叶片数比野生型明显增加。由此推测，ｍｉＲ３９６可能
类似于被子植物中的作用机制，通过负调节靶基因
ＬａＧＲＦｓ的表达或者通过ＬａＧＲＦｓ影响与它相互作用
的基因，参与体胚子叶原基细胞代谢，从而影响了子
叶与叶片的发育。
而关于根部的发育调节，Ｋｉｍ［２５］等发现 ＧＲＦ在
拟南芥根端有明显表达。Ｂａｚｉｎ［２６］等发现ｍｉＲ３９６在
图３ 转ｐＳｕｐｅｒ：：ｍｉＲ３９６胚性细胞中ｐｒｅｍｉＲ３９６、
ｍｉＲ３９６与ＬａＧＲＦｓ的表达分析
蒺藜苜蓿根尖有强烈表达，且影响了蒺藜苜蓿根端
分生组织分裂细胞的数目。水稻中，ＧＲＦ过表达，抑
制ＫＮＯＴＴＥＤ１ＬＩＫＥＨＯＭＥＯＢＯＸ基因的表达，引起
１３２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
水稻分生组织活动异常［２７］。玉米根尖细胞受胁迫
时，可能通过ｍｉＲＮＡ３９６调节抑制主根的伸长，促进
不定根的形成［２８］。拟南芥根部受胞囊线虫侵染时，
ＭｉｃｒｏＲＮＡ３９６ＧＲＦ１／ＧＲＦ３调控模块扮演发育调节
因子，重新编排根细胞程序［１７－１８］。Ｂａｏ等［１６］在拟南
芥中发现 ｍｉＲ３９６的另外一个靶基因 ＢＡＳＩＣＨＥＬＩＸ
"
ＬＯＯＰ
"
ＨＥＬＩＸｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ７４（ｂＨＬＨ７４），
在过表达 ｍｉＲ３９６ａ植株中，ＧＲＦ与 ｂＨＬＨ７４的表达
量皆下降，且植株根部短小，与 ｂＨＬＨ７４突变体表型
一样，推测 ｍｉＲ３９６可能通过抑制 ｂＨＬＨ７４的表达，
从而促进拟南芥根部的生长。因此，在落叶松体胚
发育中，ｍｉＲ３９６可能通过负调节 ＬａＧＲＦｓ或者其它
与根部发育相关的靶基因，影响了根端分生区细胞
的活动，参与调控根的发育。
４ 结论
本研究暗示ｍｉＲ３９６通过负调节靶基因 ＬａＧＲＦｓ
调节体胚子叶与根的发育，这为解决体胚子叶异常
与生根率低的问题提供新的视角，靶基因的过表达
或者ｍｉＲ３９６的低表达有可能改善畸形胚与生根率
低问题。这既对体胚的培育、应用有一定的参考价
值，也为深入研究体胚发育的分子机制奠定了基础。
由于落叶松转化周期长，且转化效率较低，很多相关
调控机制还不清楚，因此具体的作用方式，还需进一
步研究证明。
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２３２
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%
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ＮＡ３９６ｍｅｄｉａｔｉｎｇｐｉｓｔｉｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓ
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ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｌｅａｆａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｇｒｏｗｔｈｉｎＡｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００３，３６（１）：９４－１０４．
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ｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｏｔｍｅｒｉｓｔｅｍａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｌｅｇｕｍｅＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ
［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，７４（６）：９２０－９３４．
［２７］ＫｕｉｊｔＳＪＨ，ＧｒｅｃｏＲ，ＡｇａｌｏｕＡ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ
ＧＲＯＷＴＨＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧＦＡＣＴＯＲａｎｄＫＮＯＴＴＥＤ１ＬＩＫＥＨＯ
ＭＥＯＢＯＸＦａｍｉｌｉｅｓｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒｓ［Ｗ］［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ
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ＮＡｓａｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｄａｐｔａｔｉｏｎｓｉｎｍａｉｚｅｒｏｏｔｃｅｌｓ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆＢｏｔａｎｙ，
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（责任编辑：张 研）
３３２