全 文 ：书镉胁迫对白三叶的富集能力、叶片
显微结构及其生理特性的影响
韩宝贺，朱宏
（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 黑龙江省植物分子生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨１５００２５）
摘要：以白三叶为试验材料，对其进行不同浓度Ｃｄ２＋（０，１００，２００，３００，４００，５００μｍｏｌ／Ｌ）胁迫７ｄ，结果表明，随
Ｃｄ２＋浓度增加，白三叶各营养器官Ｃｄ积累量随之升高，各器官对Ｃｄ的富集能力表现为：根＞叶＞茎；同时，富集
在叶片部分的Ｃｄ对白三叶叶片产生了毒害作用，使叶肉细胞的细胞壁着色加深，栅栏组织细胞以及海绵组织细胞
的形状、大小及细胞排列的疏密程度发生改变。Ｃｄ２＋胁迫后，白三叶叶片叶绿素含量显著降低（犘＜０．０５），叶片的
ＭＤＡ含量呈上升趋势，且与Ｃｄ２＋浓度之间存在剂量效应关系；整个胁迫过程中，ＳＯＤ，ＰＯＤ和ＣＡＴ活性则呈先升
高后降低的趋势。相关性分析结果表明，Ｃｈｌａ和Ｃｈｌｂ含量与Ｃｄ２＋浓度间呈极显著负相关；ＭＤＡ含量与Ｃｄ２＋浓
度间呈极显著正相关；ＳＯＤ，ＰＯＤ，ＣＡＴ之间呈极显著正相关，三者发挥协同作用以抵抗逆境毒害，体现了白三叶
对重金属Ｃｄ的适应性。
关键词：镉胁迫；白三叶；重金属富集；显微结构；生理特性
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．２０１；Ｑ９４５．７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０６０１６７０９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０６２１
近年来，随着经济和工农业生产的飞速发展，工业“三废”排放量日益增加，农业生产中化肥和农药的过量喷
施，以及城市建设进程的进一步加快，使得重金属污染愈加严重［１］，其中，尤属镉土壤污染最为严重。镉（Ｃｄ）是
生物生长发育的非必需元素，具较高毒性且极易被吸收，其本身具有高移动性和高毒害性，极小浓度即可产生极
大毒害，被认定是危害最严重的重金属污染物［２］。我国受重金属Ｃｄ污染的草地及耕地面积超过２０００万ｈｍ２，
这不仅严重影响了作物的产量，且进入土壤环境中的Ｃｄ离子，一旦积累在植物的可食用部位，便通过食物链影
响到人类健康，会导致神经和肾功能异常，骨骼病变，并能引发骨痛病、肺气肿、高血压等多种疾病，因而重金属污
染问题日益突出［３］。
白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）属于豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）车轴草属（犜狉犻犳狅犾犻狌犿），又称白花苜蓿，白车轴草，具有优
良的牧草品质，产量高，生长适应性强，过去多作为牧草栽培［４］。由于白三叶具有分枝多，根系发达，生物量大，再
生速度快，适应性强，成坪迅速等优点，使其成为观赏型草坪和绿地建植的主要草种。最主要的是，在实际应用
中，白三叶已经被证明在重金属污染土壤中具有良好的修复效果［５］，但当细胞内的重金属离子超过一定阈值时，
细胞结构便会产生一定的损伤。结构是功能的基础，结构变化是植物一系列生理活动异常的细胞学基础［６］，因
此，研究植物受重金属毒害后，细胞结构的变化，以及Ｃｄ２＋胁迫对白三叶生理生化的影响，可以从细胞学上揭示
重金属毒害白三叶的机理，从生理学上阐述白三叶通过生理生化反应缓解Ｃｄ毒害的科学依据，对于开展白三叶
抗重金属耐性机制的研究具有应用价值。
目前，关于白三叶的研究主要集中在抗逆性（盐碱胁迫、干旱胁迫、高温胁迫）、化感作用，也有对其在植物修
复中可能发挥的作用进行探讨［７９］。Ｃｄ２＋胁迫白三叶的研究更是处于对种子及幼苗的抗性进行研究的初级阶
段［１０］，系统地阐述白三叶对Ｃｄ富集能力以及Ｃｄ２＋胁迫对白三叶显微结构及其生理特性的影响，尚未见报道。
本试验模拟不同浓度Ｃｄ２＋对白三叶的胁迫，通过测定白三叶地上部分和地下部分的Ｃｄ含量，比较不同浓度
第２３卷 第６期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１６７－１７５
２０１４年１２月
收稿日期：２０１４０６０９；改回日期：２０１４０７１８
基金项目：黑龙江省重点实验室课题（ＺＫ２０１２１２）和黑龙江省研究生创新科研资金项目（ＹＪＳＣＸ２０１２１６２ＨＬＪ）资助。
作者简介：韩宝贺（１９８８），男，黑龙江大庆人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：Ａ１５９０４５９４０４９＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕｈｏｎｇ１００００＠１６３．ｃｏｍ
Ｃｄ２＋处理下，白三叶对Ｃｄ的吸收能力和转运能力，从而为白三叶富集Ｃｄ潜力的评价提供基础数据；比较Ｃｄ２＋
胁迫下叶细胞显微结构的异同，并研究了白三叶在Ｃｄ２＋胁迫后的生理响应，以期探讨白三叶抗Ｃｄ的耐性机制。
１ 材料与方法
１．１ 材料培养及处理
参照《牧草种子检验规程》ＧＢ／Ｔ２９３０．４２００１系列国家标准［１１］，确定２５℃为白三叶种子的适宜萌发温度，恒
温培养箱无光照条件下发芽。萌发后，播种于培养钵（高２０ｃｍ、底径１５ｃｍ、口径２０ｃｍ）中，基质为蛭石∶细
砂＝１∶１混合而成，每盆１５株，共６０盆，用Ｈｏａｇｌａｎｄ完全营养液定时定量浇灌培养，期间各项管理措施一致，在
温室中培养３０ｄ，待植物幼苗长出３片真叶，进行Ｃｄ２＋处理。试验于２０１３年１０月至２０１４年３月进行。
１．２ 试验方法
１．２．１ 试验设计 采用室内盆栽试验，模拟Ｃｄ胁迫。Ｃｄ２＋以溶液形式加入到培养钵中，重金属离子浓度依据
中华人民共和国国家土壤环境质量标准（ＧＢ１５６１８２００８）３级土壤环境标准量进行配制，Ｃｄ２＋浓度梯度分别为
１００，２００，３００，４００，５００μｍｏｌ／Ｌ，每个梯度均采用 Ｈｏａｇｌａｎｄ完全培养液配制而成，同时设置对照处理，对照组施
以Ｈｏａｇｌａｎｄ完全培养液，处理时间为７ｄ。
１．２．２ 植物体含Ｃｄ量测定 重金属测定采用原子吸收光谱仪（ＴｈｅｒｍｏＩＣＥ３０００），采集待测白三叶的地下和
地上（茎和叶）部分，自来水冲洗以去除粘附于植物样品上的蛭石和细砂，再用去离子水冲洗２～３次，沥去水分，
在１０５℃下杀青３０ｍｉｎ后于７０℃烘箱中烘至恒重，烘干后样品用陶瓷研钵研碎，洁净密封保存。测定方法按照
黄朝表等［１２］及ＧＢ／Ｔ１７１４１１９９７方法测定［１３］，同时配制空白试剂作为对比，数据为３次重复的平均值。
１．２．３ 叶片显微结构观察 采集待测白三叶的叶片，用含７０％酒精的ＦＡＡ固定液固定，固定时间均为２４ｈ以
上。然后根据Ｆｅｄｅｒ和 Ｏ’Ｂｒｉｅｎ的方法［１４］，将材料置于乙二醇甲基丙烯酸酯（ＧＭＡ）中渗透３次，前２次各为
１ｄ，第３次不少于５ｄ，然后将装有材料和ＧＭＡ的胶囊，于６０℃温箱聚合２４ｈ，用ＬｅｉｃａＵｌｔｒａｌｃｕｔＲ切片，厚度
为２～３μｍ。切片采用高碘酸Ｓｃｈｉｆｆ试剂／甲苯胺蓝（ＰＡＳ／ＴＢＯ）法染色
［１５］，烘干切片，加拿大树脂封片。装片
经ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５３显微镜观察，ＯｌｙｍｐｕｓＤＰ２６照相。
１．２．４ 生理指标测定 待测生理指标的测定方法依次为：丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）采用硫代巴比妥酸
法测定［１６］，超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性采用 ＮＢＴ还原法测定［１７］，过氧化物酶（ｐｅｒｏｘｉ
ｄａｓｅ，ＰＯＤ）活性采用愈创木酚比色法测定［１８］，过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）活性采用紫外吸收法测定［１９］。各处
理组的生理指标均重复测定３次。
１．３ 统计分析
所有数据用Ｅｘｃｅｌ２００３和ＳＰＳＳ１７．０软件制表和统计学分析。主要分析指标计算方法为：１）转运系数＝植
物地上部分元素的含量／地下部分同种元素含量。２）根系对重金属的滞留率（％）［２０］＝［（地下部分重金属含量－
地上部重金属含量）／地下部分重金属含量］×１００。
２ 结果与分析
２．１ 不同浓度Ｃｄ２＋对白三叶Ｃｄ含量和转运系数的影响
从表１可见，各器官（根、茎和叶部）对Ｃｄ的吸收能力有较大差别。总体而言，同一浓度时，各器官对Ｃｄ元
素的富集量差异显著，对Ｃｄ的富集能力表现为：根＞叶＞茎；相同器官的Ｃｄ含量，随着Ｃｄ２＋浓度的增加，呈先
上升后趋于平稳的趋势。１００μｍｏｌ／Ｌ与对照组相比，地下和地上部分的Ｃｄ富集含量均急剧增加，增幅分别为
１２３．８％和４０．４％。当Ｃｄ２＋浓度达到４００μｍｏｌ／Ｌ时，地下和地上部分（指茎和叶部）Ｃｄ含量增幅减缓，基本持
平。本试验中，白三叶地下和地上部分的Ｃｄ富集量均在５００μｍｏｌ／Ｌ时，达到最大，分别为３．４９０和０．９１０
ｍｇ／Ｌ，地下部分吸收能力大于地上部分，且不同Ｃｄ２＋浓度之间Ｃｄ富集量差异显著（犘＜０．０５）。
转运系数（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＴＦ）表征植物将重金属由根部转移到地上部的能力，可间接衡量植物对重金
属的耐性［２１］。由表１可知，白三叶不同营养器官之间显示出了较大差别。本试验中，胁迫浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ
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时，ＴＦ最高（平均值为０．３１３），表明此浓度时，根部具有较强的Ｃｄ转移能力。胁迫浓度为２００，３００，４００和５００
μｍｏｌ／Ｌ的ＴＦ分别为０．２０２，０．２３４，０．２６２，０．２６１，差异不显著。
２．２ 不同浓度Ｃｄ２＋对白三叶叶片显微结构的影响
对照组白三叶叶片（图１Ａ）的上、下表皮均由１层细胞组成，上表皮细胞较大，下表皮细胞较小，细胞排列紧
密。栅栏组织由单层长柱状细胞排列而成，排列较为紧密。海绵组织细胞为圆形或椭圆形，较稀疏。
表１ 白三叶植株体对重金属的富集情况
犜犪犫犾犲１ 犆犱犮狅狀狋犲狀狋，狋狉犪狀狊犾狅犮犪狋犻狅狀犳犪犮狋狅狉犪狀犱狉狅狅狋狉犲狋犲狀狋犻狅狀狉犪狋犲犻狀犜．狉犲狆犲狀狊
Ｃｄ２＋浓度
Ｃｄ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（μｍｏｌ／Ｌ）
Ｃｄ含量Ｃｄｃｏｎｔｅｎｔ（ｍｇＦＷ／Ｌ）
地下部分Ｕｎｄｅｒｇｒｏｕｎｄ
根 Ｒｏｏｔｓ
地上部分Ａｂｏｖｅｇｒｏｕｎｄ
茎Ｓｔｅｍｓ 叶Ｌｅａｖｅｓ
转运系数
Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ
根系滞留率
Ｒｏｏｔｒｅｔｅｎｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（％）
０ ０ａ ０ａ ０ａ ０ａ ０
１００ １．２３８±０．１３４ｂ ０．０４１±０．０１４ｂ ０．３６３±０．０１０ｂ ０．３１３±０．０５６ｄ ７５．３９
２００ ２．２９０±０．０９９ｃ ０．０６６±０．００８ｃ ０．３９７±０．０１２ｃ ０．２０２±０．０１０ｂ ８３．１８
３００ ２．６０１±０．３７０ｃ ０．０７８±０．０１２ｃ ０．５２４±０．０１５ｄ ０．２３４±０．０２７ｂｃ ８１．２１
４００ ３．４７４±０．２９７ｄ ０．０８５±０．００５ｄ ０．８２１±０．００３ｅ ０．２６２±０．０２２ｃｄ ７９．３２
５００ ３．４９０±０．２７１ｄ ０．０８７±０．００２ｄ ０．８２３±０．０２１ｅ ０．２６１±０．０２１ｃ ７９．３１
注：表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５），下同。
Ｎｏｔｅ：Ｄａｔａｉｎｔｈｅｔａｂｌｅｉｎｄｉｃａｔｅｍｅａｎ±ＳＤ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５），ｔｈｅｓａｍｅｂｅ
ｌｏｗ．
图１ 白三叶不同犆犱２＋胁迫下叶片的形态特征
犉犻犵．１ 犜犺犲犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳狋犺犲犾犲犪狏犲狊狅犳
犜．狉犲狆犲狀狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犆犱２＋狊狋狉犲狊狊
Ａ～Ｆ：０，１００，２００，３００，４００，５００μｍｏｌ／ＬＣｄ２＋浓度胁迫下的白三叶
叶片（横切）结构 Ｔｈｅｌｅａｖｅｓ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｓｅｃｔｉｏｎ）ｏｆ犜．狉犲狆犲狀狊ｕｎｄｅｒ
Ｃｄ２＋ｓｔｒｅｓｓｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ０，１００，２００，３００，４００，５００
μｍｏｌ／Ｌ．ｅｐ：上表皮 Ｅｐｉｃｕｔｉｃｌｅ；ｈｙ：下表皮 Ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ；ｐｔ：栅栏组
织Ｐａｌｉｓａｄｅｔｉｓｓｕｅ；ｓｔ：海绵组织Ｓｐｏｎｇｙｔｉｓｓｕｅ．比例尺Ｓｃａｌｅｂａｒ：Ａ：
４０μｍ；Ｂ，Ｆ：２０μｍ；Ｃ，Ｄ，Ｅ：３０μｍ．
白三叶在不同浓度Ｃｄ２＋处理下，上、下表皮细胞、
栅栏组织细胞以及海绵组织细胞的形状、大小及排列
紧密程度，较对照组相比均出现了明显变化，并且随着
受Ｃｄ２＋胁迫的时间延长、浓度越高，栅栏组织和海绵
组织变化会越明显。其中，在较低浓度（１００μｍｏｌ／Ｌ）
时，白三叶叶片各结构未发生明显的变化（图１Ｂ）；从
２００μｍｏｌ／Ｌ开始，叶片结构变化明显（图１Ｃ）。在
Ｃｄ２＋供应水平达到２００μｍｏｌ／Ｌ时，叶肉细胞的细胞
壁着色加深，这可能与Ｃｄ元素的积累有关，此时，叶
肉细胞的结构仍较为清晰；３００μｍｏｌ／Ｌ时叶肉细胞排
列疏松，栅栏组织长柱状细胞缩短变粗，形态极不规则
（图１Ｄ）；在高浓度Ｃｄ２＋胁迫下（４００和５００μｍｏｌ／Ｌ），
叶肉细胞发生收缩扭曲，且细胞间隙明显变大，尤其是
海绵组织扭曲程度大，厚度越来越小，收缩严重（图
１Ｅ，Ｆ）。
２．３ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片光合色素含量的影响
Ｃｄ２＋胁迫后，白三叶叶片的Ｃｈｌａ，Ｃｈｌｂ和总叶
绿素的含量逐渐降低（表２）。本试验中，随着Ｃｄ２＋浓
度的升高，Ｃｈｌａ的含量下降显著，各处理组的含量差异显著（犘＜０．０５），在最高处理浓度５００μｍｏｌ／Ｌ处理下，
Ｃｈｌａ含量降至０．８１４ｍｇ／ｇ，为对照的７３．９３％。Ｃｈｌｂ的含量在１００～３００μｍｏｌ／ＬＣｄ
２＋胁迫下变化幅度较小，
较对照无显著差异，其中在低Ｃｄ２＋浓度（１００，２００μｍｏｌ／Ｌ）时，Ｃｈｌｂ的含量略升高。４００μｍｏｌ／Ｌ时，Ｃｈｌｂ的含
９６１第２３卷第６期 草业学报２０１４年
量下降，在５００μｍｏｌ／Ｌ时，降至最低，仅为对照的５７．５９％，且Ｃｄ
２＋对叶绿素ｂ的影响大于叶绿素ａ。总叶绿素
的含量也呈下降趋势，而Ｃｈｌａ／Ｃｈｌｂ的变化却恰恰相反。在低Ｃｄ２＋胁迫下，Ｃｈｌａ／Ｃｈｌｂ较对照降低，但随Ｃｄ２＋
浓度的升高，其比值亦逐渐升高，在５００μｍｏｌ／Ｌ达到２．９５１，较对照组差异显著（犘＜０．０５）。
表２ 犆犱２＋胁迫对白三叶叶片光合色素含量的影响
犜犪犫犾犲２ 犐狀犳犾狌犲狀犮犲狅犳犆犱２＋狊狋狉犲狊狊狅狀狆犺狅狋狅狊狔狀狋犺犲狋犻犮狆犻犵犿犲狀狋犮狅狀狋犲狀狋犻狀犜．狉犲狆犲狀狊犾犲犪狏犲狊
Ｃｄ２＋浓度
Ｃｄ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（μｍｏｌ／Ｌ）
叶绿素ａ
Ｃｈｌａ（ｍｇ／ｇＦＷ）
叶绿素ｂ
Ｃｈｌｂ（ｍｇ／ｇＦＷ）
叶绿素ａ／ｂ
Ｃｈｌａ／ｂ
总叶绿素
Ｃｈｌ（ａ＋ｂ）（ｍｇ／ｇＦＷ）
０ １．１０１±０．０１８ａ ０．４８１±０．０３０６ａ ２．２９８±０．１７５ａ １．５８２±０．０４０ａ
１００ １．０３３±０．０１３ｂ ０．４９２±０．０３４０ａ ２．１００±０．１５７ｂｃ １．５２６±０．０２８ｂ
２００ ０．９４１±０．００４ｃ ０．４９０±０．０２９０ａ １．９２５±０．１１２ｃ １．４３１±０．０２６ｃ
３００ ０．９１８±０．０１６ｃ ０．４６１±０．０２８０ａ １．９９８±０．１３４ｂｃ １．３７９±０．０２７ｃ
４００ ０．８７７±０．０１５ｄ ０．４０３±０．０３６０ｂ ２．１８８±０．１８７ｂｃ １．２７９±０．０３９ｄ
５００ ０．８１４±０．０１７ｅ ０．２７７±０．０１９０ｃ ２．９５１±０．２６６ｂ １．０９１±０．００５ｅ
２．４ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片抗氧化物酶活力和 ＭＤＡ含量的影响
２．４．１ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片 ＭＤＡ含量的影响 植物受到逆境胁迫时，通常会发生膜脂过氧化作用，而
ＭＤＡ是其最终分解的主要产物之一。ＭＤＡ含量常用于评价植物体细胞膜的损伤程度，含量越高，说明植物细
胞膜结构损伤越严重，是一个重要的逆境生理指标［２２］。由图２可知，白三叶叶片的 ＭＤＡ含量呈上升趋势。经
过不同浓度Ｃｄ２＋胁迫７ｄ，白三叶叶片的 ＭＤＡ含量变化相关方程为犢＝３．５９０３犡＋７．８４７３（犚２＝０．９０８５），由此
可知，ＭＤＡ含量变化与Ｃｄ２＋浓度呈正相关。１００μｍｏｌ／Ｌ处理下，ＭＤＡ含量为１６．５２μｍｏｌ／ｇＦＷ，是对照的
１９３．２２％，差异显著（犘＜０．０５）。２００，３００，４００μｍｏｌ／Ｌ处理下，ＭＤＡ 含量分别为２１．３５，２３．２５，２３．９９
μｍｏｌ／ｇＦＷ，较对照组差异显著（犘＜０．０５），但三者间无显著差异。在５００μｍｏｌ／Ｌ处理下，白三叶叶片的 ＭＤＡ
含量达到２８．８２μｍｏｌ／ｇＦＷ，较对照升高了３３７．０８％，与其余各处理组间差异显著（犘＜０．０５）。
图２ 犆犱２＋胁迫下白三叶叶片丙二醛含量的变化
犉犻犵．２ 犈犳犳犲犮狋狅犳犆犱２＋狊狋狉犲狊狊狅狀犕犇犃
犮狅狀狋犲狀狋犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
图３ 犆犱２＋胁迫下白三叶叶片超氧化物歧化酶活性的变化
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狅犳犆犱２＋狊狋狉犲狊狊狅狀犛犗犇
犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
２．４．２ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片ＳＯＤ活性的影响 经过Ｃｄ２＋胁迫７ｄ，各试验组间的ＳＯＤ活性，随着胁迫浓度
的升高，呈先升高后降低的趋势（图３）。较对照组而言，不同处理分别上升了１５０．２８％，１７３．６８％，２０２．１６％，
１５６．２１％，１３３．７７％，且各试验组间ＳＯＤ活性均显著高于对照组（犘＜０．０５）。１００μｍｏｌ／Ｌ胁迫７ｄ，白三叶叶片
ＳＯＤ活性迅速升高，在３００μｍｏｌ／Ｌ处理下，其活性达到了２０６μｇ／（ｇＦＷ·ｍｉｎ），在５００μｍｏｌ／Ｌ时，降至１３６
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μｇ／（ｇＦＷ·ｍｉｎ），但仍显著高于对照组（犘＜０．０５）。
２．４．３ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片ＰＯＤ活性的影响 从图４可知，胁迫７ｄ后，各试验组间ＰＯＤ活性发生了明显
的变化，整体的变化趋势为先上升后下降。从整个胁迫过程分析，除５００μｍｏｌ／Ｌ处理外，各组间活性均较对照
组差异显著（犘＜０．０５）。低浓度Ｃｄ２＋（１００，２００μｍｏｌ／Ｌ）胁迫，即可使白三叶叶片ＰＯＤ活性急剧上升，升高幅度
为对照的１５５％和１９８％，在３００μｍｏｌ／Ｌ处理下，ＰＯＤ活性达到４７０μｇ／（ｇＦＷ·ｍｉｎ），为对照组的２．１６倍，此
后，ＰＯＤ活性下降，至５００μｍｏｌ／Ｌ时，下降至２５２μｇ／（ｇＦＷ·ｍｉｎ），仅为对照组的１．１６倍，与对照组活性差异
不显著。
２．４．４ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片ＣＡＴ活性的影响 白三叶叶片的ＣＡＴ活性在Ｃｄ２＋胁迫后的变化趋势与ＳＯＤ
和ＰＯＤ一致，即随着Ｃｄ２＋胁迫浓度的增加，ＣＡＴ活性先升高后降低（图５）。０～５００μｍｏｌ／Ｌ处理组的平均
ＣＡＴ活性分别为３２．１３，６０．１１，８２．６７，９６．６７，７２．１１，６４．４４μｍｏｌ／（ｇＦＷ·ｍｉｎ）。
图４ 犆犱２＋胁迫下白三叶叶片过氧化物酶活性的变化
犉犻犵．４ 犈犳犳犲犮狋狅犳犆犱２＋狊狋狉犲狊狊狅狀犘犗犇
犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
图５ 犆犱２＋胁迫下白三叶叶片过氧化氢酶活性的变化
犉犻犵．５ 犈犳犳犲犮狋狅犳犆犱２＋狊狋狉犲狊狊狅狀犆犃犜
犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
２．４．５ Ｃｄ２＋胁迫下，白三叶各生理指标间的相
关性分析 对Ｃｄ２＋胁迫下，各项生理指标的相关
性进行分析（表３）。Ｃｈｌａ和Ｃｈｌｂ含量与Ｃｄ２＋
浓度之间呈极显著负相关（犘＜０．０１），Ｃｈｌａ和
Ｃｈｌｂ含量间呈极显著正相关（犘＜０．０１）；ＭＤＡ
含量与 Ｃｄ２＋ 浓度之间呈极显著正相关（犘＜
０．０１），ＭＤＡ含量与Ｃｈｌａ和Ｃｈｌｂ含量之间呈
极显著负相关（犘＜０．０１）；ＭＤＡ含量与ＳＯＤ活
性呈显著正相关（犘＜０．０５），与ＣＡＴ活性呈极显
著正相关（犘＜０．０１）；而ＳＯＤ，ＰＯＤ，ＣＡＴ三者间
呈极显著正相关（犘＜０．０１）。
３ 讨论
３．１ 白三叶对重金属Ｃｄ的富集情况
重金属累积能力是重金属污染土壤修复时植
表３ 犆犱２＋浓度、叶绿素、膜脂过氧化指标以及
抗氧化酶之间的相关性分析
犜犪犫犾犲３ 犆狅狉狉犲犾犪狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪犿狅狀犵犆犱２＋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀，
犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾，犕犇犃犪狀犱犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犲狀狕狔犿犲
指标
Ｉｎｄｅｘ
Ｃｄ２＋浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
Ｃｈｌａ Ｃｈｌｂ ＭＤＡ ＳＯＤ ＰＯＤ
Ｃｈｌａ －０．９７８
Ｃｈｌｂ －０．７９９ ０．７２６
ＭＤＡ ０．９２３ －０．９５０－０．６９５
ＳＯＤ ０．３０７ －０．３８３ ０．１２４ ０．５３２
ＰＯＤ ０．１８２ －０．２８９ ０．３６５ ０．３５８ ０．８８０
ＣＡＴ ０．４８２ －０．５６５ ０．０１６ ０．５９５０．８７６ ０．８４８
注：表示在０．０５水平显著相关；表示在０．０１水平极显著相关。
Ｎｏｔｅ：ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ；ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｔ０．０１ｌｅｖｅｌ．
物种选择的一个重要指标［２３］。目前，Ｃｄ超富集植物标准的认定，广泛采用 Ｔａｎｇ等［２４］提出的参考值（１００
ｍｇ／ｋｇ）。白三叶已经被证明对Ｃｄ具有很强的富集力，是一种Ｃｄ超富集植物［９］，但本研究所测白三叶的Ｃｄ富
集量与之相距甚远。究其原因，可能是胁迫时间短所致，可进一步延长胁迫时间至３０～６０ｄ，来进一步印证白三
１７１第２３卷第６期 草业学报２０１４年
叶对Ｃｄ的富集能力。
Ｃｄ在白三叶体内的分布有２种情况，一是积累在根部；另一种是把根系吸收的重金属进一步运输到地上部，
并通过蒸腾作用或叶的脱落，从植物体排出，减少Ｃｄ对白三叶的毒害［２５］。本试验表明，白三叶对重金属Ｃｄ具有
一定的累积作用，且同一浓度时，各器官对Ｃｄ的富集能力表现为：根＞叶＞茎，根部ＴＦ为０．２０２～０．３１３。与王
春光等［２６］的同一树种不同器官内重金属富集量的结论一致，所以，在白三叶短期内受Ｃｄ胁迫的情况下，根部滞
留是白三叶积累Ｃｄ的主要方式，其含量为１．２３８～３．４９０ｍｇ／Ｌ，滞留率最高可达８３．１３％；而地上部分Ｃｄ积累
量较低，为０．４０４～０．９１０ｍｇ／Ｌ。因而，白三叶在短期Ｃｄ胁迫的条件下，其防御措施可能是通过降低Ｃｄ向地上
部分的迁移量，来减轻过量Ｃｄ对地上部分其他各器官的毒害，从而提高其Ｃｄ耐性，与夏汉平和束文圣［２０］关于香
根草（犞犲狋犻狏犲狉犻犪狕犻狕犪狀犻狅犻犱犲狊）和百喜草（犘犪狊狆犪犾狌犿狀狅狋犪狋狌犿）抗重金属的耐性分析是一致的。
值得一提的是，适当处理浓度（１００μｍｏｌ／Ｌ）更有利于白三叶对Ｃｄ的吸收，浓度过高则加重Ｃｄ对植物的毒
害，因影响其生理代谢，从而影响植物根对重金属离子的吸收；而处理浓度过低，因没有达到植物对重金属吸收的
要求，植株体的重金属含量也不会达到最大［２７］，所以才会出现在４００，５００μｍｏｌ／Ｌ时，Ｃｄ的富集量最多，而二者
的ＴＦ却低于１００μｍｏｌ／Ｌ。
３．２ Ｃｄ２＋胁迫对白三叶叶片细胞结构的影响
随着胁迫的时间延长，对白三叶的毒害日趋明显，积累在叶片部分的 Ｃｄ会使细胞结构产生一定的损
伤［２８２９］。白三叶叶肉组织在低Ｃｄ２＋条件下结构不受影响，但随Ｃｄ２＋浓度升高，叶肉组织形态和排列发生改变。
白三叶在高Ｃｄ２＋胁迫下叶肉细胞排列疏松，栅栏组织细胞收缩，但海绵组织逐渐退化，利于光合作用产生大量有
机酸，同时增加蒸腾作用使Ｃｄ大量运输到叶片与有机酸结合，以提高植物对Ｃｄ积累能力，这与前人关于重金属
对植物形态的研究结果一致［３０３２］。高Ｃｄ２＋胁迫下叶片上表皮细胞发生扭曲变形，可能是由于蒸腾作用使Ｃｄ在
上表皮沉积较多，从徐根娣等［３３］的研究中得到证实，这可能是白三叶适应Ｃｄ胁迫的一种机制。
３．３ Ｃｄ２＋胁迫下白三叶的生理响应
３．３．１ Ｃｄ２＋胁迫对叶片光合作用相关指标的影响 已有研究表明，叶绿素含量会随重金属的胁迫而下降［３４３５］。
本试验中，随Ｃｄ２＋浓度的升高，白三叶叶片的Ｃｈｌａ，Ｃｈｌｂ和总叶绿素的含量均降低。其原因可能是Ｃｄ２＋胁迫
通过干扰α氨基γ酮戊二酸的合成和抑制叶绿素酸酯还原酶的活性，使叶绿素的合成受阻［３６３８］。而Ｃｄ２＋胁迫
对Ｃｈｌａ／Ｃｈｌｂ的影响因植物种类的不同而异。例如：小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）叶片Ｃｈｌａ／Ｃｈｌｂ随Ｃｄ２＋升高而
下降［３９］，棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）则增大［４０］。低Ｃｄ２＋引起白三叶叶片的叶绿素ｂ含量增加，与金山等［４１］对白
三叶的研究一致，但其机理有待于进一步研究。
３．３．２ Ｃｄ２＋胁迫对叶片膜脂过氧化程度的影响 Ｂｏｗｌｅｒ等［４２］指出植物在逆境中，打破活性氧的代谢平衡，从
而启动膜脂质过氧化作用或膜脱脂作用，影响膜的功能。Ａｂｈａｙ等［４３］，ＯｒｔｅｇａＶｉｌａｓａｎｔｅ等［４４］，苏金为和王湘
平［４５］，李慧等［４６］在对土人参（犜犪犾犻狀狌犿狆犪狀犻犮狌犾犪狋狌犿）、紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）、茶树苗和草莓的研究中报
道：Ｃｄ２＋胁迫下，植物体内ＭＤＡ含量急剧增多。本试验中，ＭＤＡ含量与Ｃｄ２＋浓度间呈极显著正相关，存在明显
的剂量－效应关系。在低Ｃｄ２＋胁迫下，即已出现膜脂过氧化作用，表明白三叶叶片细胞膜对Ｃｄ极为敏感，且随
着Ｃｄ２＋浓度增加，过氧化作用越来越明显。
３．３．３ Ｃｄ２＋胁迫对叶片抗氧化物酶活力的影响 环境胁迫会造成植物体内活性氧的大量积累，诱导一系列抗
氧化反应［４７４８］。本试验中，ＳＯＤ，ＰＯＤ，ＣＡＴ三者呈极显著正相关，低Ｃｄ２＋胁迫下，白三叶通过升高ＳＯＤ，ＰＯＤ
和ＣＡＴ活性来防止活性氧造成的毒害，说明三者发挥协同作用，维持植物体内氧自由基动态平衡，体现了白三
叶对Ｃｄ的适应性；但这种能力是有限度的，在３００μｍｏｌ／Ｌ时，白三叶叶片ＳＯＤ，ＰＯＤ和ＣＡＴ活性都急剧下降，
此时白三叶体内活性氧的形成和清除系统之间的平衡被打破。这与刘慧芹等［４９］、赵梅等［５０］、Ｗｅｎｇ等［５１］关于逆
境时植物能通过各抗氧化酶活性协调变化来缓解毒害的结果一致。
重金属对植物的毒害作用非常复杂，其毒害效应与重金属种类、重金属浓度有关，且不同植物也有差异，甚至
同一植物的不同器官对重金属胁迫的反应也存在差异。可以肯定的是，植物受到重金属胁迫，细胞结构及生理生
化反应等都会受到影响，它们之间相互联系和相互制约。今后，可进一步对分子水平的机理进行研究，如信号转
２７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６
导途径以及分子生物学，充分了解重金属耐受植物的抗性机理。
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ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｍｅｔｈｏｄｏｌｏｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｃｅａｎｄＭｉｃｒｏｐｒｏｂｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，１５（１）：５１９１．
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ｂｙＣｄｓｔｒｅｓｓｉｎ犓犪狀犱犲犾犻犪犮犪狀犱犲犾ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｅｓ，２０１３，２７：５８３５９５．
４７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．６
犈犳犳犲犮狋狊狅犳犮犪犱犿犻狌犿狊狋狉犲狊狊狅狀犪犮犮狌犿狌犾犪狋犻狅狀犪犫犻犾犻狋狔，犿犻犮狉狅狊狋狉狌犮狋狌狉犲犪狀犱
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ＨＡＮＢａｏｈｅ，ＺＨＵＨｏｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨａｒｂｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ１５００２５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｃａｄｍｉｕｍ（Ｃｄ）ｔｏｘｉｃｉｔｙｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎ犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊ｕｓｉｎｇａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ．犜．狉犲狆犲狀狊ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣｄ２＋（０，１００，２００，３００，４００，５００μｍｏｌ／Ｌ）ｆｏｒ７ｄａｙｓ．Ｃｄａｃ
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Ｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｆｏｌｏｗｅｄｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｒｏｏｔｓ＞ｌｅａｖｅｓ＞ｓｔｅｍｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，Ｃｄａｃ
ｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｃｅｒｔａｉｎｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｃｅｌｗａｌｓｏｆｍｅｓｏｐｈｙｌｃｅｌｓｔａｉｎｅｄｄｅｅｐｅｎｉｎｇ，ｔｈｅｓｈａｐｅ，
ｓｉｚｅ，ａｎｄｄｅｎｓｉｔｙｗｅｒｅａｌｓｏｃｈａｎｇｅｄ．ＩｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＣｄ２＋，ｍｏｒｅＭＤＡａｎｄＲＯＳｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｌｅａｖ
ｅｓｔｈａｎｕｎｔｒｅａｔｅｄｏｆ犜．狉犲狆犲狀狊．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｕｎｔｒｅａｔｅｄ，ｔｈｅｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｉｇｍｅｎｔｓｃｏｎｔｅｎｔｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５）．ＡｆｔｅｒＣｄ２＋ｔｒｅａｔｅｄ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＤＡｇｅｎｅｒａｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｒｅｉｓａｄｏｓｅｒｅ
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ｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｉｔｉａｌｙａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＣｈｌａａｎｄＣｈｌｂ
ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＣｄ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＷｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＤＡｗａｓｈｉｇｈｌｙｓｉｇｎｉｆｉ
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犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓ；犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊；ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ；ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙ
５７１第２３卷第６期 草业学报２０１４年