全 文 ：东祁连山高寒草地土壤产漆酶真菌的筛选、
鉴定及产酶条件的初步研究
芦光新１，王军邦２，陈秀蓉３，杨成德３，薛莉３
（１．青海大学农牧学院草业科学系，青海 西宁８１００１６；２．中国科学院地理科学与资源研究所，北京１０００９４；３．甘肃农业大学
草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：以高寒草地土壤分离出的５６个真菌菌株为研究对象，经愈创木酚ＰＤＡ培养基和α萘酚ＰＤＡ选择性培养基
初步筛选，再根据菌株在愈创木酚、邻苯二酚、邻苯甲苯胺为底物的选择性培养基上菌体生长及菌落大小、漆酶催
化氧化还原反应产生的变色圈直径大小及其变色圈颜色深浅程度，以及测定油菜秸秆诱导的液体发酵产漆酶活
力，筛选出１株产漆酶酶活真菌菌株（编号为３１０ｂ）。经ｒＤＮＡＩＴＳ基因序列分析，初步鉴定为 犕犪狉犪狊犿犻狌狊狋狉犻犮狅犾
狅狉。对菌株３１０ｂ产漆酶的条件进行了初步研究，结果表明，菌株３１０ｂ在２５℃培养条件下产漆酶活力最大，初始
ｐＨ值为４．０时，漆酶活力最大，蔗糖、蛋白胨分别为诱导菌株产漆酶活力最高的碳、氮源。几种非营养有机物对菌
株产漆酶活力大小不同，α萘酚和吐温８０对菌株产漆酶没有明显影响，愈创木酚、单宁酸、吲哚乙酸抑制菌株产漆
酶，其中吲哚乙酸抑制作用最强烈（犘＜０．０１）。在Ｃｕ２＋浓度为０．００１～０．０２５ｇ／Ｌ范围内，随Ｃｕ２＋增加，产漆酶活
力增加，０．０２５ｇ／Ｌ时产酶活力最大。随着接种量的增加，诱导漆酶活力增加。在６０～１８０ｒ／ｍｉｎ的转速范围内，随
着转速的增加，漆酶活力增加。油菜秸秆粉的量在０～１ｇ范围内，随着秸秆添加量的增加，漆酶活力增加；１～２ｇ
范围内，随着秸秆添加量的增加，漆酶活力减小。
关键词：高寒草地土壤；漆酶；真菌；鉴定；产酶条件
中图分类号：Ｓ８１２．２；Ｑ９３９．９６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０２０２４３１０
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０２２９
漆酶（ＬａｃｃａｓｅＥＣ１．１０．３．２），即对苯二酚，又名酚酶，多酚氧化酶等［１］。就结构而言，漆酶是一种含铜的糖
蛋白氧化酶，也称为多铜氧化酶；就属性而言，它和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色
多铜氧化酶（ｂｌｕｅｍｕｌｔｉｃｏｐｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）家族［２］；就功能而言，漆酶是木质素降解酶之一，与木质素过氧化物酶
（ｌｉｇｎｉｎｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＬｉＰ）和锰过氧化物酶（ｍａｎｇａｎｅｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭｎＰ）共同构成木质素降解酶系［３］。
漆酶作为生物代谢产物，在生物体内参与应激防御反应、细胞壁重建、形态发生、与宿主相互作用、腐殖质的
代谢更新等生物学功能；在体外漆酶可催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化，降解多环芳烃［４］。漆酶氧化木质
素中的酚型单元形成苯氧自由基，从而导致木质素相关结构的降解和转化，在合适的氧化还原介体存在时，漆酶
还可催化氧化非酚型的木质素模型化合物［５７］。可见，漆酶在木质素的生物降解有重要应用前景。除此之外，漆
酶被广泛应用于工业氧化处理过程中，例如各类漂白、生物去污、乙醇生产、生物传感器、生物燃料电池等［８］，在食
品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域，备受研究者和生产加工者的关注［９］。但是，由于天
然来源的生物漆酶产量低、价格昂贵，很难满足市场需求，漆酶的规模化和产业化相应受到限制，因此，寻求产漆
酶的生物资源是摆在人们面前亟待解决的问题。
已有的研究证实，漆酶存在于植物、微生物、动物、昆虫的质体的各种器官或组织中。漆酶由Ｙｏｓｈｉ［１０］首次在
紫胶漆树（犚犺狌狊狏犲狉狀犻犮犻犳犾狌犪）的渗出液中发现的，随后人们发现微生物（真菌、细菌）、动物、昆虫也能分泌这种酶。
植物来源漆酶主要出现在植物木质部，叶子、根中也有，植物漆酶主要参与愈伤组织形成、木质化等过程［１１］。动
第２３卷 第２期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２４３－２５２
２０１４年４月
收稿日期：２０１３０５２３；改回日期：２０１３０７０１
基金项目：国家自然科学基金“青藏高原草地耐低温纤维素分解真菌多样性研究”（４１２６１０６４）和青海大学高层次人才基金“产漆酶真菌的筛选及
多酶系菌群的构建”（２０１２ＱＧＣ９）资助。
作者简介：芦光新（１９７４），男，青海湟中人，教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｕｇｘ７４＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｂｗａｎｇ＠ｉｇｓｎｒｒ．ａｃ．ｃｎ，ｃｈｅｎｘｉｕｒｏｎｇ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
物体中发现的漆酶很少，报道的有猪肾和麻蝇（犘犺狅狉犿犻犪犮犲犵犻狀犪、犕狌狊犮犪犱狅犿犲狊狋犻犮犪、犔狌犮犻犾犻犪狊犲狉犻犮犪狋犪）、烟草天蛾
（犕犪狀犱狌犮犪狊犲狓狋犪）、绿头苍蝇（犆犪犾犾犻狆犺狅狉犪狏犻犮犻狀犪）、蚊子和双翅目的迁移类蝗虫等［１２１４］。相对于植物和动物来讲，
微生物漆酶来源相对丰富，主要分为真菌来源和细菌来源，已知在多种真菌菌株分泌物中都检测到了漆酶的活
性［１５］，值得一提的是，真菌产漆酶具有以下几个优点：１）真菌分泌的漆酶都是胞外酶，使得漆酶的分离纯化相比
胞内酶而言稍显容易，而且在胞外的稳定性也较好；２）产酶效率高，产生漆酶酶系结构较合理，相互间可发生强
烈的协同作用；３）可同时产生许多纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等，这些酶的协同效应对降解木质素具
有重要的意义。因此，真菌漆酶的研究备受瞩目，成为研究的热点［１６］。
由于漆酶巨大的应用价值，因此进行漆酶产生菌的分离筛选一直是漆酶研究的热点之一。到目前为止，已
有从土壤中分离筛选产漆酶真菌的报道［１７２０］，但高寒草地土壤中产漆酶菌株的筛选鲜有报道。研究发现，东祁连
山高寒草地土壤微生物多样性较为丰富［２１］，并且草地生态系统土壤微生物与其生态环境协同进化，形成的一种
适应性机制［２２］。以高寒草地土壤分离出的５６个真菌菌株为研究对象，选用与漆酶作用的几种底物为选择性培
养基，并通过测定漆酶活力，筛选高寒草地土壤中的产漆酶菌株，并对筛选出的产漆酶菌株进行了产酶条件的研
究，旨在为进一步工业化的开发和应用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株
供试的５６个真菌菌株由本课题组从东祁连山高寒草地土壤中分离筛选获得，保存于４℃冰箱。实验时间为
２０１２年２－５月。
１．２ 培养基
１．２．１ 菌株活化、保存培养基 ＰＤＡ培养基：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ自然，
用于菌株的活化、复壮。
１．２．２ 产漆酶菌株筛选培养基 愈创木酚ＰＤＡ培养基：ＰＤＡ 培养基灭菌后添加经无菌过滤器除菌的愈创木
酚－乙醇溶液，使愈创木酚的最终浓度为３ｍｍｏｌ／Ｌ。
α萘酚ＰＤＡ培养基：以α萘酚替代愈创木酚。
愈创木酚为底物的选择性培养基：ＮａＮＯ３２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ，ＫＣｌ０．５ｇ，ＭｇＳＯ４０．５ｇ，ＦｅＳＯ４０．０１ｇ，愈创木
酚１０ｇ，琼脂１０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。ｐＨ用稀盐酸调制６．０～７．０。
邻苯二酚为底物的选择性培养基：ＮａＮＯ３２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ，ＫＣｌ０．５ｇ，ＭｇＳＯ４０．５ｇ，ＦｅＳＯ４０．０１ｇ，邻苯二
酚１０ｇ，琼脂１０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。ｐＨ用稀盐酸调制６．０～７．０。
邻苯甲苯胺为底物的选择性培养基：ＮａＮＯ３２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ，ＫＣｌ０．５ｇ，ＭｇＳＯ４０．５ｇ，ＦｅＳＯ４０．０１ｇ，邻苯
甲苯胺１０ｇ，琼脂１０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。ｐＨ用稀盐酸调制６．０～７．０。
１．２．３ 液体产酶培养基 ＮａＮＯ３２．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＣａＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０．１ｇ，ＭｇＳＯ４０．３ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，ＦｅＣｌ３
０．０１ｇ，油菜秸秆粉０．５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ用稀盐酸调制６．０～７．０。
１．３ 研究方法
１．３．１ 产漆酶真菌的初步筛选 将活化的菌株接种于愈创木酚ＰＤＡ培养基和α萘酚ＰＤＡ培养基，２５℃培
养，定时观察菌落生长和菌落周围颜色深浅变化情况。选出能在愈创木酚ＰＤＡ培养基和α萘酚ＰＤＡ培养基产
生褐色氧化带的阳性菌株，分别接种于以愈创木酚、邻苯二酚、邻苯甲苯胺为唯一碳源的选择性培养基，２５℃培
养，每天定时观察菌落形态的同时，测量菌落直径、褐色氧化带变色圈的直径，记录变色圈颜色深浅，以此作为
定性指标，判断菌株产漆酶的情况。
１．３．２ 粗酶液的制备及漆酶活力测定 将筛选出的菌株接种于已灭菌的盛有５０ｍＬ发酵产酶培养基的１５０
ｍＬ锥形瓶中，以油菜秸秆粉为底物，不接菌为对照，于２５℃，１５０ｒ／ｍｉｎ震荡培养７～１０ｄ，每个处理重复３次。
培养结束后，在无菌操作的条件下，吸取５ｍＬ上清液，于４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，取上清液制备粗酶液。
酶活力测定方法，以愈创木酚为漆酶底物，按照王剑锋等［２３］的方法进行测定，１个酶活单位（ＩＵ）定义为１
４４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
ｍｉｎ内氧化１μｍｏｌ愈创木酚所需要的酶量。
１．３．３ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ分子鉴定 真菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ的分子鉴定方法参考相关文献［２４］。
１．３．４ 产酶条件的研究 应用摇瓶液体发酵的方法，以油菜秸秆粉为底物，分别在不同培养条件下，测定漆酶酶
活力。
１．４ 数据处理及分析
所有数据均用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ录入并作图，采用ＤＰＳ６．５５进行数据分析。
２ 结果与分析
２．１ 产漆酶菌株的初步筛选结果
从５６个供试菌株在α萘酚ＰＤＡ培养基和愈创木酚ＰＤＡ培养基上的培养结果来看，菌株编号为１．９、２．１ａ、
３１０ｂ、３０１ｇ、２．１ｃ、３．７ｃ、无孢、２．３ａ、２．４ｄ、１０ａ、Ｈ待定、ＷＱＬＺ１４等菌株能够在愈创木酚ＰＤＡ培养基上产生褐
色的氧化带，菌株编号为１．９、２．１ａ、３１０ｂ、３０１ｇ、２．３ａ、２．４ｄ、１０ａ、Ｈ待定、ＷＱＬＺ１４等菌株能够在α萘酚ＰＤＡ
培养基上产生褐色的氧化带。
２．２ 供试菌株在α萘酚ＰＤＡ和愈创木酚ＰＤＡ筛选培养基上出现褐色氧化带的时序
由表１可以看出，在α萘酚ＰＤＡ培养基上，接种后２４ｈ，菌株１．９、２．１ａ、３１０ｂ、ＷＱＬＺ１４周围出现褐色氧化
带，接种后４８ｈ，菌株 Ｈ待定周围出现褐色氧化带，接种７２ｈ后，菌株３０１ｇ、２．１ｃ、２．３ａ、２．４ｄ周围出现褐色氧化
带。在愈创木酚ＰＤＡ培养基上，接种后２４ｈ，菌株１．９、２．１ａ、３１０ｂ、２．１ｃ、２．３ａ、Ｈ待定、ＷＱＬＺ１４周围出现褐色
氧化带，接种４８ｈ后，菌株３０１ｇ、２．４ｄ、１０ａ周围出现褐色氧化带，接种７２ｈ后，菌株３．７ｃ和无孢周围出现褐色氧
化带。由此可见，不同菌株在不同底物作为诱导剂的培养基上出现褐色氧化带的时间不同，有的菌株产酶较早，
有的菌株产酶较晚。另外，菌株３．７ｃ、无孢和１０ａ能在ＧＵＡ＋ＰＤＡ培养基上产生褐色氧化带，而不在α萘酚＋
ＰＤＡ培养基上产生褐色氧化带。
２．３ 供试菌株在３种筛选培养基上的生长情况及褐色氧化带
将筛选出的菌株，分别接种于以愈创木酚、邻苯二酚、邻苯甲苯胺为底物的选择性培养基上，由图１可以看
出，１１个菌株在３种底物的培养基上的菌落直径以及出现褐色氧化带直径不同，并且褐色氧化带颜色的深浅程
度也不同。
表１ 供试菌株在α萘酚犘犇犃培养基和愈创木酚犘犇犃培养基出现褐色氧化带的时序
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犪狆狆犲犪狉狋犻犿犻狀犵狅犳犫狉狅狑狀狅狓犻犱犪狋犻狅狀狕狅狀犲狅犳狊狋狉犪犻狀狊狅狀狋犺犲α狀犪狆犺狋犺狅犾犘犇犃犿犲犱犻狌犿犪狀犱犌犝犃犘犇犃犿犲犱犻狌犿
序号
Ｓｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒ
菌株编号
Ｓｔｒａｉｎｎｕｍｂｅｒ
α萘酚ＰＤＡ培养基αｎａｐｈｔｈｏｌＰＤＡｍｅｄｉｕｍ
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ ９６ｈ １２０ｈ
愈创木酚ＰＤＡ培养基ＧＵＡＰＤＡｍｅｄｉｕｍ
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ ９６ｈ １２０ｈ
１ １．９ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
２ ２．１ａ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
３ ３１０ｂ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
４ ３０１ｇ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
５ ２．１ｃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
６ ３．７ｃ ＋ ＋ ＋
７ 无孢 Ｎｏｓｐｏｒｅ ＋ ＋ ＋
８ ２．３ａ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
９ ２．４ｄ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１０ １０ａ ＋ ＋ ＋ ＋
１１ Ｈ待定 Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１２ Ｆｓｐ９ －
１３ ＷＱＬＺ１４ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
注：＋表示出现褐色氧化带。
Ｎｏｔｅ：“＋”ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｂｒｏｗｎｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅ．
５４２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
图１ 供试菌株在３种选择性培养基上的生长情况及出现的氧化带
犉犻犵．１ 犜犺犲犵狉狅狑狋犺狊狋犪狋狌狊犪狀犱犲犿犲狉犵犲狀犮犲犫狉狅狑狀狅狓犻犱犪狋犻狅狀狕狅狀犲狅犳狊狋狉犪犻狀狊狅狀狋犺狉犲犲犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犲犾犲犮狋犻狏犲犿犲犱犻狌犿
Ａ：愈创木酚培养基Ｇｕａｉａｃｏｌｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ；Ｂ：邻苯二酚培养基Ｃａｔｅｃｈｏｌｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ；Ｃ：邻甲苯胺培养基Ｏｔｏｌｕｉｄｉｎｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ．
表２ 供试菌株在选择性培养基上的菌落直径和氧化带直径
犜犪犫犾犲２ 犆狅犾狅狀狔犱犻犪犿犲狋犲狉犪狀犱狅狓犻犱犪狋犻狅狀狕狅狀犲犱犻犪犿犲狋犲狉狅犳狊狋狉犪犻狀狊狅狀狋犺狉犲犲犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犲犾犲犮狋犻狏犲犿犲犱犻狌犿 ｃｍ
序号
Ｓｅｒｉａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
菌株编号
Ｓｔｒａｉｎ
ｎｕｍｂｅｒ
愈创木酚选择性培养基
Ｇｕａｉａｃｏｌｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ
Ａ氧化带直径
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒ
Ｂ菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
邻苯二酚选择性培养基
Ｃａｔｅｃｈｏｌｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ
Ａ氧化带直径
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒ
Ｂ菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
邻苯甲苯胺选择性培养基
Ｏｔｏｌｕｉｄｉｎｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ
Ａ氧化带直径
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒ
Ｂ菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
１ １．９ ２６．６（＋＋＋） （＋）２１．５ １４．５（＋＋） （＋）９．５ ２０．５（＋＋） （＋）１２．１
２ ２．１ａ ２０．４（＋） （＋）１２ ７．５（＋） （－）７．５ ２１（＋＋） （＋）１５．４
３ ３１０ｂ ２７．５（＋＋＋） （＋）２０．５ ７（＋） （＋）７ ２３．５（＋＋＋） （＋）１６．５
４ ３０１ｇ １６．５（＋＋） （＋）１２．４ １２（＋＋） （＋）９．５ １４．５（＋） （＋）９．５
５ ２．１ｃ ２２．９（＋＋） （＋）１６．５ １２．７（＋＋） （＋）１０．５ ２０．２（＋＋） （＋）１６．７
６ ２．３ａ ２９．５（＋＋＋） （＋）２２ ０（－） （－）０ ０（－） （－）０
７ ２．４ｄ ２６．３（＋＋＋） （＋）１９．７ ０（－） ０（－） ３０．３（＋＋＋） （＋）２５．５
８ １０ａ １６．６（＋＋） （＋）１０．２ ０（－） ０（－） ４０（＋＋＋） （＋）３５
９ Ｈ ０（－） （－）０ ０（－） ０（－） １５．８（＋） （＋）１１．５
１０ Ｆｓｐ９ ０（－） （－）０ ０（－） ０（－） ２５（＋＋） （＋）１８．３
１１ ＷＱＬＺ１４ ２０（＋＋＋） （＋）１５．５ １１．６（＋＋） ８（＋） ２０．９（＋＋） （＋）１３．５
注：表中列出的氧化带直径一栏中，前面的数字表示氧化带直径，括号中的“＋”表示颜色的深浅程度，“－”表示没有产生氧化带；菌落直径一栏
中，括号中的“＋”表示能生长，“－”表示不能生长，数字表示菌落直径大小。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｔａｂｌｅｌｉｓｔｓｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅａｎｄｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ，ｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｎｕｍｂｅｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅｄｉａｍｅｔｅｒｉｎｔｈｅｃｏｌｕｍｎｏｆｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅ，
“＋”ｉｎｄｉｃａｔｅｓｃｏｌｏｒｄｅｐｔｈ，“－”ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｒｅｄｉｄｎｏｔｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｚｏｎｅｉｎｔｈｅｂｒａｃｋｅｔｓ；Ｉｎｔｈｅｃｏｌｕｍｎｏｆｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ，“＋”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ｓｔｒａｉｎｓｃａｎｇｒｏｗｏｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍ，“－”ｉｎｄｉｃａｔｅｓｓｔｒａｉｎｓｄｉｄｎｏｔｇｒｏｗ，ｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｎｕｍｂｅｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ．
由表２可以看出，在愈创木酚培养基上，除Ｆｓｐ９和Ｈ待定２个菌株不能生长之外，其余９个菌株均能生长，
并且产生褐色氧化带，１．９、３１０ｂ、２．３ａ、２．４ｄ４个菌株的菌落直径较大，褐色氧化带直径较大，氧化带的颜色较
深。在邻苯二酚培养基上，１．９、３１０ｂ、３０１ｇ、２．１ｃ、２．１ａ、ＷＱＬＺ１４６个菌株能够生长，并且产生褐色氧化带，３１０ｂ
和２．１ａ的褐色氧化带直径较小，而１．９、３０１ｇ、２．１ｃ、ＷＱＬＺ１４褐色氧化带直径较大。在邻苯甲苯胺培养基上，
菌株２．３ａ不能生长外，其余１０个菌株均能生长。３１０ｂ、２．４ｄ、１０ａ３个菌株产生褐色氧化带的直径大，颜色较深，
菌株３０１ｇ和 Ｈ待定产生的褐色氧化带的颜色较浅。
６４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
２．４ 产漆酶酶活菌株的复选结果
测定漆酶酶活力的结果表明，以油菜秸秆为底物，液体摇瓶发酵后，只有菌株３１０ｂ能够产生漆酶，其余菌株
检测不到漆酶酶活。
２．５ 产漆酶菌株的分子鉴定结果
将该序列在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ同源性比较，发现与ＧｅｎＢａｎｋ中报道的１株犕犪狉犪狊犿犻狌狊狋狉犻犮狅犾狅狉（登
录号：ＪＮ９４３６０１）同源性达到９９％以上。为了进一步确定目标菌株的分类地位，采用 ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法（图
２Ａ）和ＵＰＧＭＡ法（图２Ｂ）分别构建系统发育树，结果显示，菌株３１０ｂ在２种系统发育树中的结果一致，即与登
录号为ＪＮ９４３６０１的菌株的亲缘关系最近，支持率高达９９％～１００％。通过ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析，菌株３１０ｂ初步
鉴定为犕犪狉犪狊犿犻狌狊狋狉犻犮狅犾狅狉。
图２ 菌株３１０犫系统发育树的构建
犉犻犵．２ 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳狊狋狉犪犻狀３１０犫
Ａ、Ｂ分别为基于ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法和ＵＰＧＭＡ法的系统发育树。Ａ，ＢｉｓｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅＵＰＧＭＡ
ｍｅｔｈｏｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．６ 产漆酶条件的研究结果
２．６．１ 温度对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 菌株３１０ｂ在１５～３５℃范围内可以产漆酶，１５～２５℃随温度上升，漆酶
活力增加，２５℃时产漆酶活力最大，且差异极显著（犘＜０．０１），２５～３５℃范围内，随温度上升，漆酶活力减少；在
２０～２８℃范围内产酶活力达８０％以上（图３）。
２．６．２ 初始ｐＨ值对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 初始ｐＨ值对菌株３１０ｂ产漆酶活力有影响，较小的ｐＨ值有利
于产酶，ｐＨ＝４．０时漆酶活力最大，且差异极显著（犘＜０．０１），之后随ｐＨ的增加，产漆酶活力呈下降趋势，但ｐＨ
值在５．０～９．０范围内，漆酶活力下降幅度不大（图４）。我们推测，菌株３１０ｂ分泌的漆酶有可能是一种偏酸性酶。
图３ 温度对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．３ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀犾犪犮犮犪狊犲
图４ 狆犎对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．４ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狆犎狏犪犾狌犲狅狀犾犪犮犮犪狊犲
７４２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
２．６．３ Ｃ源对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 以油菜秸秆粉作为唯一的碳源，分别添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性
淀粉、糊精、Ｄ半乳糖、Ｄ木糖、Ｄ果糖、羧甲基纤维素钠（ＣＭＣＮａ）进行摇瓶液体发酵，由图５可以看出，不同碳
源诱导菌株３１０ｂ产漆酶活力不同，其中添加蔗糖可以促进菌株３１０ｂ分泌漆酶，但差异不显著，而添加其他碳源
会抑制菌株３１０ｂ产漆酶的活力（图５）。
２．６．４ Ｎ源对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 不同氮源对菌株３１０ｂ产漆酶水平的影响结果如图６，可以看出分别以
硫酸铵、酒石酸铵、硝酸钠、磷酸铵、蛋白胨、Ｌ酪氨酸、ＤＬ苯丙氨酸、Ｌ赖氨酸、尿素作为不同氮源诱导菌株３１０ｂ
产漆酶活力不同，９种氮源中，蛋白胨最有利于菌株３１０ｂ分泌漆酶，诱导漆酶活力最高，其次为Ｌ酪氨酸和Ｌ苯
丙氨酸，尿素诱导产漆酶活力最低。
图５ 犆源对３．１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．５ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犆狊狅狌狉犮犲狅狀犾犪犮犮犪狊犲
图６ 犖源对３．１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．６ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犖狊狅狌狉犮犲狅狀犾犪犮犮犪狊犲犾犪犮犮犪狊犲
Ａ：葡萄糖Ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｂ：蔗糖Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ；Ｃ：麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ；Ｄ：可溶性
淀粉Ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ；Ｅ：糊精Ｄｅｘｔｒｉｎ；Ｆ：Ｄ半乳糖 Ｄｇａｌａｃｔｏｓｅ；Ｇ：Ｄ木
糖 Ｄｘｙｌｏｓｅ；Ｈ：Ｄ果糖 Ｄｆｒｕｃｔｏｓｅ；Ｉ：羧甲基纤维素钠ＣＭＣＮａ；Ｊ：油菜
秸秆粉Ｒａｐｅｓｔｒａｗｐｏｗｄｅｒ．
Ａ：硫酸铵 Ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ；Ｂ：酒石酸铵 Ａｍｍｏｎｉｕｍｔａｒｔｒａｔｅ；Ｃ：
硝酸钠 Ｓｏｄｉｕｍｎｉｔｒａｔｅ；Ｄ：磷酸铵 Ａｍｍｏｎｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｅ：蛋白胨
Ｐｅｐｔｏｎｅ；Ｆ：Ｌ酪氨酸Ｌｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｇ：ＤＬ苯丙氨酸ＤＬｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｈ：
Ｌ赖氨酸Ｌｌｙｓｉｎｅ；Ｉ：尿素Ｕｒｅａ．
图７ 非营养有机物对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．７ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狀狅狀狀狌狋狉犻犲狀狋狅狉犵犪狀犻犮狅狀犾犪犮犮犪狊犲
Ａ：吲哚乙酸Ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ；Ｂ：邻甲苯胺 ＯＴｏｌｉｄｉｎｅ；Ｃ：邻苯二酚 Ｃａｔ
ｅｃｈｏｌ；Ｄ：α萘酚αｎａｐｈｔｈｏｌ；Ｅ：单宁酸 Ｔａｎｎｉｎ；Ｆ：愈创木酚 Ｇｕａｉａｃｏｌ；Ｇ：吐
温８０Ｔｗｅｅｎ８０；Ｈ：对照ＣＫ．
２．６．５ 非营养有机物对菌株３．１０ｂ产漆酶的影响
分别在产酶培养基中添加１％的吲哚乙酸（Ｉｎ
ｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）、愈创木酚（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、邻甲苯胺（Ｏ
Ｔｏｌｉｄｉｎｅ）、邻苯二酚（Ｃａｔｅｃｈｏｌ）、α萘酚（αｎａｐｈ
ｔｈｏｌ）、单宁酸（Ｔａｎｎｉｎ）、吐温８０（Ｔｗｅｅｎ８０），考察
它们对菌株３１０ｂ漆酶合成的影响，结果表明，邻甲
苯胺、α萘酚和吐温８０促进菌株３１０ｂ漆酶的合成；
愈创木酚、邻苯二酚、单宁酸、吲哚乙酸抑制菌株产
酶，其中吲哚乙酸抑制作用最强烈（犘＜０．０１）（图７）。
２．６．６ Ｃｕ２＋对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 在产酶
培养基中添加一定量的ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，均有利于
菌株产酶。结果显示，培养基中添加 ＣｕＳＯ４·
５Ｈ２Ｏ，在０．００１～０．０２５ｇ／Ｌ范围内，随Ｃｕ２＋增加，
产漆酶活力增加，０．０２５ｇ／Ｌ时产酶活力最大（图
８）。
２．６．７ 接种量对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 不同接种量对菌株３１０ｂ产漆酶活力不同，随着接种量的增加，诱导
漆酶活力增加（图９）。图９中，Ｓ１～Ｓ５分别表示不同的接种量，以在ＰＤＡ平板上将培养７～１０ｄ的供试菌用６
ｍｍ直径的打孔器切取１个菌饼（６ｍｍ）为标准，按１，２，３，４，５个菌饼分别接种处理。
８４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
图８ 犆狌２＋对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．８ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犆狌２＋狅狀犾犪犮犮犪狊犲
图９ 接种量对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．９ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犻狀犮狅犾狌犿狊犻狕犲狅狀犾犪犮犮犪狊犲
２．６．８ 转速对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 分别在０，
图１０ 转速对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．１０ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狉狅狋犪狋犻狅狀狊狆犲犲犱狅狀犾犪犮犮犪狊犲
图１１ 天然碳源对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．１１ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狀犪狋狌狉犪犾犆狊狅狌狉犮犲狅狀犾犪犮犮犪狊犲
Ａ：燕麦秸秆 Ｏａｔｓｔｒａｗ；Ｂ：油菜秸秆 Ｒａｐｅｓｔｒａｗ；Ｃ：玉米秸秆 Ｍａｉｚｅ
ｓｔｒａｗ；Ｄ：天然草地枯落物Ｌｉｔｔｅｒｏｆｎａｔｕｒａｌｇｒａｓｓｌａｎｄ；Ｅ：芨芨草秸秆犃犮犺
狀犪狋犺犲狉狌犿狊狆犾犲狀犱犲狀狊ｓｔｒａｗ．
６０，９０，１２０，１５０，１８０ｒ／ｍｉｎ不同转速条件下考察对
菌株３１０ｂ产漆酶活力，由图１０可以看出，从６０～
１８０ｒ／ｍｉｎ随着转速的增加，漆酶活力增加，在转速
为１８０ｒ／ｍｉｎ的条件下，菌株３１０ｂ产漆酶活力达到
最大（图１０）。
２．６．９ 天然碳源对菌株３１０ｂ产漆酶的影响 天然
草地枯落物最适于菌株３１０ｂ产漆酶，其次为油菜秸
秆、燕麦秸秆和芨芨草秸秆产酶量较低。玉米秸秆
诱导菌株产漆酶活力最低（图１１）。
２．６．１０ 底物添加量对菌株３１０ｂ产漆酶的影响
不同秸秆添加量对菌株３１０ｂ产漆酶活力不同，从
０～１ｇ随着秸秆添加量的增加，漆酶活力增加；１～
２ｇ范围内，随着秸秆添加量的增加，漆酶活力减小
（图１２）。
３ 讨论
３．１ 产漆酶真菌的筛选
愈创木酚既是漆酶的氧化底物又是漆酶生物合
成的诱导剂，α萘酚对于漆酶的产生具有一定促进
作用，以愈创木酚ＰＤＡ培养基和α萘酚ＰＤＡ培养
基结合使用可以保证所选出的产酶菌株是漆酶生产
菌种，而非愈创木酚氧化酶的生产菌株［１８］。本研
究根据漆酶本身的性质、催化底物以及微生物生产
漆酶的特性，设计初步筛选产漆酶菌株的选择性培
养基平板，根据菌体生长及菌落大小、漆酶催化氧
化还原反应产生的变色圈直径平均值及其变色圈颜
色深浅程度，进行产漆酶菌株的筛选。实验中发现，不同菌株在愈创木酚ＰＤＡ培养基和α萘酚ＰＤＡ培养基２
种平板上的显色反应有差别，这可能是在培养过程中这２种底物对不同菌株漆酶生物合成的诱导作用不同，这种
现象的产生除了与菌株所合成漆酶的产量、活力和类型有关外，可能还与不同菌株所产的漆酶对于愈创木酚
９４２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
和α萘酚的催化专一性差别有关。另外，不同菌株在
图１２ 秸秆添加量对３１０犫产漆酶的影响
犉犻犵．１２ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳狊狋狉犪狑犪犿狅狌狀狋狅狀犾犪犮犮犪狊犲
两种平板培养基上的生长速度不同，因此漆酶催化氧
化还原反应产生的变色圈直径与菌落大小没有必然的
相关性。同一菌株在不同底物的平板培养基上的显色
圈相对大小不完全相同，但大多数菌株呈现出了较好
的一致性，在变色圈所显色泽和强度方面，所有显色
菌株在同种选择培养基的不同平行平板中都能显示出
几乎一致的色泽与直径大小，说明选择平板的稳定性
和高度可重复性。
３．２ 发酵条件对产酶活力的影响
环境因素诸如温度、ｐＨ 值、碳源、氮源等显著影
响真菌漆酶的产生，影响效果因菌株而异［２５］。在本实
验中，菌株３１０ｂ在２５℃时产漆酶活力最大，ｐＨ４．０时漆酶活力最大，蔗糖和蛋白胨分别为最有利于漆酶合成的
碳、氮源，邻甲苯胺、α萘酚和吐温８０促进菌株３１０ｂ漆酶的合成；愈创木酚、邻苯二酚、单宁酸、吲哚乙酸抑制菌
株产酶，其中吲哚乙酸抑制作用最强烈α萘酚和吐温８０对菌株产酶没有明显影响；愈创木酚、单宁酸、吲哚乙酸
抑制菌株产酶，其中吲哚乙酸抑制作用最强烈。随Ｃｕ２＋增加，产漆酶活力增加，０．０２５ｇ／Ｌ时产酶活力最大。随
着接种量的增加，诱导漆酶活力增加。从６０～１８０ｒ／ｍｉｎ随着转速的增加，漆酶活力增加。从０～１ｇ随着秸秆添
加量的增加，漆酶活力增加；１～２ｇ范围内，随着秸秆添加量的增加，漆酶活力减小。不同来源漆酶的最适温度、
最适ｐＨ 值有差异，无机离子对其影响也不完全相同，这说明不同来源漆酶的化学组成可能不同；所以在分离
和筛选高酶活菌株时应考虑这些因素的影响。
３．３ 产漆酶真菌的种类
据报道，产漆酶真菌不下于１０００种，而且超过１００种真菌漆酶，已经从相应的培养物中被纯化，并对其理化
特性做了深入研究［１５］。有许多报道称子囊菌纲（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）的许多真菌产漆酶，例如犌犪犲狌犿犪狀狀狅犿狔犮犲狊犵狉犪
犿犻狀犻狊、犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲犵狉犻狊犲犪、犗狆犺犻狅狊狋狅犿犪狀狅狏狅狌犾犿犻、犕犲犾犪狀狅犮犪狉狆狌狊犪犾犫狅犿狔犮犲狊、犕狅狀狅犮犻犾犾犻狌犿犻狀犱犻犮狌犿、犖犲狌狉狅狊狆狅
狉犪犮狉犪狊狊犪、犘狅犱狅狊狆狅狉犪犪狀狊犲狉犻狀犪 等，但是没有做系统研究，很难确定具体有多少种子囊菌产漆酶。此外，漆酶在担
子菌纲（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）和半知菌纲（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）中也分布广泛，例如研究较多的白腐菌、革菌属、栓菌属、
蜜环菌属、多孔菌属、鬼伞属等，而漆酶产量普遍较高的主要是彩绒革盖菌［２６］。近年来关于真菌产漆酶的报道较
多，如：血红密孔菌（犘狔犮狀狅狆狅狉狌狊狊犪狀犵狌犻狀犲狌狊）［２７］、犘犪犲犮犻犾狅犿狔犮犲狊犿犪犼狅狉［２８］、犘犲狀犻犮犻犾犾犻狌犿狊犻犿狆犾犻犮犻狊狊犻犿狌犿［２９］、烟管
菌（犅犼犲狉犽犪狀犱犲狉犪犪犱狊狋犪狉）［３０］、犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｓｐ．ＬａＴｒ０１［３１］、犛狅狆犺犪狉犪犼犪狆狅狀犻犮犪［３２］、犌犲狅狋狉犻犮犺狌犿犮犪狀犱犻犱狌犿［３３］、犜狉犻
犮犺狅犱犲狉犿犪狏犻狉犻犱犲［３４］、犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｓｐ．Ｚ３［３５］、犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｓｐ．［３６］、犆狌狉狏狌犾犪狉犻犪犾狌狀犪狋犪［３７］、犘狅犾狔狆狅狉狌狊犪狉犮狌犾犪狉犻狌狊
Ａ０８［２３］、犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犪狊狆犲狉犲犾犾狌犿 Ｗ０３［３８］等。研究内容集中在产酶菌株的筛选和发酵条件的优化，从东祁连山
高寒草地土壤中筛选到了１株产漆酶菌株，经ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析结果，初步鉴定为：小皮伞属（犕犪狉犪狊犿犻狌狊狋狉犻
犮狅犾狅狉）。小皮伞属真菌（犕犪狉犪狊犿犻狌狊Ｆｒ．）在分类学上隶属于担子菌门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌纲（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ）、伞菌亚纲（Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）、伞菌目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）、小皮伞科（Ｍａｒａｓｍｉａｃｅａｅ）［３９］，其地生、木生或生于林
中的枯枝落叶上，在我国２９个省区有分布［４０］。目前为止尚未见到小皮伞属真菌产漆酶的相关报道。
尽管漆酶的应用价值广，但是植物、动物、昆虫等天然来源的漆酶产量低、价格昂贵，而真菌大多在恶劣环境
下才会启动漆酶的表达系统。依赖野生天然来源的漆酶生产，难以满足工业需求，漆酶的产业化受到限制。随着
分子生物学的发展，漆酶的异源表达系统的构建和利用为漆酶工业化大规模生产提供了一条新的可发展途径，但
是，为实现这一目标，必须明确产漆酶真菌的资源。因此，从不同环境中分离和筛选产漆酶真菌，挖掘产漆酶真菌
资源，仍然是人们继续努力的方向和目标。
０５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
参考文献：
［１］ 王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学（第三版上册）［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００２：４２８４２９．
［２］ ＷａｎＹＹ，ＤｕＹＭ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃａｔａｌｙｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌａｃｃａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，７０（９）：６６２６７０．
［３］ ＨａｋｕｌｉｎｅｎＮ，ＫｉｓｋｉｎｅｎＬＬ，ＫｒｕｕｓＫ，犲狋犪犾．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｌａｃｃａｓｅｆｒｏｍ犕犲犾犪狀狅犮犪狉狆狌狊犪犾犫狅犿狔犮犲狊ｗｉｔｈａｎｉｎｔａｃｔｔｒｉ
ｎｕｃｌｅａｒｃｏｐｐｅｒｓｉｔｅ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，９（８）：６０１６０５．
［４］ 秦文娟，余惠生，付时雨．利用漆酶降解有机污染物［Ｊ］．中国造纸，２００１，（５）：５８６２．
［５］ ＣｈａｄｗｉｃｋＲＪ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｅｎｚｙｍｅｒｅｍｏｖａｌｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｓｉｎｔｈｅｐｒｅｎｓｅｃｏｓｕｂｓｔｒａｒｅｓ［Ｊ］．ＷａｔｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２９（１２）：
２７２０２７２４．
［６］ ＢｏｌａｇＪＭ，ＳｈｕｌｅｗｏｒｈＫＬ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＤＨ．Ｌａｃｃａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，５４（１２）：３０８６３０９１．
［７］ ＢａｊｐａｉＰ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｎｚｙｍｅｓｉｎｔｈｅｐｕｌｐａｎｄｐａｐｅｒｉｎｄｕｓｔｒｙ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇｒｅｓｓ，１９９９，１５（２）：１４７１５７．
［８］ 钞亚鹏，钱世钧．真菌漆酶及其应用［Ｊ］．生物工程进展，２００１，２１（５）：２３２７．
［９］ 靳蓉，张飞龙．漆酶的来源与分离纯化技术［Ｊ］．中国生漆，２０１２，３１（３）：７１４．
［１０］ ＹｏｓｈｉＨ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｌａｃｑｕｅｒ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，１８８３，４３：４７２４８６．
［１１］ ＢａｏＷＯ，ＭａｌｅｙＤＭ，ＷｈｅｔｔｅｎＲ，犲狋犪犾．ＡｌａｃｃａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＬｏｂｌｏｌｙＰｉｎｅＸｙｌｅｍ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，
２６０：６７２６７４．
［１２］ ＨｏｐｋｉｎｓＴＬ，ＫｒａｍｅｒＫＪ．Ｉｎｓｅｃｔｃｕｔｉｃｌｅｓｃｌｅｒｏｔｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，１９９２，３７：２７３３０２．
［１３］ ＫｒａｍｅｒＫＪ，ＫａｎｏｓｔＭＲ，ＨｏｐｋｉｎｓＴＬ，犲狋犪犾．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｏｌｓｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｉｎｓｅｃｔｓｋｅｌｅｔａｌｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ，２００１，５７（２）：３８５３９２．
［１４］ ＳｉｄｊａｎｓｋｉＳ，ＭａｔｈｅｗｓＧＶ，ＶａｎｄｅｒｂｅｒｇＪＰ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅｓｉｎｈｅｍｏｌｙｍｐｈ
ａｎｄｍｉｄｇｕｔｏｆａｄｕｌｔＡｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９７，８３（４）：６８６６９１．
［１５］ ＢａｌｄｒｉａｎＰ．Ｆｕｎｇａｌｌａｃｃａｓｅｓｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，２００５，３０（２）：２１５２４２．
［１６］ 王佳玲，余惠生，付时雨，等．白腐菌漆酶研究进展［Ｊ］．微生物学通报，１９９８，２５（４）：２３３２３６．
［１７］ 彭红，罗开昆，高中洪，等．产漆酶真菌的筛选、培养对苯酚的降解［Ｊ］．华中科技大学学报（自然科学版），２００５，３３（７）：
１１１１１４．
［１８］ 王剑锋，刘建玲，王璋．从土壤中筛选产漆酶微生物菌株的研究［Ｊ］．食品与发酵工业，２００７，３３（１０）：３５３９．
［１９］ 潘澄，茆婷，吴宇澄，等．产漆酶真菌筛选及其对ＰＡＨｓ污染土壤修复的初步研究［Ｊ］．土壤学报，２０１１，４８（６）：１２５３
１２５９．
［２０］ 茆摇婷，潘摇澄，徐婷婷，等．一株产漆酶土壤真菌Ｆ５的分离及土壤修复潜力［Ｊ］．生态学报，２０１２，３２（１）：１９８２０６．
［２１］ 张俊忠，陈秀蓉，杨成德，等．东祁连山高寒草地土壤可培养真菌多样性分析［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（２）：１２４１３２．
［２２］ 王国荣，陈秀蓉，张俊忠，等．东祁连山高寒灌丛草地土壤微生物生理功能群的动态分布研究［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（２）：
３１３８．
［２３］ 王剑锋，王璋，李江，等．漏斗多孔菌液体发酵产漆酶条件研究［Ｊ］．菌物学报，２００９，２８（３）：４４０４４４．
［２４］ 芦光新，陈秀蓉，杨成德，等．一株纤维素分解菌的鉴定及对两种草坪草凋落物分解活性的研究［Ｊ］．草业学报，２０１１，
２０（６）：１７０１７９．
［２５］ ＳｏｄｅｎＤ Ｍ，ＤｏｂｓｏｎＡＤ Ｗ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌａｃｃａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＰｌｅｕｒｏｔｕｓｓａｊｏｒｃａｊｕ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
２００１，１４７：１７５５１７６３．
［２６］ ＳｍｉｔｈＭ，ＳｈｎｙｒｅｖａＡ，ＷｏｏｄＤＡ，犲狋犪犾．Ｔａｎｄｅｍｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈｌｙｄｉｓｐａｒａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｌａｃｃａｓｅｇｅｎｅｓｌｃｃ１
ａｎｄｌｃｃ２ｉｎｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｍｕｓｈｒｏｏｍＡｇａｒｉｃｕｓｂｉｓｐｏｒｕｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１４４：１０６３１０６９．
［２７］ 赵敏，宋小双，杨谦，等．血红密孔菌（犘狔犮狀狅狆狅狉狌狊狊犪狀犵狌犻狀犲狌狊）漆酶基因的克隆与序列分析［Ｊ］．中国生物化学与分子生物
学报，２００４，２０（６）：８１５８２０．
［２８］ 初华丽，梁宗琦，韩燕峰．一株产生漆酶的耐高温膨大拟青霉大孢变种［Ｊ］．菌物研究，２００４，２（３）：４３４６．
［２９］ 郁红艳，曾光明，黄国和，等．简青霉犘犲狀犻犮犻犾犾犻狌犿狊犻犿狆犾犻犮犻狊狊犻犿狌犿 木质素降解能力［Ｊ］．环境科学，２００５，２６（２）：１６７１７１．
［３０］ 王剑锋，苏国成，刘建玲，等．烟管菌漆酶合成的营养条件研究［Ｊ］．食品与发酵工业，２００６，３２（２）：２０２４．
［３１］ 郑晓冰，郭丽琼，付小燕，等．木霉ＬａＴｒ０１菌株产漆酶发酵的条件［Ｊ］．生物加工过程，２００７，５（４）：１９２４．
１５２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
［３２］ 许云峰，张臻，周建芹，等．内生镰刀菌漆酶辅助提取槐米中总黄酮的研究［Ｊ］．中草药，２００８，３９（１１）：１６３７１６４０．
［３３］ 尹亮，陈章和，赵树进．白地霉产漆酶条件优化及对偶氮染料的脱色［Ｊ］．华南理工大学学报（自然科学版），２００８，３６（１２）：
８５９０．
［３４］ 刘敏，张明．一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究［Ｊ］．生物学杂志，２００８，２５（３）：４０４３．
［３５］ 张强．一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件研究［Ｊ］．广西轻工业，２００８，１０：１６１７．
［３６］ 吴振强，秦鹏，王菊芳，等．产耐温漆酶菌的筛选及培养基优化［Ｊ］．陕西科技大学学报，２００９，２７（１）：６８７３．
［３７］ 姜庆宏，赵敏，新月弯．孢霉产漆酶培养条件的优化［Ｊ］．农产品加工，２００９，３：６２６７．
［３８］ 陈今朝，王剑锋，李江，等．煤附生真菌产漆酶菌株的分离鉴定及产酶特性研究［Ｊ］．菌物学报，２０１０，２９（３）：３８９３９６．
［３９］ ＫｉｒｋＰＭ，ＣａｎｎｏｎＰＦ，ＤａｖｉｄＪＣ，犲狋犪犾．Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ＆Ｂｉｓｂｙ’ｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆｔｈｅＦｕｎｇｉ（９ｔｈｅｄ．）［Ｍ］．Ｗａｌｉｎｇｆｏｒｄ：ＣＡＢＩｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００１．
［４０］ 宋斌，邓春英，吴兴亮，等．中国小皮伞属已知种类及其分布［Ｊ］．贵州科学，２００９，２７（１）：１１８．
犛狋狌犱狔狅狀犪犾犪犮犮犪狊犲狆狉狅犱狌犮犻狀犵犳狌狀犵狌狊犳狉狅犿犪犾狆犻狀犲犵狉犪狊狊犾犪狀犱狊狅犻犾犻狀犲犪狊狋犲狉狀犙犻犾犻犪狀犕狅狌狀狋犪犻狀狊：
狊犮狉犲犲狀犻狀犵，犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀，犪狀犱犪犮狋犻狏犻狋狔犪狀犪犾狔狊犲狊
ＬＵＧｕａｎｇｘｉｎ１，ＷＡＮＧＪｕｎｂａｎｇ２，ＣＨＥＮＸｉｕｒｏｎｇ３，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇｄｅ３，ＸＵＥＬｉ３
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＣｏｌｅｇｅ，ＱｉｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｘｉｎｉｎｇ８１００１６，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｏｇｒａｐｈｉｃＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＮａｔｕｒｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，
ＣＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０１，Ｃｈｉｎａ；３．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｇａｎｓｕ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｓｉｘｔｙｆｉｖｅｆｕｎｇｉｓｔｒａｉｎｓｔｈａｔｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｌｐｉｎｅｇｒａｓｓｌａｎｄｓｏｉｌｉｎｔｈｅｅａｓｔｅｒｎＱｉｌｉａｎ
Ｍｏｕｎｔａｉｎｓｗｅｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄａｓｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｔｈｅｆｕｎｇｉｉｎｉｔｉａｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｃｕｌｔｕｒｉｎｇｏｎｔｈｅｍｅ
ｄｉｕｍｏｆｇｕａｉａｃｏｌＰＤＡａｎｄαｎａｐｈｔｈｏｌＰＤＡ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｆｕｎｇｉｗｉｔｈｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｔｏｐｒｏｄｕｃｅｌａｃｃａｓｅｓｗａｓ
ｓｃｒｅｅｎｅｄ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＮｏ．３１０ｂ）ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｃｏｌｏｎｙｓｉｚｅｓｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｓｏｆｇｕａｉａｃｏｌ，
ｃａｅｃｈｏｌ，ａｎｄｏｂｅｎｚｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｒｅｄｏｘｒｅａｃｔｉｏｎｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅｌａｃｃａｓｅｓｉｎｔｈｅｓｅｆｕｎｇｉｇｒｏｗｎ，ａｓ
ｗｅｌａｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌａｃｃａｓｅｓｉｎｔｈｅｓｅｆｕｎｇｉｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｔｈｅｓｔｅｍｓｏｆｏｉｌｒａｐｅ．ＢｙｒＤＮＡＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，
ｔｈｅｆｕｎｇｕｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犕犪狉犪狊犿犻狌狊狋狉犻犮狅犾狅狉．Ｔｈｅｎｅｌｅｍｅｎｔａｒｙｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｕｎｄｅｒｗｈｉｃｈｌａｃｃａｓｅｓ
ｗｅｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｆｕｎｇｕｓ（Ｎｏ．３１０ｂ）ｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌａｃｃａｓｅｓｉｎ
ｔｈｅｆｕｎｇｕｓｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｐｅａｋｗｈｅｎｉｔｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：２５℃，ｉｎｉｔｉａｌｐＨ４．０，ｓｕｃｒｏｓｅａｎｄｐｅｐ
ｔｏｎｅｔｈａｔｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｅｗｎｏｎｔｒｏｐｈｉｃｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｃａｌｓｓｈｏｗｅｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｆｕｎｇｕｓ．αｎａｐｈｔｈｏｌａｎｄＴｗｅｅｎ８０ｄｉｄｎｏｔｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎ
ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｆｕｎｇｕｓ，ｂｕｔｇｕａｉａｃｏｌ，ｔａｎｎｉｃａｃｉｄ，ａｎｄｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌａｃｃａｓｅｓ，
ｅｓｐｅｃｉａｌｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ｗｈｉｃｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ（犘＜０．０１）．ＷｈｅｎＣｕ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．００１－０．０２５ｇ／Ｌ，ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｓｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＣｕ２＋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｒｅａｃｈｉｎｇｔｈｅ
ｐｅａｋａｔ０．０２５ｇ／Ｌ．Ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｉｎｏｃｕｌｕｍｓｉｚｅｓ，ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ６０ｔｏ１８０
ｒ／ｍｉｎ，ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｗｈｅｎｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｔｈｅｐｏｗｄｅｒｏｆｏｉｌｒａｐｅｓｔｅｍｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０ｔｏ１ｇ，ｌａｃｃａ
ｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｂｕｔｗｈｅｎｔｈｅａｍｏｕｎｔｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ１，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｐｉｎｅｇｒａｓｓｌａｎｄｓｏｉｌ；ｌａｃｃａｓｅ；ｆｕｎｇｕｓ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
２５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２