全 文 ：书农杆菌介导犆犺犻犾犻狀犽犲狉犌犾狌融合基因和
犫犪狉基因转化玉米茎尖的研究
方永丰１，２，３，李永生２，彭云玲３，王芳３，王威３，穆延召２，王汉宁１，２，３
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；
３．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：真菌性病害和田间杂草严重影响着玉米产量及饲用品质，几丁质酶和β１，３葡聚糖酶催化病原真菌细胞壁的
水解反应，二者协同作用能够有效地抑制病原真菌生长。为了获得兼具真菌病及除草剂抗性的玉米种质新材料，
本研究通过对农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系的优化，将几丁质酶、β１，３葡聚糖酶的融合基因以及ｂａｒ基因
导入优良玉米自交系郑５８，用２００ｍｇ／Ｌ的Ｂａｓｔａ除草剂进行筛选，并对抗性植株进行了ＰＣＲ检测。结果表明，
ＬＢＡ４４０４菌液浓度（ＯＤ６００值）为０．６、乙酰丁香酮浓度为１５０μｍｏｌ／Ｌ、５０ｋＰａ负压侵染１２ｍｉｎ为最佳的遗传转化
条件；对除草剂筛选后的３２株抗性植株进行ＰＣＲ鉴定，有１３株为阳性植株，初步鉴定结果表明目的基因已经整合
进玉米基因组中。
关键词：玉米；真菌性病害；融合基因；农杆菌介导
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５１３．０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０５００６９０８
玉米（犣犲犪犿犪狔狊）在粮食生产、饲料及工业原料等方面发挥着重要作用，目前已成为世界上第一大粮食作
物［１］。真菌性病害（如大小斑病、茎腐病、穗粒腐病等）及田间杂草严重危害玉米的生长发育，导致玉米产量及品
质的下降，常规育种培育抗病玉米自交系周期长、效率低，很难满足生产需要。２０世纪７０年代兴起的植物基因
工程技术打破了物种之间基因交流的界限，可以将有利的外源基因导入受体植物中，为作物遗传改良带来了新的
途径。但是，单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，玉米遗传转化技术一直发展缓慢。１９８７年Ｇｒｉｍｓｌｅｙ等［２］首先
用农杆菌将玉米条纹病毒（ｍａｉｚｅｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ）的ｃＤＮＡ导入玉米幼苗分生组织或靠近生长点的部位，９８％的玉
米叶片表现出病毒感染性状，表明ＴＤＮＡ已经转化进玉米细胞，这一研究成果极大地推动了农杆菌介导的玉米
遗传转化研究。１９９６年Ｉｓｈｉｄａ等［３］用超双元载体转化Ａ１８８的幼胚，转化率高达５％～３０％，外源基因能够稳定
表达，并且７０％的转基因植株可育，该实验有力地证明了农杆菌对单子叶植株与双子叶植物具有相同的转化机
制，这是玉米遗传转化研究中里程碑式的工作。玉米遗传转化技术正日趋成熟，世界上有大批玉米转基因新品系
得到推广种植，取得了显著的经济及社会效益［４］。
目前常用的玉米遗传转化方法有基因枪法［５］、农杆菌介导法［３］，花粉管通道法［６，７］等，农杆菌介导法由于成本
低、操作方便而备受青睐。受体材料通常是幼胚或成熟胚的胚性愈伤组织，由于受基因型限制较大，生产上常用
的优良玉米自交系诱导愈伤困难，转基因技术难以大规模推广应用，因此选择取材方便且转化不受基因型限制的
转化系统成为玉米转基因研究的新方向。幼嫩茎尖的分生组织具有很强的分生能力，是玉米遗传转化的良好受
体，Ｓｉｄｏｒｏｖ等［８］用农杆菌侵染由幼苗茎段诱导的愈伤组织，转化率在２％～１０％，这一研究突破了受体取材的季
节限制，但茎段愈伤组织诱导明显受基因型限制；Ｗａｎｇ等［９］用农杆菌侵染损伤的玉米茎尖分生组织，虽然最终
转化率为０．６％，却具有不受季节及基因型限制、操作简单、转化周期短等优点，目前该方法已同时在棉花（犌狅狊
狊狔狆犻狌犿ｓｐｐ．）［１０］、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［１１］、玉米［１２１４］中得到应用。
几丁质（聚乙酰胺基葡聚糖，ｃｈｉｔｉｎ）和β１，３葡聚糖（β１，３ｇｌｕｃａｎ）是绝大多数真菌细胞壁的主要成分，而几
第２１卷 第５期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
６９－７６
２０１２年１０月
收稿日期：２０１２０２２２；改回日期：２０１２０４２０
基金项目：９７３计划前期研究专项（２０１２ＣＢ７２２９０２）和科技部农业科技成果转化资金项目（２０１０ＧＢ２Ｇ１００４８４）资助。
作者简介：方永丰（１９７６），男，甘肃临洮人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｆａｎｇｙｆ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｎ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ，Ｃｈｉ，ＥＣ３．２．１．１４）和β１，３葡聚糖酶（β１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｇｌｕ，ＥＣ３．２．１．３９）分别催化二者的水解
反应。Ｍａｕｃｈ等［１５］研究证实，β１，３葡聚糖酶和几丁质酶能够协同抑制真菌生长，他们分离并纯化了豌豆（犘犻
狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）豆荚中的β１，３葡聚糖酶和几丁质酶，经过体外抑菌试验证实用这２种酶共同处理１８种真菌之后，
其中１５种真菌的生长受到抑制，国内学者的研究［１６，１７］也证实了这一点。Ｂｒｏｇｌｉｅ等［１８］首次从菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊
狏狌犾犵犪狉犻狊）中分离出几丁质酶基因，并将其置于花椰菜花叶病毒（ＣａＭＶ）３５Ｓ启动子控制下转化烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪
狋犪犫犪犮狌犿）和油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊），转基因植株对猝倒病产生了一定的抗性；将几丁质酶基因和葡聚糖酶双
价基因导入水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、棉花、烟草、小麦等作物，转基因植株分别对稻瘟病、黄萎病、炭疽病和赤霉病等
真菌性病害表现出一定的抗性［１９２４］。目前将几丁质酶基因和β１，３葡聚糖酶基因同时转入玉米尚未见报道，本
研究采用ｐｂｉ１２１ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕｂａｒ植物表达载体［２５，２６］，通过转化骨干玉米自交系郑５８，以期获得具有抗真菌、
抗除草剂的玉米种质新材料，同时为多基因共同转化玉米提供相应的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
玉米自交系郑５８（由甘肃富农高科技种业有限公司提供），质粒ｐｂｉ１２１ｃｈｉｌｉｎｋｅｒｇｌｕｂａｒ（图１）及附有该质
粒的农杆菌工程菌 ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０５及 Ｃ５８ｃ１由本实验室保存。预混型 ＤＮＡ 聚合酶（ＰｒｅｍｉｘＴａｑ）、
ＤＬ２０００ＴＭＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自宝生物工程（大连）有限公司，ＰＣＲ检测引物由北京六合华大基因科技股份有限公司
合成，Ｂａｓｔａ除草剂购自西安罗森伯科技有限公司，乙酰丁香酮（ＡＳ）购自ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司，其他试剂为国产
或进口分析纯。
图１ 狆犫犻１２１狌犫犻犮犺犻犾犻狀犽犲狉犵犾狌狌犫犻犫犪狉载体结构图
犉犻犵．１ 犇犻犪犵狉犪犿狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犫犻１２１狌犫犻犮犺犻犾犻狀犽犲狉犵犾狌狌犫犻犫犪狉
１．２ 转化用培养基
ＹＥＰ培养基：牛肉膏１０ｇ／Ｌ、蛋白胨１０ｇ／Ｌ、氯化钠５ｇ／Ｌ（固体培养基加琼脂１５ｇ／Ｌ），ｐＨ值为７．０，１２１℃
灭菌１５ｍｉｎ。萌发培养基：ＭＳ＋蔗糖２０ｇ／Ｌ＋琼脂５．７ｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．８～６．０，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。重悬培养
基：ＭＳ＋蔗糖２０ｇ／Ｌ＋葡萄糖１０ｇ／Ｌ＋水解酪蛋白０．２ｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．１～５．５，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。
１．３ 农杆菌工程菌的制备
将附有载体的农杆菌在含有利福平（５０ｍｇ／Ｌ）和卡那霉素（５０ｍｇ／Ｌ）的ＹＥＰ固体培养基上划线培养１～２
ｄ，从平板上挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的ＹＥＰ液体培养基中２８℃振荡培养，培养至对数期（ＯＤ６００约为
０．５）后在４０００ｒ／ｍｉｎ转速、室温下离心５ｍｉｎ收集菌体，用重悬培养基稀释至不同浓度，侵染前加入乙酰丁香酮
（ＡＳ）。
１．４ 除草剂筛选浓度的确定
将Ｂａｓｔａ除草剂配成５０，１００，２００，５００，１０００ｍｇ／Ｌ五种不同质量浓度的水溶液，以蒸馏水作为空白对照，喷
洒培养１０ｄ后长势一致的郑５８非转基因植株，每个处理６０株，以叶片挂液珠为准，分别于第３，７，１５天观察叶
片变化，统计植株存活率，以确定转化植株的最佳筛选浓度。
１．５ 转化条件的选择
农杆菌菌液浓度选择：用ＯＤ６００为０．２，０．４，０．６，０．８及１．０的农杆菌重悬液侵染１０ｍｉｎ，统计转化率；农杆
菌侵染时间的选择：用ＯＤ６００为０．６的农杆菌对小苗茎尖分别侵染８～１６ｍｉｎ，统计转化率；菌株的选择：选用３
个不同的菌株ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０５及Ｃ５８ｃ１的农杆菌工程菌，菌液浓度ＯＤ６００值为０．６，侵染１０ｍｉｎ，统计转化
率；乙酰丁香酮（ＡＳ）浓度的选择：将重悬菌液中 ＡＳ浓度分别调整为５０，１００，１５０及２００μｍｏｌ／Ｌ，菌株选择
０７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
ＬＢＡ４４０４，用ＯＤ６００为０．６的农杆菌正常大气压下侵染１０ｍｉｎ，统计转化率；当农杆菌ＬＡＢ４４０４菌液浓度ＯＤ６００
值为０．６，ＡＳ浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ时，分别在正常大气压（１０１ｋＰａ）和５０ｋＰａ负压下侵染１０ｍｉｎ，统计转化率；以
上各因素均以除草剂抗性植株百分数作为评定标准，转化率（％）＝除草剂抗性植株数／移栽后成活植株数×
１００％，数据统计及多重比较采用Ｅｘｃｅｌ２０１０及ＳＰＳＳ１３．０完成。
１．６ 农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化
挑选整齐饱满的自交系种子，在超净工作台上进行消毒，依次为７０％乙醇８ｍｉｎ、升汞６ｍｉｎ、无菌水洗涤３
次，然后用加１．５倍种子体积无菌水室温下浸泡４～６ｈ后，再用升汞消毒１０ｍｉｎ、无菌水洗涤５次，放入底部垫
有无菌滤纸并用无菌水浸湿的培养皿中，２８℃黑暗条件培养３～４ｄ直到种子出芽。将发芽的种子转接至萌发培
养基上，２８℃黑暗条件下继续培养至芽长为４～６ｃｍ时在超净工作台上剥离胚芽鞘和幼叶，露出茎尖生长点，用
手术刀轻微损伤茎尖用于转化；将茎尖浸泡在农杆菌重悬液中并置于真空干燥器中在５０ｋＰａ的负压下侵染；结
束后用滤纸吸干种子上多余的菌液，接种在萌发培养基上２３℃黑暗条件下培养３ｄ，直至重新长出新叶。
共培养结束后，将长出新叶的转化苗用温水洗掉培养基和菌体，移栽到花盆后放入人工气候室中，光照强度
为５００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），白昼温度为２７／２２℃，光周期为１２ｈ／１２ｈ，湿度为６５％。大约２周后用Ｂａｓｔａ除草剂喷洒
叶片进行筛选，１０～１５ｄ后将存活的植株移栽至温室中。
１．７ 转基因玉米植株的分子检测
用ＣＴＡＢ法［２７］小量提取抗性植株叶片ＤＮＡ，０．８％琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ完整性，紫外分光光度计检
测浓度及纯度并稀释至２００ｎｇ／μＬ。以抗性植株叶片ＤＮＡ为模板，用融合基因特异检测引物ＣＬＧＦ：ＧＧＧＡＧ
ＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧ；ＣＬＧＲ：ＴＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣ（退火温度５５．７℃，产物大小６０７ｂｐ）及ｂａｒ
基因特异性检测引物ｂａｒＦ：ＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣ；ｂａｒＲ：ＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴ（退
火温度６１．３℃，产物大小４４０ｂｐ），载体质粒ＤＮＡ为阳性对照、非转化植株基因组ＤＮＡ为阴性对照进行降落
ＰＣＲ检测［２８］。ＰＣＲ反应体系：ＰｒｅｍｉｘＴａｑ１２．５μＬ，上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ，下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０
μＬ，模板ＤＮＡ１．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足２５μＬ。检测融合基因ＣｈｉＬｉｎｋｅｒＧｌｕ的ＰＣＲ反应程序为：９５℃预变性５
ｍｉｎ；９４℃变性３５ｓ，５５．７℃退火４０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，１０个循环；９４℃变性３５ｓ，５０．７℃退火４０ｓ，７２℃延伸１
ｍｉｎ，２５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃结束程序并保存。检测ｂａｒ基因的ＰＣＲ反应程序为：９５℃预变性５
ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，６１．３℃退火３０ｓ，７２℃延伸３５ｓ，１０个循环；９４℃变性３０ｓ，５６．３℃退火３０ｓ，７２℃延伸３５ｓ，
２５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃结束程序保存。
２ 结果与分析
２．１ 除草剂最佳筛选浓度的确定
Ｂａｓｔａ为非选择性广谱除草剂，主要成分是草丁
膦（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ），其中Ｌ草丁膦能够强烈抑制谷
胱甘肽合成酶（ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＧＳ，ＥＣ６．３．１．
２）的活性，从而导致植物体内由于氨基酸降解等过程
产生的氨的毒性无法解除最终使植株死亡。喷施除草
剂３ｄ后，植株停止生长，叶尖开始变黄；７ｄ后，喷施
高浓度除草剂的植株有一半死亡，低浓度有部分死亡；
１５ｄ后，喷施１０００，５００及３００ｍｇ／ＬＢａｓｔａ的植株全
部死亡，喷施２００，１００及５０ｍｇ／ＬＢａｓｔａ的植株存活
率分别为４．５％，５６．２％及８６．８％（表１），而对照植株
生长正常，因此选用２００ｍｇ／ＬＢａｓｔａ作为郑５８转基
因植株的最佳筛选浓度。
表１ 不同浓度犅犪狊狋犪对郑５８幼苗存活的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犅犪狊狋犪狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
狅狀狋犺犲狊狌狉狏犻狏犪犾狉犪狋犲狅犳犣犺犲狀犵５８狊犲犲犱犾犻狀犵狊
Ｂａｓｔａ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
Ｂａｓｔａ
（ｍｇ／Ｌ）
处理植株数
Ｎｏ．ｏｆｔｈｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｐｌａｎｔｓ
１５ｄ后存活植株数
Ｎｏ．ｏｆｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌ
ｐｌａｎｔｓａｆｔｅｒ
１５ｄａｙｓ
存活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅ
（％）
０ ６０ ５８ ９６．７
５０ ６０ ５２ ８６．８
１００ ６０ ３４ ５６．２
２００ ６０ ３ ４．５
５００ ６０ ０ ０
１０００ ６０ ０ ０
２．２ 菌液浓度和侵染时间对转化效率的影响
菌液浓度和侵染时间是影响农杆菌介导下植物遗传转化的主要因素，菌液浓度过低或过高，都会使转化效率
１７第２１卷第５期 草业学报２０１２年
下降。采用不同浓度的农杆菌重悬液对茎尖进行侵染后，转化效率呈先上升后下降的趋势（图２），其中以ＯＤ６００
值为０．６时侵染效果最佳，平均转化效率达到４．５％，与其他浓度相比存在极显著差异（犘＜０．０１）。在最佳的菌
液浓度下，选择适当的侵染时间可以有效提高转化效率，本试验设置６～１４ｍｉｎ共５个侵染时间，结果发现侵染
６～１４ｍｉｎ其转化率的差异达到显著水平（犘＜０．０５）（图３），相比而言，侵染１２ｍｉｎ后其转化效果最好。
图２ 菌液浓度对转化效率的影响
犉犻犵．２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犾犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀
狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔
图３ 侵染时间对转化效率的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犻狀犳犲犮狋犻狅狀犱狌狉犪狋犻狅狀狅狀
狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔
图４ 不同菌株对转化效率的影响
犉犻犵．４ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狉犪犻狀狊狅狀
狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔
图５ 犃犛浓度对转化效率的影响
犉犻犵．５ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犃犛犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀
狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔
２．３ 不同菌株对转化效率的影响
图６ 渗透压力对转化效率的影响
犉犻犵．６ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狅狊犿狅狋犻犮狆狉犲狊狊狌狉犲狅狀
狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔
根癌农杆菌可分为３大菌系，分别为胭脂碱型、章
鱼碱型以及琥珀碱型，不同菌系的菌株对植物的侵染
能力有所不同。用３个不同菌系的农杆菌侵染玉米茎
尖，转化效率之间的差异达到了极显著水平（犘＜
０．０１），其侵染能力从大到小依次为ＬＢＡ４４０４（章鱼碱
型）＞ＥＨＡ１０５（琥珀碱型）＞Ｃ５８ｃ１（胭脂碱型），选用
ＬＢＡ４４０４和ＥＨＡ１０５均可达到一定的转化率，而选
用Ｃ５８ｃ１的转化效率较低（图４）。
２．４ 乙酰丁香酮浓度及真空渗透对转化效率的影响
农杆菌Ｖｉｒ区基因的活化及表达受到酚类物质的
诱导，而乙酰丁香酮是主要的创伤信号或创伤诱导因
２７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
子，单子叶植物遗传转化困难的主要原因之一是由于细胞中不能积累足够的酚类物质造成的［２９］。将侵染液中乙
酰丁香酮的浓度调整为１５０μｍｏｌ／Ｌ时转化效率较高（图５），与其他浓度相比差异极显著（犘＜０．０１）。在侵染的
同时施以５０ｋＰａ的负压进行真空渗透能显著提高转化效率（犘＜０．０１）（图６）。
结果显示，本试验中农杆菌介导玉米茎尖遗传转化的最佳体系为ＬＢＡ４４０４菌液浓度ＯＤ６００值为０．６、乙酰丁
香酮浓度为１５０μｍｏｌ／Ｌ、５０ｋＰａ负压下侵染１２ｍｉｎ。
图７ 农杆菌介导玉米茎尖遗传转化
犉犻犵．７ 犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊犿犲犱犻犪狋犲犱犵犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犿犪犻狕犲狊犺狅狅狋犪狆犻犮犪犾犿犲狉犻狊狋犲犿．
Ａ：萌发４ｄ的玉米茎尖Ｔｈｅｓｔｅｍａｐｅｘｏｆｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇａｆｔｅｒｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｆｏｒ４ｄ；Ｂ：侵染前的茎尖Ｔｈｅｓｔｅｍａｐｅｘｂｅｆｏｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｃ：共培养结
束后的幼苗Ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇａｆｔｅｒｃｏｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄ：移栽至花盆后的幼苗Ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｎｔｏｐｏｔ；Ｅ：除草剂筛选后抗性植株Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｆｔｅｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．
图８ 抗性植株中融合基因犆犺犻犔犻狀犽犲狉犌犾狌的犘犆犚检测
犉犻犵．８ 犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犳狌狊犲犱犵犲狀犲犆犺犻犔犻狀犽犲狉犌犾狌犻狀狉犲狊犻狊狋犪狀狋狆犾犪狀狋狊
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准 ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ＣＫ＋为阳性对照 Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＫ－为阴性对照 Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；１～６为抗性植株 Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｐｌａｎｔｓ．下同 Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．
图９ 抗性植株中犫犪狉基因的犘犆犚检测
犉犻犵．９ 犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犫犪狉犻狀狉犲狊犻狊狋犪狀狋狆犾犪狀狋狊
３７第２１卷第５期 草业学报２０１２年
２．５ 遗传转化及Ｔ０ 代转基因植株的分子检测
玉米茎尖遗传转化各阶段如图７所示。ＣＴＡＢ法提取３２株抗性植株叶片基因组ＤＮＡ，以质粒ＤＮＡ扩增产
物为阳性对照，以未转植株ＤＮＡ扩增产物为阴性对照，进行降落ＰＣＲ检测（图８，９）。结果显示，有１３株抗性植
株分别在６０７和４４０ｂｐ附近扩增出特异条带，而未转化植株没有相应条带出现，抗性植株的ＰＣＲ阳性率为
４０％，采用茎尖遗传转化法转化率为２．６％，初步证明外源目的基因已整合进玉米基因组中。
３ 讨论
除草剂临界浓度的确定对于转化体筛选至关重要。蒋晓芳［３０］、王琨等［３１］用昌７２和郑５８进行除草剂临界
浓度筛选，确定的最佳浓度为２００ｍｇ／Ｌ，本试验中确定的最佳筛选浓度也为２００ｍｇ／Ｌ，其致死率为９５．５％。对
转化植物的ＰＣＲ检测结果表明，使用该浓度进行筛选后抗性植株阳性率为４０％，表明该临界浓度会产生较多的
假阳性植株，但可以避免由于除草剂浓度过高而杀死部分阳性植株造成转化率降低。在遗传转化试验中，应根据
具体的受体材料基因型确定最适筛选浓度。
农杆菌菌液浓度是影响转化效率的主要因素，菌液浓度过高，外植体上附着过多的农杆菌，会严重影响转化
植株的后期生长；菌液浓度过低，外植体上农杆菌附着不足，转化效率低下［３２，３３］。本研究中菌液浓度以ＯＤ６００值
为０．６时转化效率最高，这与孙传波等［１３］的研究结果一致。因为此时的农杆菌接近对数生长期，侵染活力较强，
同时在该浓度下进行侵染对茎尖的伤害也较小，随着菌液浓度增大，转化植株在后期会出现心叶枯死，造成转化
效率下降，这可能是由于农杆菌菌体密度较大，部分植株由于菌体附着过多导致过早死亡。巩健和杨芳［１２］的研
究结果表明玉米茎尖遗传转化侵染时间为５～１０ｍｉｎ均可，本研究选用６～１４ｍｉｎ共５个侵染时间进行侵染后
发现，适当延长侵染时间可以有效提高转化效率，随着侵染时间的增长，转化效率有所提高，但以侵染１２ｍｉｎ后
最佳。有研究表明［３４］，单子叶植物遗传转化以附有超双元载体的农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４进行侵染效果最好，本试
验中采用不同农杆菌菌株进行侵染，经过除草剂筛选后也发现ＬＢＡ４４０４转化效率最高，Ｃ５８ｃ１最低。
目前报道的玉米遗传转化所用的外植体材料主要是幼胚和成熟胚及其愈伤组织，用于愈伤组织诱导的玉米
材料仅限于Ａ１８８、ＨⅡ及其衍生品种，其中以 ＨⅡ的幼胚愈伤组织的转化效率最高［３５］。尽管如此，由于幼胚的
取材受到季节限制而且玉米幼胚的离体培养基因型依赖性强，使得玉米遗传转化技术的应用受到了限制。
以茎尖分生组织作为受体材料，由于茎尖分生组织在经过农杆菌侵染后很容易再生出植株，避免了组织培养
过程，同时克服了由于基因型障碍造成转化植株再生困难的缺点，该方法可以作为改良国内骨干玉米自交系中个
别不良性状的首选方法。采用茎尖遗传转化系统得到的Ｔ０ 代植株往往为嵌合体，因而不能在Ｔ０ 代进行过多鉴
定，ＰＣＲ检测只能初步证明外源基因是否整合进植物基因组中，其整合特性还需采用分子杂交等方法对后代植
株进行进一步鉴定分析。
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犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犿犪犻狕犲狊犺狅狅狋犪狆犻犮犪犾犿犲狉犻狊狋犲犿
犫狔犻狀狋狉狅犱狌犮犻狀犵犳狌狊犲犱犵犲狀犲犆犺犻犾犻狀犽犲狉犌犾狌犪狀犱犫犪狉
ＦＡＮＧＹｏｎｇｆｅｎｇ１，２，３，ＬＩＹｏｎｇｓｈｅｎｇ２，ＰＥＮＹｕｎｌｉｎｇ２，ＷＡＮＧＦａｎｇ２，
ＷＡＮＧＷｅｉ３，ＭＵＹａｎｚｈａｏ２，ＷＡＮＧＨａｎｎｉｎｇ１，２，３
（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄ＆ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｒｉｄｌａｎｄＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｍｏｓｔｍａｉｚｅｄｉｓｅａｓｅａｒｅｃａｕｓｅｄｂｙｆｕｎｇｉｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｓｕｃｈａｓｎｏｒｔｈｅｒｎｌｅａｆｂｌｉｇｈｔ，ｓｏｕｔｈｅｒｎｌｅａｆｂｌｉｇｈｔ，
ｅａｒａｎｄｓｔａｌｋｒｏｔｓ，ａｎｄｓｏｏｎ．Ｉｎｎｏｒｍａｌｙｅａｒｓ，ｔｈｉｓｄｉｓｅａｓｅｍａｋｅｓｍａｉｚｅｙｉｅｌｄｌｏｓｔｂｙ１０％ａｎｄｔｈｉｓｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｍａｙｂｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ３０％－４０％ｉｎｉｔｓｐｏｐｕｌａｒｙｅａｒｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｉｓｖｅｒｙｄｉｆｆｉｃｕｌｔｆｏｒｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｂｒｅｅｄｉｎｇｔｏ
ｄｅｖｅｌｏｐａｎｅｌｉｔｅｍａｉｚｅｍａｔｅｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｌｔｈｅｆｕｎｇｉｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅｃａｎｕｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｍｅｔｈｏｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｏｍａｉｚｅｉｎｏｒｄｅｒｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｃｈｉｔｉｎａｓｅａｎｄβ１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅａｒｅｔｗｏｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｎｚｙｍｅｓｗｈｉｃｈｐｌａｙａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｒｅ
ａｃｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌｃｅｌｗａｌ，ｓｏｉｔｉｓｕｓｅｆｕｌｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｆｕｎｇｉｄｉｓｅａｓｅ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ
ｂａｒａｒｅｕｓｕａｌｙｕｓｅｄａｓａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｉｎｍａｉｚｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｉｓｔｏｉｎｔｒｏｄｕｃｅ
ｔｈｅｆｕｓｅｄｇｅｎｅｏｆｃｈｉｔｉｎａｓｅａｎｄβ１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅａｎｄｂａｒａｓｗｅｌｉｎｔｏｅｌｉｔｅｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄＺｈｅｎｇ５８ｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｉｔｓ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｆｕｎｇｉｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅｗｏｕｎｄｅｄｓｈｏｏｔａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍ （ＳＡＭ）ｏｆｇｅｒｍｉｎａｔｅｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓ
ｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｗｅｒｅｐｏｒｔｈｅｒｅ：１）Ａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓ
ｔｅｍｆｏｒ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿 ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｈｏｏｔａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍ，ｕｓｉｎｇｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ（ｔｈｅｖａｌｕｅｏｆＯＤ６００ｗａｓ０．６）ｆｏｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆ１５０μｍｏｌ／Ｌａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（ＡＳ）ｉｎｔｈｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，ｔｈｅｗｈｏｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎａｖａｃｕｕｍｄｅｓｉｃｃａｔｏｒｓｗｉｔｈａｎｅｇａｔｉｖｅｐｒｅｓ
ｓｕｒｅｏｆ５０ｋＰａｆｏｒ１２ｍｉｎｕｔｅｓ．２）ＩｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅａｎｄＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，１３ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｍｏｎｇｔｈｅ３２ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓ，ａｎｄｔｈｅｏｖｅｒａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓ
２．６％．Ｔｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｖｉｄｅｎｃｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｓｈａｄｂｅｅｎｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍａｉｚｅｇｅｎｏｍｅ．
Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｅｄｔｈｅｌｏｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｔｅｐａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅａｓｏｎｓ，ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，
ｍａｎｙｅｌｉｔｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈａｒｅｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔｉｎｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｃａｎｂｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｂｙｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊）；ｆｕｎｇａｌｄｉｓｅａｓｅｓ；ｆｕｓｅｄｇｅｎｅ；犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅ
６７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５