全 文 :书玉米穗腐病样品中黄色镰孢的分离鉴定及
狉犇犖犃犐犜犛序列分析
郭成1,魏宏玉1,郭满库1,何苏琴1,郭建国1,王晓鸣2,3
(1.甘肃省农业科学院植物保护研究所,甘肃 兰州730070;2.中国农业科学院作物科学研究所,
北京100081;3.国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程,北京100081)
摘要:为了明确甘肃玉米穗腐病的病原菌,于2009年9月在甘肃省四大生态区采集玉米穗腐病样品,以组织分离
法进行病原物的分离培养,对分离得到的镰孢菌菌落进行纯化和单孢分离后,以形态学为基础,参照Leisle分类系
统进行鉴定。结果表明,分离到271株镰孢菌菌株中有105株经形态学鉴定为黄色镰孢,占分离镰孢菌的38.7%。
分析发现黄色镰孢种群数量随采样区而异,陇东和陇南地区采集的样品中分离频率分别为52.0%,55.4%,本研究
充分证明了黄色镰孢是甘肃省陇东和陇南地区玉米穗腐病的优势病原菌。按照柯赫氏法则用混合菌株接种法对
沈单16和金穗96832进行致病性测定,证实了黄色镰孢对玉米果穗的致病性。随机选取3株黄色镰孢菌株进行
rDNAITS基因序列分析,将PCR产物回收测序后在GenBank上比对,菌株311与GenBank中登记的黄色镰孢
菌株K1004和K216、641和2121与黄色镰孢菌株CBS122.73亲缘关系最近,同源性达99%。利用DNAStar软
件绘制其系统发育树状图,结果表明,菌株311与K1004和K216、菌株641和2121与CBS122.73位于系统发
育树的同一分支,聚为一类,与形态学的鉴定结果一致。
关键词:玉米穗腐病;黄色镰孢;rDNAITS
中图分类号:S816;S513.01 文献标识码:A 文章编号:10045759(2013)02017107
玉米(犣犲犪犿犪狔狊)是禾本科(Poaceae)一年生粮食、饲料、油料和工业原料作物[14]。玉米穗腐病主要是由镰孢
菌引起果穗霉烂的一种世界性真菌病害[5]。近年来,随着少、免耕栽培技术的推广,该类病害的危害日益加重,严
重影响着玉米的产量和品质,病菌产生的脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)、雪腐镰孢菌烯醇(NIV)、T2和玉米赤霉
烯酮(ZOH)等毒素危及人畜的生命安全[68]。国内外有关穗腐病研究结果表明,该类病害的初侵染源、发病条件
和病原结构比较复杂,种子带菌、虫体带菌以及虫害造成的伤口是病菌初侵染的主要途径[911];品种抗性、环境条
件、种植密度和虫害严重度对玉米穗腐病的发生和扩展有重要影响[1115];禾谷镰孢、轮枝镰孢、青霉菌、曲霉菌、枝
孢菌、粉红单端孢菌等20多种真菌是该类病害的重要病原物,其中禾谷镰孢和轮枝镰孢为优势病原菌[710,1618]。
不同地区之间玉米穗腐病的优势病原差异较大,Schaafsma等[8]研究表明加拿大玉米穗腐病主要致病镰孢菌为
胶孢镰孢、轮枝镰孢和禾谷镰孢;Grtz等[16]报道了德国玉米产区主要致病菌为轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种及层
出镰孢;Anjorin等[17]在非洲尼日尔分离得到的病原菌主要以曲霉、镰孢菌和根霉为主;Desjardins和Proctor[19]
及Sampietro等[20]分别在尼泊尔和阿根廷西北部发现禾谷镰孢复合种犉.犿犲狉犻犱犻狅狀犪犾为优势病原菌。国内李洪
连等[21]报道了蠕孢菌为山西省和辽宁省玉米穗腐病的优势致病菌。卢维宏等[22]2009年在河南省南阳市6个县
区采集玉米穗腐病样品进行病原菌的分离鉴定后,层出镰孢为南阳市的优势种群。张婷等[23]研究发现东北地区
优势病原菌为半裸镰孢。2009和2010年,任旭[18]在全国14省(直辖市)63县区102份玉米穗腐病材料中检测
到11属真菌,其中镰孢菌占优势;在引致玉米穗腐病的镰孢菌中,轮枝镰孢和禾谷镰孢复合种犉.犵狉犪犿犻狀犲犪狉狌犿
clade为优势致病种。因此,防治该病害需在明确当前或当地优势病原菌的前提下进行才有意义。
第22卷 第2期
Vol.22,No.2
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA
171-177
2013年4月
收稿日期:20120412;改回日期:20120608
基金项目:农业部作物种质资源保护项目(NB09213013511515)资助。
作者简介:郭成(1985),男,甘肃会宁人,研实员,硕士。Email:gsguoch@126.com
通讯作者。Email:gmanku@163.com
基于形态特征的生物鉴定虽能客观反映其在菌物界的分类地位,但很难反应复合种菌群的遗传变异机
制[24,25]。rDNA内转录间隔区(ITS)作为一种遗传标记,既有保守性又在科、属、种水平上有特异性序列的特性,
对ITS区进行扩增、测序及序列分析后设计特异性引物检测真核生物,是当前复杂真菌分类研究的首选方
法[26,27]。所以,本研究利用形态学特征与分子生物学相结合的手段,初步明确了黄色镰孢是甘肃省陇东和陇南
地区玉米穗腐病的优势病原菌,旨在为该病害的综合防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病样采集及病原菌的分离
2009年9月,在甘肃省四大生态区(陇东地区、陇南地区、陇中地区和河西地区)采集全膜双垄沟播栽培田块
玉米穗腐病样品[28],自然条件下风干后,分装在保鲜袋中带回实验室,对病穗进行症状描述并拍照。参照文献
[21]进行病原菌的分离,将PDA上得到的镰孢菌菌落纯化至CLA(carnationleafpieceagar:灭菌康乃馨叶片3、
4张,琼脂20g,蒸馏水1000mL)上,置于培养箱中培养3d。纯化培养后采用稀释法进行单孢分离[29],至CLA
和PDA(马铃薯200g,葡萄糖15g,琼脂20g,蒸馏水1000mL)上。根据培养性状进行形态学鉴定,确定出现
频率较高的优势菌株。
1.2 镰孢菌的形态学鉴定
参照Leslie和Summerel[29]分类系统,依据PDA培养基上的培养性状、72h后的菌落直径;CLA培养基上
大、小型分生孢子的有无,分生孢子的形态及产生方式;厚垣孢子的有无以及着生方式等特征进行形态鉴定。
1.3 镰孢菌的分子生物学鉴定
在形态学特征鉴定的基础上,从分离获得的优势病原菌中,随机选取供试菌株211、641和2121分别用
马铃薯蔗糖液体培养基培养,离心后用滤纸过滤回收菌丝体。基因组DNA 的提取与纯化根据修改后的Paul[30]
的方法进行。ITS区域PCR扩增采用真菌rDNAITS区域通用引物ITS1:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG
3′和ITS4:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′(由上海生工合成)。以25μL体系进行PCR扩增
[26],扩增后
的产物送上海生工公司测序。获得的序列与从GenBank数据库中获得的部分镰孢菌种类的rDNAITS序列进
行比较,利用DNAStar软件进行聚类分析,构建同源性树。供试菌株及来源见表1。
表1 供试镰孢菌菌株及其来源
犜犪犫犾犲1 犛狅狌狉犮犲狊狅犳犉狌狊犪狉犻狌犿犻狊狅犾犪狋犲狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
菌株Isolates 种名Species 序列Sequence 采样时间Colectingdate 采样地点Location
311 黄色镰孢犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 rDNAITS 2009.09 甘肃庆阳 Qingyang,Gansu
641 黄色镰孢犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 rDNAITS 2009.09 甘肃庆阳 Qingyang,Gansu
2121 黄色镰孢犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 rDNAITS 2009.09 甘肃天水 Tianshui,Gansu
1.4 镰孢菌的致病性测定
将菌株311、641和2121混合培养15d后[31],利用双牙签接种于吐丝2~3周内健康的沈单16和金穗
96832果穗上[12],成熟期调查病穗率。后取病穗病健交界处的籽粒,于PDA上分离和纯化后,观察分离菌株与
接种菌株的形态差异。
2 结果与分析
2.1 黄色镰孢菌的为害症状及分布
黄色镰孢引起的玉米穗腐病,多从果穗顶部或中部向下蔓延,顶部或中部变红色、呈腐烂状,籽粒上或籽粒间
产生白色霉状物。发病较重时整个果穗全部腐烂,以自交系为重。发病轻时果穗色泽正常,只有脱粒时才能发现
籽粒间布满菌丝体。图1为自然感染和人工接种后的病样图片。2009年在甘肃陇东、陇南、陇中和河西地区共
得到镰孢菌271株,其中黄色镰孢105株。陇东地区(合水县、华池县、宁县和泾川县)共分离得到镰孢菌100株,
黄色镰孢52株,分离频率为52.0%;陇南地区(秦城区、甘谷县、武都区、成县和徽县)黄色镰孢占55.4%;陇中地
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区(陇西县和康乐县)黄色镰孢的分离频率为17.5%;
图1 玉米穗腐病田间症状及接种黄色镰孢后症状
犉犻犵.1 犉犻犲犾犱狊狔犿狆狋狅犿狊狅犳犿犪犻狕犲犲犪狉狉狅狋犪狀犱
狋犺犲狊狔犿狆狋狅犿狊犻狀狅犮狌犾犪狋犲犱犫狔犉.犮狌犾犿狅狉狌犿
A:自然感染Naturalinfection;B:人工接种Artificialinoculation.
河西地区未分离到黄色镰孢(表2)。
2.2 黄色镰孢菌的形态特征
在PDA上繁殖较快,25℃黑暗培养下生长速度
为53mm/72h,菌丝繁茂致密,表面浅黄色,菌落背面
产生玫瑰红色素。CLA培养基上未见小型分生孢子;
大型分生孢子为大刀型或马特型,隔膜0~6个,大多
3~5隔,足胞乳突状,顶胞钝圆或稍尖,产孢细胞单瓶
梗,梗短;厚垣孢子串生或无(图2)。
根据105株菌株在PDA培养基上的菌落形态和
颜色、CLA培养基上大型分生孢子的形状和隔膜数
量、小型分生孢子的有无以及厚垣孢子的特点,将其鉴
定为黄色镰孢[29,32](犉.犮狌犾犿狅狉狌犿)。
表2 黄色镰孢的地域分布
犜犪犫犾犲2 犜犺犲犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犉.犮狌犾犿狅狉狌犿
生态区
Ecological
areas
镰孢菌总菌株数
Totalisolatesof
犉狌狊犪狉犻狌犿
黄色镰孢菌株数
Isolatesof
犉.犮狌犾犿狅狉狌犿
分离频率
Isolatefrequency
(%)
分布地域
Distribution
陇东地区EasternGansu 100 52 52.0 合水县、华池县、宁县和泾川县Heshuicounty,Huachicounty,
NingcountyandJingchuancounty
陇南地区SouthernGansu 83 46 55.4 秦城区、甘谷县、武都区、成县和徽县Qinchengdistrict,Gangu
county,Wududistrict,ChengcountyandHuicounty
陇中地区CentralGansu 40 7 17.5 陇西县和康乐县LongxicountyandKanglecounty
河西地区 WesternGansu 48 0 0
合计 Total 271 105 38.7
图2 黄色镰孢形态特征
犉犻犵.2 犜犺犲犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犉.犮狌犾犿狅狉狌犿
A:PDA上的菌落形态ThecolonymorphologyonPDA;B:在PDA中产生的玫瑰红色素TherosepigmentinPDA;C:厚垣孢子Chlomydospores;
D:大型分生孢子 Macrospores.
2.3 rDNAITS序列分析
以ITS1和ITS4为引物,对菌株311、641和2121的基因组DNA进行PCR扩增后,将PCR产物纯化
后测序,得到了大小分别为549、549和548bp的片段,GenBank中登录号分别为JX125045、JX125046和
JX125047。菌株311、641和2121的ITS基因泳带及大小见图3。
371第22卷第2期 草业学报2013年
图3 引物犐犜犛1和犐犜犛4扩增菌株311、641、2121后的犘犆犚产物片段大小
犉犻犵.3 犅犪狀犱狊狅犳犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狆狉狅犱狌犮犲犱犫狔犻狊狅犾犪狋犲311,641,2121犪狋狆狉犻犿犲狉狊狊犲狋犐犜犛1犪狀犱犐犜犛4
将条带回收测序后在GenBank上比对后,菌株311与GenBank中的K1004和K216、菌株641和2121
与CBS122.73的亲缘关系最近,同源性达99%。相关镰孢菌菌株的背景及其ITS序列长度见表3。利用
DNAStar软件绘制其系统发育树状图,结果表明,菌株311与2个英国菌株K1004和K216、菌株641和212
1与1个波兰菌株CBS122.73的亲缘关系最近,位于系统发育树的同一分支,聚为一类(图4)。
核糖体DNAITS基因的序列分析证实了本研究采用形态学特征鉴定黄色镰孢的结果是准确的。
表3 相关镰孢菌菌株的背景及其犐犜犛序列长度
犜犪犫犾犲3 犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆犲犮犻犲狊犪狀犱狋犺犲犻狉犐犜犛犾犲狀犵狋犺狊
种名
Species
菌株
Isolates
寄主
Host
国家
Country
ITS序列长度
LengthsofITS(bp)
基因库登录号
GenBankaccessionNo.
黄色镰孢犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 K1004 未知Unknown 英国UnitedKingdom 553 AY147334
黄色镰孢犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 K216 未知Unknown 英国UnitedKingdom 561 AY147323
黄色镰孢犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 CBS122.73 未知Unknown 波兰Poland 548 DQ453703
3 结论与讨论
本研究从甘肃省不同生态区的玉米穗腐病样中分离到271株镰孢菌菌株,经形态学鉴定105株为黄色镰孢,
占分离镰孢菌的38.7%。进一步证实了黄色镰孢是甘肃省玉米穗腐病的主要病原菌,同时发现四大生态区玉米
穗腐病的病原组成差别较大,陇东地区和陇南地区黄色镰孢的分离比例较高,为该地区优势病原菌。
通过形态学鉴定镰孢菌向来是研究者的难题,因为相近种在形态学上差别很小[33]。黄色镰孢在PDA上的
菌落形态与克鲁克威尔镰孢(犉.犮犲狉犲犪犾犻狊)和禾谷镰孢(犉.犵狉犪犿犻狀犲犪狉狌犿)非常相似,但是大型分生孢子的形状是
这个种的鉴定特征。可依据CLA上黄色镰孢的大型分生孢子较短胖,大刀型或马特型;克鲁克威尔镰孢的大型
分生孢子中间胖,两端尖,较直;禾谷镰孢的大型分生孢子较长,两头稍弯等特征加以鉴别。单从形态方面界定的
镰孢菌种类由于缺乏系统发育的分子生物学证据,很难令人信服鉴定结果的准确性。核糖体DNA上的ITS序
列由于进化速度快,表现出广泛的序列多态性,其在不同的分类水平上都具有各自的特异分子标记,不仅能够正
确定义生物在种水平上的概念,而且能够鉴定近缘物种间的亲缘关系,已成为真菌在种和亚种水平上分类鉴定的
有效手段[26,27]。有研究表明利用ITS对镰孢菌进行种间的分类鉴定是稳定可行的,但对于种内及专化型的鉴定
存在困难[3436]。因此,本研究在形态学鉴定的基础上,采用核糖体DNAITS基因序列分析作为辅助鉴别手段,
提高了鉴定结果的准确性。
471 ACTAPRATACULTURAESINICA(2013) Vol.22,No.2
图4 菌株311、641和2121的遗传聚类分析图谱
犉犻犵.4 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犻狊狅犾犪狋犲311,641犪狀犱2121
括号中为相关菌株的GenBank登录号。ThenumbersinparenthesesrepresenttheaccessionnumbersinGenBank.
玉米穗腐病在全国玉米产区均有不同程度发生[523],2009和2010年在甘肃不同生态区调查发现,陇南地区
发病严重,中部地区和河西地区发病偏重,陇东地区相对较轻。田间初步观察发现,品种间发病程度存在明显差
异,玉米自交系发病重于杂交种。
黄色镰孢常以腐生或弱寄生的方式习居在温带地区,作为玉米穗腐病的病原菌,在欧洲、加拿大、美国、德国、
尼泊尔和我国均有报道[7,8,3739],与本研究结果基本一致。本研究明确了玉米穗腐病病原黄色镰孢在甘肃的地域
分布,可为病原菌的田间监测和该病害的综合防治提供科学依据。黄色镰孢产生 T2、脱氧雪腐镰孢菌烯醇
(DON)、雪腐镰孢菌烯醇(NIV)、玉米烯酮(ZEN)和玉米赤霉烯酮(ZOH)等毒素[68,40],能引起人畜中毒。本研
究分离得到的105个菌株能否产生毒素、产生毒素的种类及遗传多样性等问题有待进一步研究。
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犐狊狅犾犪狋犻狅狀,犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犇犖犃犐犜犛犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳
犉狌狊犪狉犻狌犿犮狌犾犿狅狉狌犿犳狉狅犿犿犪犻狕犲犲犪狉狉狅狋狊犪犿狆犾犲狊
GUOCheng1,WEIHongyu1,GUOManku1,HESuqin1,GUOJianguo1,WANGXiaoming2,3
(1.InstituteofPlantProtection,GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China;
2.InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,
China;3.TheNationalKeyFacilityforCropGeneResourcesand
GeneticImprovement,Beijing100081,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:ToidentifypathogensofmaizeearrotinGansuprovince,sampleswerecolectedfrom4ecological
zonesinSeptember,2009andthepathogenswereisolatedfromcankeredmaizeearontoastandardmedium.
犉狌狊犪狉犻狌犿coloniesobtainedwereidentifiedaccordingtotheLeisletaxonomicsystemaftersubcultureandsin
glesporeisolation.Of271isolates,105wereidentifiedas犉.犮狌犾犿狅狉狌犿,contributingabout38.7%ofthe犉狌
狊犪狉犻狌犿isolates.Thepopulationsdifferedindifferentecologicalareas,forexample,犉.犮狌犾犿狅狉狌犿 wasthe
dominantpathogeninLongdongandLongnanecologicalareas,whereitsisolationfrequencieswere52.0%and
55.4%respectively.Thepathogenicityof犉.犮狌犾犿狅狉狌犿wastestedaccordingtoKoch’sPostulateusingmixed
isolatesonmaizevarietiesShendan16andJinsui96832.犉.犮狌犾犿狅狉狌犿wasverifiedaspathogenictomaizeears.
Three犉.犮狌犾犿狅狉狌犿isolatesweretakenatrandomforsequencesanalysisoftherDNAITSgene.ThePCR
productsofthethreeisolateswerecolected,purified,andsequenced.ThesequenceswerealignedinGenBank.
Therewasaverycloserelationshipofisolates311withK1004andK216,641and2121withCBS122.73
downloadedfromGenBank.Theirmaximumsimilaritywas99% with犉.犮狌犾犿狅狉狌犿.MicrosoftDNAStarwas
usedtodrawthephylogenetictreeofisolates311,641and2121.Thistreeshowedthat311wasinthe
sameclusterastheK1004whileK216isolates,641and2121wereinthesameclusterastheCBS122.73iso
late,resultsthatwereconsistentwithmorphologicalidentification.
犓犲狔狑狅狉犱狊:maizeearrot;犉狌狊犪狉犻狌犿犮狌犾犿狅狉狌犿;rDNAITS
771第22卷第2期 草业学报2013年