全 文 ：书犐犛犛犚分子标记对９种狗牙根的鉴定分析
刘君，赵琴，杨志民
（南京农业大学草坪研究与开发工程技术中心，江苏 南京２１００９５）
摘要：狗牙根是全球最重要品种最丰富的暖季型草坪草种之一，种或品种间形态相同，传统的形态学方法、田间区
试法等不能准确作出鉴定，ＩＳＳＲ分子标记被认为是目前准确高效的品种鉴定技术。本试验以９种常用狗牙根为对
象，利用ＩＳＳＲ标记技术对９份材料间的遗传多样性进行了研究，构建了９份材料的指纹图谱。由ＩＳＳＲ标记分析
结果可知，１３条引物组合共获得５４条清晰可辨的总条带，多态性条带数３４条，平均每对引物扩增出４．１条带，多
态性位点百分率为６４．１５％，品种间的遗传相似系数（ＧＳ）范围在０．５４７～０．９６２，变幅为０．４１５，说明供试材料具有
比较丰富的遗传多样性。ＵＰＧＭＡ聚类分析结果表明，ＧＳ＝０．８０６时，９种常用狗牙根品种可聚为５类。黑杰克和
南京狗牙根为第１类，普通狗牙根和瑞拉第２类，阳江狗牙根为第３类，摄政王为第４类，Ｔ４１９、小矮人、老鹰草为
第５类。利用ＩＳＳＲ引物ＵＢＣ８１０和ＵＢＣ８５７的扩增产物电泳图为基础构建的指纹图谱可以鉴定出９种狗牙根品
种。
关键词：狗牙根；品种鉴定；ＩＳＳＲ；聚类分析；指纹图谱
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０６０１５９０７
狗牙根（犆狔狀狅犱狅狀）又名绊根草、百慕大草，属禾本科狗牙根属多年生草本植物［１，２］，具有繁殖力强、抗旱、耐践
踏、质地细腻、色泽好等优良特性，广泛用于高尔夫球场、足球场和城市绿化，是全球暖季型草坪草中坪用价值最
高、应用最广泛的草种之一。近年来随着狗牙根市场应用品种的增多，出现了品种混淆、甚至一些不法商贩为了
渔利而以次充好、冒名顶替的现象，影响了品种特定设计功能的发挥，法律纠纷案件时有发生。传统的品种鉴定
主要采用形态学方法、田间小区法等方法，这些方法都不同程度地存在缺陷。ＩＳＳＲ是Ｚｉｅｔｉｃｗｉｅｚ等［３］于１９９４年
提出的一种利用ＰＣＲ扩增进行检测的ＤＮＡ标记。具有稳定性好、多态性丰富、成本低、操作简单等特点［４］，该
技术在植物遗传多样性分析和品种鉴定中得到广泛应用［５］，刘伟等［６］利用ＩＳＳＲ分子标记技术对西南区野生狗
牙根进行遗传多样性分析，能够将西南区４５份材料区分开，并将供试材料聚为４类，材料间的遗传关系与其地理
来源间没有严格的一致性关系。王文恩等［７］利用ＩＳＳＲ技术对辐射诱变的７个变异植株和７个常用品种１４份狗
牙根进行分析，在遗传相似系数（Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＧＳ）为０．６５４处时，１４份狗牙根材料可分为３个
类群。材料间的遗传相似系数为０．５８５～０．７７６，遗传差异性比较明显。周少云等［８］利用ＩＳＳＲ技术对广东地区
野生狗牙根进行遗传多样性分析，材料间遗传系数ＧＳ＝０．５８２～０．９２７，聚类分析结果表明，将供试材料聚为４
类。在品种鉴定方面，胡雪华等［９］采用ＩＳＳＲ分子标记技术，对上海结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）ＪＤ１与大面积草坪
绿地所选用的结缕草属的３个种初步建立了指纹图谱，结合４个材料的主要形态特征分析，可以明确上海结缕草
ＪＤ１是一个新的不同于结缕草、沟叶结缕草（犣狅狔狊犻犪犿犪狋狉犲犾犾犪）和细叶结缕草（犣狅狔狊犻犪狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪）的结缕草新品
系。Ｆａｎｇ和Ｒｏｏｓｅ［１０］用ＩＳＳＲ标记区分亲缘关系很近的柑橘属不同品种，通过２２个引物产生的ＩＳＳＲ标记可用
于区分６８个柑橘（犆犻狋狉狌狊狉犲狋犻犮狌犾犪狋犪）品种。Ｐｒｅｖｏｓｔ和 Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ［１１］采用４条引物研究了３４个马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿
狋狌犫犲狉狅狊狌犿）品种，结果表明只要用其中的任何２条引物即可将这３４个马铃薯品种区分开来。杜金昆等［１２］利用
１１条ＩＳＳＲ引物将北方冬麦区普通小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等４７份材料区分开来，并准确地确定了各个基因型
之间的遗传差异和亲缘关系。目前为止，多数研究是利用ＤＮＡ分子标记技术研究狗牙根的遗传多样性，而利用
第２１卷 第６期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１５９－１６５
２０１２年１２月
收稿日期：２０１２０５０７；改回日期：２０１２０７２６
基金项目：江苏省基础研究计划项目（ＢＫ２００９４８１）资助。
作者简介：刘君（１９７３），男，吉林农安人，博士，讲师。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｊｕｎ８２５＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｎａｕｙｚｍ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
分子标记技术进行狗牙根品种鉴定的研究较少，因此，本研究利用ＩＳＳＲ分子标记技术对目前９种常用的坪用狗
牙根进行品种鉴定分析，在此基础上建立了９种狗牙根指纹图谱，为坪用狗牙根品种的应用和保护提供技术支
持。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试狗牙根材料分别为黑杰克（Ｂｌａｃｋｊａｔ）、瑞拉（Ｒｉｖｉｅｒａ）、摄政王（Ｒｅｇｅｎｔ）、老鹰草（Ｔｉｆｅａｇｌｅ）、阳江狗牙根
（ｙａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ）、Ｔ４１９（Ｔｉｆｗａｙ）、普通狗牙根（Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ）、小矮人（Ｔｉｆｄｗａｒｆ）和南京狗牙根（Ｎａｎ
ｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ），预培养在南京农业大学芳华园艺中心牌楼实验基地，材料来源见表１。２０１０年５月上旬，草
坪草完全返青后，分别随机采集９份狗牙根材料的新鲜幼叶２ｇ，每份材料重复３次取样，去离子水冲洗擦干后用
自封袋封装，编号保存在－８０℃冰箱中备用。
表１ 试验材料及其来源
犜犪犫犾犲１ 犗狉犻犵犻狀狅犳狋犲狊狋狏犪狉犻犲狋犻犲狊狅犳犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊
编号Ｎｏ． 品种Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ 品种来源Ｖａｒｉｅｔｙｓｏｕｒｃｅ
１ 黑杰克Ｂｌａｃｋｊａｔ 北京绿冠草业科技发展中心ＢｅｉｊｉｎｇＴｏｐＧｒｅｅｎＳｅｅｄＣｏ．，Ｌｔｄ
２ 瑞拉Ｒｉｖｉｅｒａ 北京绿冠草业科技发展中心ＢｅｉｊｉｎｇＴｏｐＧｒｅｅｎＳｅｅｄＣｏ．，Ｌｔｄ
３ 摄政王Ｒｅｇｅｎｔ 南京钟山高尔夫球场ＮａｎｊｉｎｇＺｈｏｎｇｓｈａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＧｏｌｆＣｌｕｂ
４ 老鹰草Ｔｉｆｅａｇｌｅ 南京农业大学芳华园艺中心ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦａｎｇｈｕａＧａｒｄｅｎＣｅｎｔｅｒｓ
５ 阳江狗牙根ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ 南京中山植物园ＮａｎｊｉｎｇＺｈｏｎｇｓｈａｎＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎ
６ Ｔ４１９Ｔｉｆｗａｙ 南京农业大学芳华园艺中心ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦａｎｇｈｕａＧａｒｄｅｎＣｅｎｔｅｒｓ
７ 普通狗牙根Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ 南京当地野生资源ＮａｎｊｉｎｇＬｏｃａｌＷｉｌｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
８ 小矮人Ｔｉｆｄｗａｒｆ 南京农业大学芳华园艺中心ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦａｎｇｈｕａＧａｒｄｅｎＣｅｎｔｅｒｓ
９ 南京狗牙根ＮａｎｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ 南京中山植物园ＮａｎｊｉｎｇＺｈｏｎｇｓｈａｎＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎ
１．２ 基因组ＤＮＡ的提取与检测
本实验采用ＳＤＳ法提取狗牙根植株总ＤＮＡ［１３］。
用０．８％琼脂糖、ＧｏｌｄＶｉｅｗ染色凝胶电泳检测质量，
核酸蛋白分析仪检测ＤＮＡ的浓度和纯度。并将各组
ＤＮＡ用灭菌水稀释成２００ｎｇ／μＬ的工作液，保存在
－２０℃冰箱中备用。
１．３ ＩＳＳＲ分析
１．３．１ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系及扩增条件 查阅相关
文献资料［１４１６］，确定最佳反应体系为２５μＬ：ｄｄＨ２Ｏ
１５μＬ，ＤＮＡ模板（１０ｎｇ／μＬ）４μＬ，ｄＮＴＰ２μＬ，１０×
Ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，引物１μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５μＬ。
扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性６０ｓ，５１℃退
火６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，４５个循环；７２℃再延伸７ｍｉｎ，
４℃保存。
１．３．２ ＩＳＳＲ扩增产物的检测 ＰＣＲ反应结束后，将
扩增产物在１．５％的琼脂糖凝胶电泳中检测。电泳条
件为：上样７μＬ，１×ＴＢＥ缓冲液，１００Ｖ 的电压３０
ｍｉｎ。电泳完毕后在凝胶成像系统上观测、拍照。
１．３．３ ＩＳＳＲ引物的筛选 从２０条引物（北京鼎国昌
表２ 本实验所用引物及其序列
犜犪犫犾犲２ 犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
引物Ｐｒｉｍｅｒｓ 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＵＢＣ８０８ （ＡＧ）８Ｃ
ＵＢＣ８０９ （ＡＧ）８Ｇ
ＵＢＣ８１０ （ＧＡ）８Ｔ
ＵＢＣ８１７ （ＣＡ）８Ａ
ＵＢＣ８１８ （ＣＡ）８Ｇ
ＵＢＣ８２５ （ＡＣ）８Ｔ
ＵＢＣ８２６ （ＡＣ）８Ｃ
ＵＢＣ８３５ （ＡＧ）８ＹＣ
ＵＢＣ８３６ （ＡＧ）８ＹＡ
ＵＢＣ８４１ （ＧＡ）８ＹＣ
ＵＢＣ８４２ （ＧＡ）８ＹＧ
ＵＢＣ８４８ （ＣＡ）８ＲＧ
ＵＢＣ８５３ （ＴＣ）８ＲＴ
ＵＢＣ８５５ （ＡＣ）８ＹＴ
ＵＢＣ８５７ （ＡＣ）８ＹＧ
ＵＢＣ８６４ （ＡＴＧ）６
ＵＢＣ８７３ （ＧＡＣＡ）４
ＵＢＣ８８０ （ＧＧＡＧＡ）３
ＵＢＣ８８１ ＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧ
ＵＢＣ８９５ ＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
盛生物技术有限责任公司合成，表２）中筛选出具有清晰扩增条带的引物。筛选的原则：１）条带清晰可辨；２）多态
性高；３）重复性好。
１．４ 数据统计分析
对完全扩增引物的电泳结果进行量化，有谱带记为１，无谱带记为０，统计多态性位点，计算多态位点百分率。
所有数据统计利用 ＮＴＳＹＳ２．１软件进行统计分析。
２ 结果与分析
２．１ 供试材料ＩＳＳＲ引物筛选及扩增产物的多态性
从２０条ＩＳＳＲ引物中筛选出了１３条能够扩增出清晰条带且具多态性的引物，部分引物的筛选结果见图１。
图１ ９种狗牙根品种的犝犅犆８５７犐犛犛犚扩增产物１．５％的琼脂糖凝胶电泳图谱
犉犻犵．１ 犃犿狆犾犻犳犻犲犱狆犪狋狋犲狉狀狅犳９狏犪狉犻犲狋犻犲狊狅犳犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊狑犻狋犺犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉犝犅犆８５７狅狀１．５％犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
１：黑杰克Ｂｌａｃｋｊａｔ；２：瑞拉 Ｒｉｖｉｅｒａ；３：摄政王 Ｒｅｇｅｎｔ；４：老鹰草 Ｔｉｆｅａｇｌｅ；５：阳江狗牙根 ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ；６：Ｔ４１９Ｔｉｆｗａｙ；７：普通狗牙根
Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ；８：小矮人 Ｔｉｆｄｗａｒｆ；９：南京狗牙根 ＮａｎｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ．
利用ＩＳＳＲ分子标记技术对９种狗牙根进行遗传
多样性分析，从２０条引物中筛选出１３条能够扩增出
清晰条带且具多态性的引物，共获得５４条清晰可辨条
带，其中多态性条带 ３４ 条，平均多态性比率为
６４．１５％，扩增的ＤＮＡ片段集中在１００～２０００ｂｐ。平
均每对引物扩增出４．１条带，其中２．６条具有多态性
（表３），其中，多态性最高的为１００％，低的只有２５％。
９份狗牙根材料的 ＧＳ值为０．５４７～０．９６２，变幅为
０．４１５。不同引物的扩增产物呈现的多态性水平有较
大差异。表明狗牙根在分子水平上差异很大，具有很
丰富的遗传多样性。
本试验通过３次重复可以看出，扩增出的ＤＮＡ
片段长度基本相同，重复性很高，只有较弱的条带重复
性差。说明引物对的重复性好，符合条件，可以用于指
纹图谱的构建。
２．２ ＩＳＳＲ标记的遗传相似性分析
利用１３条引物在９种狗牙根所获得的５３条扩增
片段，在ＮＴＳＹＳ２．１软件计算材料间的遗传相似系数
（ＧＳ值），得到供试材料相似性矩阵。遗传相似系数
表３ １３条犐犛犛犚引物扩增结果
犜犪犫犾犲３ 犃犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狊狅犳１３狆狉犻犿犲狉狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
片段大小
Ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｓｉｚｅ
（ｂｐ）
扩增总带数
Ｔｏｔａｌ
Ｎｏ．ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
多态性条带数
Ｎｏ．ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
ＵＢＣ８１０ ２００～１０００ ６ ５ ８３．３３
ＵＢＣ８２５ ３００～１４００ ４ １ ２５．００
ＵＢＣ８２６ １００～２０００ ７ ５ ７１．４３
ＵＢＣ８３６ ３００～１０００ ４ ２ ５０．００
ＵＢＣ８４１ ４５０～９００ ３ ２ ６６．６７
ＵＢＣ８４２ ３００～６００ ３ ２ ６６．６７
ＵＢＣ８５３ ２５０～８７５ ３ １ ３３．３３
ＵＢＣ８５７ ３００～１０００ ４ ３ ７５．００
ＵＢＣ８６４ ５００～７５０ ２ ２ １００．００
ＵＢＣ８７３ ３７５～７５０ ５ ３ ６０．００
ＵＢＣ８８０ ２５０～１５００ ６ ５ ８３．３３
ＵＢＣ８８１ ５００～１８００ ３ ２ ６６．６７
ＵＢＣ８９５ ７００～１５００ ３ １ ３３．３３
总计 Ｔｏｔａｌ ５３ ３４
平均 Ａｖｅｒａｇｅ ４．１ ２．６ ６４．１５
１６１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
越大，表明亲缘关系越近；遗传相似系数越小，表明亲缘关系越远。９份狗牙根材料的ＧＳ值为０．５４７～０．９６２，变
幅为０．４１５。其中，４１９、小矮人、老鹰草三者之间的遗传相似系数（０．９６２）最大，表明４１９、小矮人、老鹰草的亲缘
关系较近，遗传差异最小，这与三者形态特征相近相一致；老鹰草和摄政王的遗传相似系数最小（０．５４７），表明老
鹰草和摄政王的亲缘关系较远，遗传差异最大，存在较高的遗传多样性。遗传相似性分析可知，供试材料之间有
较大的遗传差异性。
２．３ ＩＳＳＲ标记聚类分析
根据遗传相似系数矩阵，利用ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析。在遗传相似系数为０．６１时，９种狗牙根分为２类
（图２），第１类包括Ｔ４１９，老鹰草，小矮人。在形态上，Ｔ４１９、老鹰草、小矮人３种狗牙根比较相似，植株矮小，叶
片短而窄。第２类为其余６种狗牙根，第２类狗牙根的植株相对第１类植株较高，叶片长而宽。聚类结果初步证
实了ＩＳＳＲ分子标记对９种狗牙根进行亲缘关系分析的可行性。
表４ 基于犐犛犛犚标记的９种狗牙根的遗传相似系数矩阵
犜犪犫犾犲４ 犜犺犲犵犲狀犲狋犻犮犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狅犳狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔狏犪犾狌犲狊犳狅狉９狏犪狉犻犲狋犻犲狊狅犳犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊
品种
Ｖａｒｉｅｔｙ
黑杰克
Ｂｌａｃｋｊａｔ
瑞拉
Ｒｉｖｉｅｒａ
摄政王
Ｒｅｇｅｎｔ
老鹰草
Ｔｉｆｅａｇｌｅ
阳江狗牙根
ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
Ｔ４１９
Ｔｉｆｗａｙ
普通狗牙根
Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
小矮人
Ｔｉｆｄｗａｒｆ
瑞拉Ｒｉｖｉｅｒａ ０．７９２
摄政王Ｒｅｇｅｎｔ ０．７７４ ０．７９２
老鹰草Ｔｉｆｅａｇｌｅ ０．５８５ ０．５６６ ０．５４７
阳江狗牙根ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ ０．７５５ ０．６９８ ０．６７９ ０．７１７
Ｔ４１９Ｔｉｆｗａｙ ０．６２３ ０．５６６ ０．５８５ ０．９６２ ０．７１７
普通狗牙根Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ ０．８１１ ０．８３０ ０．８１１ ０．６２３ ０．７１７ ０．６２３
小矮人Ｔｉｆｄｗａｒｆ ０．６２３ ０．５６６ ０．５８５ ０．９６２ ０．７１７ ０．９６２ ０．６２３
南京狗牙根ＮａｎｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ ０．８３０ ０．８１１ ０．７５５ ０．５６６ ０．７７４ ０．５６６ ０．７９２ ０．６０４
图２ 基于犐犛犛犚标记的９种狗牙根的犝犘犌犕犃聚类图
犉犻犵．２ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳９犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊狏犪狉犻犲狋犻犲狊狆狉狅犱狌犮犲犱犫狔犝犘犌犕犃犮犾狌狊狋犲狉犻狀犵犿犲狋犺狅犱犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊
２６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
老鹰草、Ｔ４１９、小矮人在遗传相似系数为０．９６处相聚，具有较高的遗传相似性，亲缘关系较近，这与三者在
形态上非常相似相一致。在遗传相似系数为０．８０６时，可将其余６种狗牙根品种分为４亚类，第１亚类为阳江狗
牙根，第２亚类为摄政王，第３亚类包括黑杰克和南京狗牙根，第４亚类包括普通狗牙根和瑞拉；在遗传相似系数
为０．８３２时，可将这６种狗牙根区分开。
２．４ ９种狗牙根品种的指纹图谱
根据ＰＣＲ扩增结果，以引物ＵＢＣ８１０和ＵＢＣ８５７的扩增产物电泳图为基础，选取清晰多态性位点绘制电泳
模式图构建９种狗牙根的指纹图谱（表５，６）。引物 ＵＢＣ８１０构建的指纹图谱可以将摄政王、老鹰草、阳江狗牙
根、瑞拉、黑杰克或南京狗牙根、Ｔ４１９或小矮人等鉴别开来（表５），黑杰克、南京狗牙根之间有相同的带型，Ｔ
４１９、小矮人之间有相同的带型，不能鉴别。引物 ＵＢＣ８５７构建的指纹图谱可以将黑杰克或摄政王或普通狗牙
根、瑞拉或Ｔ４１９、老鹰草或小矮人、南京狗牙根、阳江狗牙根等鉴别开来（表６），黑杰克、摄政王、普通狗牙根之间
有相同的带型，瑞拉、Ｔ４１９之间有相同的带型，老鹰草、小矮人之间有相同的带型，不能鉴别。将引物 ＵＢＣ８１０
和ＵＢＣ８５７构建的指纹图谱结合使用可以将９种狗牙根进行鉴别。
表５ 引物犝犅犆８１０构建的９种狗牙根的犐犛犛犚指纹模式图
犜犪犫犾犲５ 犜犺犲犐犛犛犚犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狊狅犳９犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊狏犪狉犻犲狋犻犲狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔犝犅犆８１０狆狉犻犿犲狉
ＤＮＡ片段长度
ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
黑杰克
Ｂｌａｃｋｊａｔ
瑞拉
Ｒｉｖｉｅｒａ
摄政王
Ｒｅｇｅｎｔ
老鹰草
Ｔｉｆｅａｇｌｅ
阳江狗牙根
ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
Ｔ４１９
Ｔｉｆｗａｙ
普通狗牙根
Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
小矮人
Ｔｉｆｄｗａｒｆ
南京狗牙根
ＮａｎｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
１０００ — — —
３００ — — — — — — —
４５０ — — — — — —
３７０ — — —
２００ — — — —
表６ 引物犝犅犆８５７构建的９种狗牙根的犐犛犛犚指纹模式图
犜犪犫犾犲６ 犜犺犲犐犛犛犚犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狊狅犳９犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊狏犪狉犻犲狋犻犲狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔犝犅犆８５７狆狉犻犿犲狉
ＤＮＡ片段长度
ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
黑杰克
Ｂｌａｃｋｊａｔ
瑞拉
Ｒｉｖｉｅｒａ
摄政王
Ｒｅｇｅｎｔ
老鹰草
Ｔｉｆｅａｇｌｅ
阳江狗牙根
ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
Ｔ４１９
Ｔｉｆｗａｙ
普通狗牙根
Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
小矮人
Ｔｉｆｄｗａｒｆ
南京狗牙根
ＮａｎｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ
１０００ — — — —
７５０ — — — —
６００ — —
３ 结论与讨论
狗牙根表型性状的数量是有限的，往往受到环境的影响，传统形态学分类方法很难从本质差异上区别。分子
标记能从ＤＮＡ水平上检测遗传变异，被认为是进行物种亲缘关系研究的有力工具。景润春等［１７］和李进波等［１８］
研究指出，ＩＳＳＲ标记具有较高的多态性水平，并且在亲缘关系极近的品种间也能找到差异条带而进行区分。刘
伟等［６］利用ＩＳＳＲ分子标记技术对西南区野生狗牙根进行遗传多样性分析，每个引物扩增的多态带数为５．２７
条，多态性条带比率为７０．９％，ＧＳ值为０．７７～０．９８。与本实验所选用相同引物是ＵＢＣ８０８、ＵＢＣ８５５、ＵＢＣ８９５；
周少云等［８］应用ＩＳＳＲ标记，对广东地区３０份野生狗牙根进行遗传多样性研究。从５０个ＩＳＳＲ引物中筛选出１５
个多态性明显、反应稳定的引物，共扩增出１５１条谱带，平均每个引物能扩增出１０．０７条带。多态性条带比率达
９３．７％，材料间遗传相似系数 ＧＳ＝０．５８２～０．９２７。与本实验所选相同引物是 ＵＢＣ８０８、ＵＢＣ８０９、ＵＢＣ８１０、
ＵＢＣ８２５、ＵＢＣ８２６、ＵＢＣ８３６、ＵＢＣ８４２、ＵＢＣ８５３、ＵＢＣ８５５、ＵＢＣ８６４、ＵＢＣ８７３、ＵＢＣ８８０、ＵＢＣ８８１、ＵＢＣ８９５等１０
条引物。经对三者所选引物的比较分析，表明狗牙根品种基因组中含有较多的ＵＢＣ８９５引物序列，即ＡＧＡＧＴ
３６１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
ＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ保守区域。
狗牙根叶色浓绿、根系发达，喜光、耐旱、喜温暖湿润、耐粗放管理等特点，根系分布广而深，是南方高尔夫球
道、发球台及公园绿地、别墅区草坪的优良建植材料。尤其是Ｔ４１９、小矮人、老鹰草是南方高尔夫球场果岭必不
可少的草种之一，保持品种的纯度是这些狗牙根品种进行营养繁殖扩繁的首要问题，目前常用的品种鉴定方法是
根据其形态特征进行鉴定，但其形态特征容易受到环境条件的不同而出现差异。本试验通过对９种狗牙根形态
特征观察发现，可初步将其分为２大类，一类是Ｔ４１９、老鹰草、小矮人等，植株矮小，叶片短而窄等特点，形态特
征较为相似，难以区分，另一类是阳江狗牙根、普通狗牙根、黑杰克、瑞拉、摄政王等，植株较为高大，叶片较长等特
点，形态上较为相似。ＩＳＳＲ聚类分析表明，供试材料可以明显划分为五大类。Ｔ４１９、老鹰草、小矮人３种狗牙根
聚为一类，与形态观察结果相一致，阳江狗牙根，摄政王各自聚为一类，黑杰克与南京狗牙根聚为一类，普通狗牙
根与瑞拉聚为一类。说明外部形态相近的品种往往聚为一类，具有较近的亲缘关系，在ＩＳＳＲ电泳图谱分析的基
础上，获得了供试材料的指纹图谱，利用引物ＵＢＣ８１０和ＵＢＣ８５７结合构建的指纹图谱能够将９个供试材料全部
得到区分，说明ＩＳＳＲ是一种构建草坪草种质资源指纹图谱的理想标记。ＤＮＡ指纹图谱的建立，也为我国新品
种开发和品种保护提供了技术保障。
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４６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
犐犛犛犚犿狅犾犲犮狌犾犪狉犿犪狉犽犲狉狊犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳９犅犲狉犿狌犱犪犵狉犪狊狊犮狌犾狋犻狏犪狋犻狅狀狏犪狉犻犲狋犻犲狊
ＬＩＵＪｕｎ，ＺＨＡＯＱｉｎ，ＹＡＮＧＺｈｉｍｉｎ
（ＴｕｒｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓａｒｅｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔａｎｄａｂｕｎｄａｎｔｗａｒｍｓｅａｓｏｎｔｕｒｆｇｒａｓｓｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ．Ｔｈｅｙ
ａｒｅｓａｍｅｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｏｒｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｎｄｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｃｃｕｒａｔｅｌｙｂｙｔｒａｄｉ
ｔｉｏｎａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｏｒｆｉｅｌｄｄｉｓｔｒｉｃｔｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏ
ｂｅｔｈｅｍｏｓｔａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｕｒｒｅｎｔｌｙｏｎｖａｒｉｅｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄ
ｙ，ｗｅｕｓｅｄＩＳＳＲｏｎ２７ＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓｆｉｎ
ｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆ９ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ．Ｔｈｉｒｔｅｅｎｐｒｉｍｅｒｓｐｒｏｄｕｃｅｄ５４ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ，ｏｆｗｈｉｃｈ３４ｂａｎｄｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏ
ｂｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ，４．１ｂａｎｄｓｐｅｒｐｒｉｍｅｒｏｎａｖｅｒａｇｅ．Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｌｏｃｕｓｗａｓ６４．１５％ｏｎａｖｅｒ
ａｇｅ．ＴｈｅＮｅｉ’ｓｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．５４７ｔｏ０．９６２，ｔｈｅｒａｎｇｅｗａｓｕｐｔｏ０．４１５．Ｔｈｅｓｅ
ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｈａｄａｍｐｌｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ
ｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓａｔＧＳ０．８０６：ＢｌａｃｋｊａｔａｎｄＮａｎｊｉｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｆｉｒｓｔ
ｇｒｏｕｐ，ＲｉｖｉｅｒａａｎｄＣｏｍｍｏｎＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｒｏｕｐ，ＹａｎｇｊｉａｎｇＢｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄ
ｉｎｔｏｔｈｅｔｈｉｒｄｇｒｏｕｐ，ＲｅｇｅｎｔｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｆｏｒｔｈｇｒｏｕｐａｎｄＴｉｆｗａｙ（Ｔ４１９），Ｔｉｆｅａｇｌｅ，Ｔｉｆｄｗａｒｆｃｌｕｓｔｅｒｄ
ｉｎｔｏｔｈｅｆｉｆｔｈｇｒｏｕｐ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ９Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓｖａｒｉｅｔｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｂａｓｅｄｏｎ
ｐｒｉｍｅｒＵＢＣ８１０ａｎｄＵＢＣ８５７．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｆｅｒｅｄｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒ
ｓｉｔｙａｎｄｖａｒｉｅｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＩＳＳＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｏｎｖａｒｉｅｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｒｍ
ｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ｈｙｂｒｉｄｐａｒｅｎｔｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ；ｖａｒｉｅｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＩＳＳＲ；ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ
５６１第２１卷第６期 草业学报２０１２年