全 文 ：书玉米根围土壤中腐霉菌的分离鉴定
及核糖体犇犖犃－犐犜犛序列分析
柴兆祥１，２，３，４，李金花１，２，楼兵干５，李唯６，甘辉林１，郭成１，赵玲１，董迪１
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；３．草业生态系统教育部重点
实验室，甘肃 兰州７３００７０；４．中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０；５．浙江大学生物技术研究所，
浙江 杭州３１００２９；６．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：从兰州地区的红古、七里河等地采集玉米根围土壤标样，诱饵法与组织分离法相结合分离纯化到２３株腐霉
菌株，通过形态特征、培养特性、生长速度和对温度适应范围的研究，结合ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析，将分离到的腐霉
菌株鉴定为硬腐霉、终极腐霉和一个腐霉待定种。这是首次报道在我国分离到硬腐霉，为我国新记录种；终极腐霉
也系首次在甘肃从玉米根围土壤中分离到。统计表明，３种腐霉菌种在兰州地区玉米根围土壤中的分离频率不同，
终极腐霉出现次数最多，为优势种群，分离频率为６０．９％；其次为腐霉待定种，分离频率为２６．１％；而硬腐霉分离
频率最低，为１３．０％。
关键词：玉米；根围土壤；腐霉；鉴定；核糖体ＤＮＡ－ＩＴＳ
中图分类号：Ｓ４３５．１３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０３０１２６１０
腐霉菌是一类低等卵菌，属于腐霉属（犘狔狋犺犻狌犿）、腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ）、霜霉目（Ｐｅｒｅｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ）、卵菌纲（Ｏｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）、藻物界（Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ）。腐霉遍布全世界，多栖息于土壤、水体和植物残体上。自从１８５８年建立腐霉属
以来，迄今为止，全世界报道的腐霉种超过２００多种［１］，我国报道的腐霉种类近６０种［２］。甘肃地域广阔，气候多
样，土壤类型复杂，但有关甘肃腐霉的研究资料少见，在有关文献中仅记载瓜果腐霉（犘．犪狆犺犪狀犻犱犲狉犿犪狋狌犿）、德巴
利腐霉（犘．犱犲犫犪狉狔犪狀狌犿）和终极腐霉（犘．狌犾狋犻犿狌犿 ）等３个种和２个待定种（犘狔狋犺犻狌犿ｓｐ．）［３，４］。由于腐霉种类
多，形态多样，特别是有些腐霉的鉴定特征不易形成，因此在以形态学为主的分类鉴定技术基础上，利用分子生物
学技术辅助鉴别腐霉很有必要。以核糖体ＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析为手段的分子技术己广泛应用于亲缘关系较近
分类群的系统发育研究［５］，这为腐霉菌的鉴定提供了重要依据。
耕作层及植物根围土壤中具有丰富的腐霉种类，一些腐霉菌可作为医药及化学工业生产菌，有些具有生防作
用，但多数腐霉菌却是重要的植物病原菌，当条件适合时常侵染植物引起病害，造成种子腐烂、幼苗猝倒、根茎部
腐烂和幼嫩多汁的组织及贮藏器官毁坏，导致经济植物的巨大损失［６，７］。国内外报道的腐霉种大部分也来自土
壤［８］。据报道，在我国的土壤中以菜园土壤中的腐霉最为丰富，其次是大田土、水畔土和陵园土，草丘土最差［８］。
玉米（犣犲犪犿犪狔狊）是我国重要的粮、饲、药兼用作物，是当今大力发展畜牧业、解决我国粮食供需矛盾、实现
粮、饲有效性供给的较好途径［９］。前人从病理学的角度对由腐霉单独或复合侵染引起的玉米病害已有一些研究
报道［１０～１６］，但对玉米根围腐霉菌的种群和分布未见有报道。自１９０４年提出根际（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ）概念以来，根际微
域环境的研究越来越得到重视，成为土壤学最活跃、最敏感的研究领域［１７］。本研究通过对兰州地区玉米根围土
壤中的腐霉菌进行分离鉴定，明确兰州地区玉米根围土壤中腐霉的种类及其形态特征，为进一步探讨甘肃省的腐
霉资源、深入分析玉米根围腐霉与玉米病害的关系和降低粮、饲、药作物安全风险等提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 土样采集
２００７年９－１０月，从兰州地区的红古、七里河等地的玉米栽培地块随机选择７块玉米地块作为样地，每块地
１２６－１３５
２００９年６月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第３期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
收稿日期：２００８０８１６；改回日期：２００９０１２１
基金项目：甘肃省科学事业费项目（甘科计［２００１］２１号）和甘肃省教育厅项目（０３２０８）资助。
作者简介：柴兆祥（１９６８），男，甘肃通渭人，教授，在职博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｈａｉｚｘ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｗｅｉ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
５点取样，每取样点沿玉米根围从不同位置用土壤取样器取样３次，取土深度０～２０ｃｍ，同一块田５点取样后将
其混合均匀装入无菌塑料袋，标明编号、地点、采集时间，带回实验室供分离用。
１．２ 腐霉菌株的分离、纯化和保存
以月季（犚狅狊犪犮犺犻狀犲狀狊犻狊）花瓣为材料，用诱饵法［１８，１９］和组织分离法［１９］相结合分离腐霉菌。用作诱饵的月季
花瓣室温下保湿４８～７２ｈ后，将出现病变的月季花瓣在无菌条件下用７０％酒精消毒３～５ｓ，迅速用无菌水冲洗
３～４次，切取病健交界处的花瓣组织转移到１／４ＰＤＡ培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯６０ｇ、葡萄糖５
ｇ、琼脂２０ｇ、水１０００ｍＬ）上。待组织周围长出菌丝后，进行编号并挑取菌落边缘菌丝转移到１／４ＰＤＡ培养基上
进行初纯化，初步镜检疑为腐霉的菌株采用单菌丝先端切割的方法获得纯培养，并用于形态鉴定、菌种配合方式
观察和ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析。所有纯化的菌株于室温条件下在ＣＭＡ培养基（玉米粉琼脂培养基：玉米粉６０ｇ、
琼脂２０ｇ、水１０００ｍＬ）斜面上培养和保存，每６个月转管１次。
１．３ 形态学鉴定方法
以孢子囊、藏卵器、雄器等形态学特征为主要鉴别性状，以菌落特征、日生长速度和温度特性等性状为辅助特
征，参考余永年［７］的《中国真菌志－霜霉目》、张中义等［６］的《植物病原真菌学》、魏景超［２０］的《真菌鉴定手册》和
ｖａｎｄｅｒＰｌａａｔｓＮｉｔｅｒｉｎｋ［２１］的《Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓ犘狔狋犺犻狌犿》等腐霉专著中有关腐霉菌的描述和检索表进行
形态学鉴定。
１．３．１ 腐霉菌培养性状观察 将ＣＭＡ、ＰＤＡ（马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯２５０ｇ、葡萄糖２０ｇ、琼脂２０ｇ、
水１０００ｍＬ）或ＰＣＡ（马铃薯２０ｇ、胡萝卜２０ｇ、琼脂２０ｇ、水１０００ｍＬ）上活化的腐霉菌用灭菌打孔器打成直径
５ｍｍ的菌饼，接种于直径为９０ｍｍ的ＰＤＡ、ＷＡ（水琼脂培养基：琼脂２０ｇ、水１０００ｍＬ）等培养基平板上，２５℃
黑暗条件培养，记录菌落形态、气生菌丝状况。
１．３．２ 腐霉菌形态学特征观察 主要观察记载菌丝的形态、分枝情况，菌丝膨大体的有无、形状，孢子囊的形态、
大小、着生方式、层出现象的有无、能否释放游动孢子，藏卵器的形状、着生方式、突起物的有无及其形状，卵孢子
的大小、壁的厚度、是否满器，雄器的来源、形状、数目、位置（同丝生、异丝生、下位生）、是否有柄、柄的形态等特
征。观察腐霉菌形态用２种方法：１）从ＰＤＡ、ＣＭＡ、ＷＡ等培养基上直接挑取培养物制成临时玻片观察；２）切取
２～３条ＣＭＡ或ＰＤＡ平板上培养４８～７２ｈ的腐霉菌置于灭菌培养皿（直径９ｃｍ）中，用煮沸１０ｍｉｎ后的黑麦草
（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）叶、胡萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狉狅狋）条、马唐草（犇犻犵犻狋犪狉犻犪狊犪狀犵狌犻狀犪犾犻狊）叶等作诱饵，加入适量无菌水水
培或直接在含有腐霉菌的培养皿中加ＰＳ液（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１５０ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ１５０ｍｇ、ＫＣｌ６０ｍｇ、
Ｃａ（ＮＯ３）２４００ｍｇ、蒸馏水１０００ｍＬ）培养，每天换水或ＰＳ液以刺激腐霉菌株产生有性器官和其他鉴别特征，并
测量大小。
１．３．３ 游动孢子的释放 待１．３．２中煮沸黑麦草叶诱导腐霉菌形成孢子囊后，置于５℃冰箱中２～４ｈ后，制片
观察有无游动孢子释放。
１．３．４ 生长温度范围和生长速率的测定 分别设置０，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５和４０℃等９个温度梯度，将ＣＭＡ
上活化的腐霉菌株平板，用灭菌打孔器打成直径５ｍｍ的菌饼，移于直径９ｃｍ的ＣＭＡ和ＰＤＡ平板中央，分别
置于上述温度范围内的人工气候箱（温度误差范围±１℃）和冰箱（温度误差范围±１℃）内于黑暗条件下培养，２４
～７２ｈ后用十字交叉法测定菌落直径，计算菌落净生长直径，确定最低、最适、最高生长温度，每处理３次重复；
日生长速率以２５℃黑暗条件下ＣＭＡ上的菌落净生长量除以天数的值来表示（ｍｍ／ｄ）。
菌落净生长量（ｍｍ）＝平均菌落直径（ｍｍ）－菌饼直径（ｍｍ）
日生长速率（ｍｍ／ｄ）＝菌落净生长量（ｍｍ）／天（ｄ）
１．４ 核糖体ＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析
在形态学特征观察和鉴定的基础上，将分离到的腐霉菌株初步归为形态特征不同的３组，从每组中各选择１
株代表性菌株，分别为Ｐ１３９Ｄ、Ｐ１６６Ｃ、Ｐ１６１３Ｃ用于分子鉴定。
１．４．１ 菌丝体培养收集 将供试代表性菌株接种在ＰＤＡ培养基上，２５℃黑暗条件下培养４８～７２ｈ后，在无菌
条件下刮取待测菌株的培养菌丝分别接种至盛有１００ｍＬＰＤＢ培养液（马铃薯２５０ｇ，葡萄糖１５ｇ，蒸馏水１０００
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ｍＬ，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）的锥形瓶中，２８℃、１４０ｒ／ｍｉｎ振荡培养４８～７２ｈ，无菌滤纸过滤后收集菌丝体，用无菌水
冲洗２次，用滤纸压干水分后立即冷冻干燥，放－２０℃保存备用。
１．４．２ ＩＴＳ１－ＰＣＲ扩增和测序 基因组ＤＮＡ的提取与纯化根据修改后的Ｐａｕｌ［２２，２３］的方法进行。通过电泳方
法检查ＤＮＡ纯度和定量（与ＤＮＡＭａｋｅｒＩ比较）。
ＰＣＲ扩增采用真核生物核糖体基因（ｒＤＮＡ）转录间隔区（ＩＴＳ）通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４进行，引物序列为
ＩＴＳ１：５′ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ３′，ＩＴＳ４：５′ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３′，引物由上海生工生物
工程技术服务有限责任公司合成。
ＰＣＲ反应体系为１０×Ｔａｑｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ的引物１μＬ，模板ＤＮＡ１
μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑＤＮＡ聚合酶０．２５μＬ，超纯水将反应体系补至２５μＬ。
循环参数为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，５８℃退火４０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３５轮循环；最后７２℃延伸１０
ｍｉｎ。扩增产物在１．０％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，经ＥＢ染色，紫外灯下检测ＰＣＲ扩增物的有效性。
ＰＣＲ纯化产物直接进行测序，序列测定和拼接委托上海生工生物工程技术服务有限责任公司完成。
１．４．３ 序列同源性比较和聚类分析 将待测菌株的ＩＴＳ序列与Ｇｅｎｂａｎｋ核苷酸数据库中的腐霉菌ＩＴＳ序列进
行同源性比较，采用ＤＮＡＳｔａｒ软件对所测菌株与Ｇｅｎｂａｎｋ中的同源性最高的部分腐霉种的ＩＴＳ序列进行聚类
分析，构建同源性树。
２ 结果与分析
２．１ 玉米根围土壤中腐霉的种类
在室内分离和培养条件一致的情况下，用诱饵法和组织分离法相结合，从所采集的玉米根围土壤标样中分离
纯化到２３个腐霉菌株，经形态学鉴定属于３个腐霉种，分别是硬腐霉（犘．狊犮犾犲狉狅狋犲犻犮犺狌犿）、终极腐霉（犘．狌犾狋犿犿犻
狌犿）和一个腐霉待定种（犘狔狋犺犻狌犿ｓｐ．）。这是首次在我国分离到硬腐霉，为我国新记录种；首次从甘肃玉米根围
土壤中分离到终极腐霉。统计结果表明，从兰州地区玉米根围土壤中分离到终极腐霉１４株，出现次数最多，为优
势种群，分离频率为６０．９％；腐霉待定种分离到６株，分离频率为２６．１％；硬腐霉分离到３株，分离频率最低，为
１３．０％。
２．２ 腐霉种的培养性状及形态特征描述
２．２．１ 硬腐霉 在ＣＭＡ、ＰＣＡ和ＰＤＡ平板培养基上菌落初为白色绒状，低矮，后期因形成大量卵孢子，致使菌
落及培养基呈黄褐色；在 ＷＡ培养基上菌丝稀疏，可缓慢生长。在ＣＭＡ、ＰＣＡ和ＰＤＡ平板培养基上卵孢子数量
大（图１）。
菌丝发达，有不规则分支，宽２．３９～３．７４μｍ，平均３．３１μｍ。未见孢子囊形成。
用菌丝先端切割获得的纯菌系在常温下培养极易形成大量有性菌态，为同宗配合菌。藏卵器光滑、球形，顶
生或间生。藏卵器宽（９．３６）１３．８０～１７．８７μｍ，平均１４．８７μｍ；长（１０．９３）１４．５０～１８．３５（１９．７７）μｍ，平均１５．４８
μｍ。每一藏卵器上的雄器数目为１～３个，多同丝生，少异丝生，雄器不分支或分支，有较长的柄。卵孢子球形
１１．８３～２２．６８μｍ，平均１６．９７μｍ，不满器。
生长温度范围的研究表明，在５～３５℃的温度范围内均能生长，其中，最低生长温度５℃，适宜生长温度范围
为２０～３０℃，最适生长温度为２５℃，最高生长温度３５℃，最低和最高生长温度时生长缓慢，日生长速率分别为
３．３９和６．７１ｍｍ／ｄ，０和４０℃时未见生长。２５℃时菌丝在ＣＭＡ上的日平均生长速度为２４．３ｍｍ／ｄ。
２．２．２ 终极腐霉 在ＣＭＡ和ＰＤＡ培养基平板上菌丝发达，棉絮状；在ＰＣＡ平板上有放射状扩展；在 ＷＡ培养
基上能缓慢生长，形成稀疏的菌落（图２）。
菌丝发达，分枝繁茂、不规则，宽３．６０～５．９６μｍ，平均４．９０μｍ。孢子囊形态多样，球形、近球形或梨形；孢
子囊间生、顶生或切生，以间生为主，切生极少。孢子囊宽１１．７５～２８．３７μｍ，平均２２．２４μｍ；孢子囊长１５．２５～
３２．０６μｍ，平均２８．３２μｍ。未观察到排孢管。
用菌丝先端切割获得的纯菌系在常温下培养和刺激培养时均可形成有性菌态，为同宗配合菌。藏卵器球形，
表面光滑，顶生或间生，罕切生。藏卵器宽１６．１６～２８．２７μｍ，平均２２．６９μｍ；藏卵器长１７．６０～２９．３４μｍ，平均
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图１ 硬腐霉形态特征
犉犻犵．１ 犕狅狉狆犺狅犾狅犵狔狅犳犘．狊犮犾犲狉狅狋犲犻犮犺狌犿
ａ；菌丝 Ｍｙｃｅｌｉｕｍ；ｂ～ｈ：藏卵器和雄器Ｏｏｇｏｎｉａａｎｄａｎｔｈｅｒｉｄｉａ；ｉ：卵孢子Ｏｏｓｐｏｒｅ
２３．６９μｍ。雄器囊状、棒状，弯曲，每一藏卵器有雄器１～２个，多数１个，多同丝生，多无柄，紧靠藏卵器形成，偶
有异丝生；授精管明显。卵孢子球形，平滑，多不满器。卵孢子直径１５．７５～２１．１９μｍ，平均１８．７μｍ。
生长温度范围的研究表明，在１０～３５℃的温度范围内均能生长，其中，最低生长温度５℃，日生长速率为１０．２
ｍｍ／ｄ；最高生长温度为３５℃，日生长速率为９．３ｍｍ／ｄ；适宜生长温度范围为２０～３０℃，最适生长温度为２５℃，０
和４０℃时未见生长。２５℃时菌丝在ＣＭＡ上的日平均生长速度为４７．２ｍｍ／ｄ。
２．２．３ 腐霉待定种 菌丝宽２．９０～５．５８μｍ，平均４．５２μｍ，不规则分枝（图３）。
孢子囊形态多样，球形、卵圆形、柠檬形、梨形或椭圆形；孢子囊多间生，偶有顶生。各种形状、大小不一的孢
子囊常成串组成或大或小的复合体，能产生游动孢子。
用菌丝先端切割获得的纯菌系在常温下培养时均可形成有性菌态，为同宗配合菌。藏卵器球形或亚球形，顶
生或间生。藏卵器宽１５．５２～３２．１１μｍ，平均１９．０２μｍ；藏卵器长１６．３８～３３．６５μｍ，平均２０．３５μｍ。雄器多为
异丝生，常为１个，棍棒状。卵孢子球形，满器或不满器。
生长温度范围的研究表明，Ｐ１６１３Ｃ菌株在１０～３５℃的温度范围内均能生长，其中，最低生长温度１０℃，日
生长速率为２３．２ｍｍ／ｄ；最高生长温度为３５℃，日生长速率为７．５ｍｍ／ｄ；适宜生长温度范围为２０～３０℃，最适
生长温度为２５℃，５和４０℃时未见生长。２５℃时菌丝在ＣＭＡ上的日平均生长速度为３５．７ｍｍ／ｄ。
２．３ 核糖体ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析结果
２．３．１ 腐霉菌株Ｐ１６６Ｃ的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ测序结果及同源性比较 在形态鉴定的基础上，用ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为测
序引物，ＰＣＲ纯化产物直接进行双向测序并拼接输出全序列，腐霉菌株Ｐ１６６Ｃ获得了８８３ｂｐ的ｒＤＮＡＩＴＳ全
长序列，用Ｂｌａｓｔ对Ｐ１６６Ｃ的ＩＴＳ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已有的ＩＴＳ序列进行比对，发现与菌株Ｐ１６６Ｃ的ｒＤＮＡ－
９２１第１８卷第３期 草业学报２００９年
图２ 终极腐霉形态特征
犉犻犵．２ 犕狅狉狆犺狅犾狅犵狔狅犳犘．狌犾狋犻犿狌犿
ａ：在ＰＤＡ上的菌落ＣｏｌｏｎｙｏｎＰＤＡ；ｂ：在ＣＭＡ上的菌落ＣｏｌｏｎｙｏｎＣＭＡ；ｃ：菌丝体 Ｍｙｃｅｌｉｕｍ；
ｄ～ｉ：孢子囊Ｓｐｏｒａｎｇｉａ；ｊ～ｋ：藏卵器和雄器Ｏｏｇｏｎｉａａｎｄａｎｔｈｅｒｉｄｉａ
ＩＴＳ序列相似的菌株均为腐霉。用ＤＮＡＳｔａｒ软件对所测菌株与Ｇｅｎｂａｎｋ中的同源性较高的部分腐霉种的ＩＴＳ
序列进行聚类分析，Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统发育树，结果表明，菌株Ｐ１６６Ｃ的序列与Ｇｅｎｂａｎｋ上登记的菌
株ＡＢ２４８９１２（硬腐霉）和ＡＹ５９８６８０（硬腐霉）的遗传距离最近，在同一进化水平上（图４）。根据形态学上未观察
到孢子囊的特征和该菌有性态的特点，参考分子鉴定结果，认为菌株Ｐ１６６Ｃ应为硬腐霉。
２．３．２ 腐霉菌株Ｐ１３９Ｄ的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ测序结果及同源性比较 在形态鉴定的基础上，用ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为测
序引物，ＰＣＲ纯化产物直接进行双向测序并拼接输出全序列，腐霉菌株Ｐ１３９Ｄ获得了９２９ｂｐ的ｒＤＮＡＩＴＳ全
长序列，用Ｂｌａｓｔ对Ｐ１３９Ｄ的ＩＴＳ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已有的ＩＴＳ序列进行比对，发现与菌株Ｐ１３９Ｄ的ｒＤＮＡ
ＩＴＳ序列相似的菌株都是腐霉。用ＤＮＡＳｔａｒ软件对所测菌株与Ｇｅｎｂａｎｋ中的同源性较高的部分腐霉种的ＩＴＳ
序列进行分析，Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ法建立系统发育树，结果表明菌株Ｐ１３９Ｄ的序列与ＡＦ４５２１５８（终极腐霉）的同
源性最高，且位于系统发育树的同一分支（图５），支持率高，据此认为菌株Ｐ１３９Ｄ的分子鉴定结果为终极腐霉，
这和形态学鉴定的结果相一致（图５）。
０３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
图３ 腐霉待定种形态特征
犉犻犵．３ 犕狅狉狆犺狅犾狅犵狔狅犳犘．狊狆．
ａ：在ＰＤＡ上的菌落ＣｏｌｏｎｙｏｎＰＤＡ；ｂ：在ＣＭＡ上的菌落ＣｏｌｏｎｙｏｎＣＭＡ；ｃ：菌丝体 Ｍｙｃｅｌｉｕｍ；
ｄ～ｆ：孢子囊Ｓｐｏｒａｎｇｉａ；ｇ～ｈ：藏卵器Ｏｏｇｏｎｉａ；ｉ～ｊ：藏卵器和雄器Ｏｏｇｏｎｉａａｎｄａｎｔｈｅｒｉｄｉａ
２．３．３ 腐霉菌株Ｐ１６１３Ｃ的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ１测序结果及同源性比较 在形态鉴定的基础上，测定了Ｐ１６１３Ｃ菌
株的ｒＤＮＡＩＴＳ１序列，序列长度为８０５ｂｐ。用Ｂｌａｓｔ对Ｐ１６１３Ｃ菌株的ＩＴＳ１序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已有的ＩＴＳ序
列进行比对，发现Ｐ１６１３Ｃ与ＧｅｎＢａｎｋ中登记的棘腐霉（犘．犪犮犪狀狋犺犻犮狌犿）、孤雌腐霉（犘．犪犿犪狊犮狌犾犻狀狌犿）、寡雄腐
霉（犘．狅犾犻犵犪狀犱狉狌犿）、犘．狅狉狀犪犿犲狀狋犪狋狌犿、缠器腐霉（犘．狆犲狉犻狆犾狅犮狌犿）等５个腐霉种的相似性较高，都在９６％以上。
用ＤＮＡＳｔａｒ软件对所测菌株与Ｇｅｎｂａｎｋ中的同源性高的部分腐霉种的ＩＴＳ序列进行聚类分析，Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎ
ｉｎｇ法构建系统发育树，发现菌株Ｐ１６１３Ｃ与ＧｅｎＢａｎｋ中登记的ＡＹ５９８６７０（缠器腐霉）和ＡＪ２３３４５５（缠器腐霉）
的遗传距离较其他种要较近（图６）。
３ 讨论
根际微生物是土壤生命系统的重要组成成分，是根际微环境与土壤有机物质循环和转换的枢纽，对植物的生
长发育起着重要作用［２４］。土壤环境因子与微生物互相制约共同作用［２５］，同时土壤微生物群落多样性与覆盖于土
壤上的植物群落多样性呈正相关［２６］。本研究通过对玉米根围土壤中的腐霉种进行分离和鉴定，获得的２３株腐
霉菌株经鉴定分别为硬腐霉、一个腐霉待定种和终极腐霉，其分离频率依次为１３．０％，２６．１％和６０．９％，说明终
１３１第１８卷第３期 草业学报２００９年
图４ 菌株犘１６６犆与犌犲狀犅犪狀犽中同源性较高的腐霉菌株的狉犇犖犃－犐犜犛序列的聚类分析树状图
犉犻犵．４ 犎狅犿狅犾狅犵狔狋狉犲犲狌狊犻狀犵犐犜犛狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犘１６６犆狊狋狉犪犻狀犪狀犱狅狋犺犲狉犘狔狋犺犻狌犿狊狋狉犪犻狀狊犳狉狅犿犌犲狀犅犪狀犽
图５ 菌株犘１３９犇与犌犲狀犅犪狀犽中同源性较高的腐霉菌株的狉犇犖犃－犐犜犛序列的聚类分析树状图
犉犻犵．５ 犎狅犿狅犾狅犵狔狋狉犲犲狌狊犻狀犵犐犜犛狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犘１３９犇狊狋狉犪犻狀犪狀犱狅狋犺犲狉犘狔狋犺犻狌犿狊狋狉犪犻狀狊犳狉狅犿犌犲狀犅犪狀犽
极腐霉为玉米根围土壤中的优势种群。由于土样采集时间是在２００７年的９－１０月，所以研究结果反映出这一时
间段兰州地区玉米根围土壤中的腐霉种群及其比例。
国内外学者从病理学的角度对由腐霉单独或复合侵染引起的玉米病害已有研究报道，但有关玉米根围腐霉
菌的种群生态和分布未见报道。本研究以月季花瓣为材料，利用诱饵法与组织分离法相结合分离玉米根围土壤
中的腐霉菌，结果表明分离效果较好。利用此方法分离到的腐霉菌中，硬腐霉系首次在我国分离到，为我国新记
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图６ 菌株犘１６１３犆与犌犲狀犅犪狀犽中同源性较高的腐霉菌株的狉犇犖犃－犐犜犛序列的聚类分析树状图
犉犻犵．６ 犎狅犿狅犾狅犵狔狋狉犲犲狌狊犻狀犵犐犜犛狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犘１６１３犆狊狋狉犪犻狀犪狀犱狅狋犺犲狉犘狔狋犺犻狌犿狊狋狉犪犻狀狊犳狉狅犿犌犲狀犅犪狀犽
录种；终极腐霉也是首次从玉米根围土壤中分离到。孟有儒［４］记载终极腐霉是甘肃豌豆根腐病和马铃薯湿腐病
的病原，本研究从玉米根围土壤中分离到终极腐霉，而且是优势种群。由于终极腐霉是包括玉米在内的多种植物
的病原菌，所以本研究结果表明终极腐霉可能是兰州地区玉米栽培的潜在威胁，应该加强监测和防范。
对腐霉的鉴定主要以形态学特征为主要依据，但由于腐霉种类多，而且多数腐霉形态特征不稳定，有些种具
有形态可变性或交叉性，有些种缺乏某些重要的分类特征，有些种类是异宗配合型，这些情况都会增加腐霉形态
学分类鉴定的难度，使得一些疑难种被错误划分为相似种的类群，推迟了众多腐霉新种的发现［２７］。不少腐霉种
间形态特征往往相互交叉，造成鉴定的困难和错误。为提高鉴定和分类的科学性和准确性，一些新技术如生理生
化和分子标记技术已大量用于腐霉的鉴定、分类与系统发育的研究［２７～２９］。特别是１９５３年ＤＮＡ双螺旋结构被
提出后，核酸分子生物学技术发展迅速，并且得到广泛应用，一系列分子标记应用于菌物的分类鉴定中，如
ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ等，而核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）的研究是目前研究菌物ＤＮＡ序列的重点［２９］。核糖体ＤＮＡ上
的ＩＴＳ序列由于进化速度快，表现出广泛的序列多态性，其在不同的分类水平上都具有各自的特异分子标记，不
仅能够正确定义生物在种水平上的概念，而且能够鉴定近缘物种间的亲缘关系，已成为真菌在种和亚种水平上分
类鉴定的有效手段［２７，２９］。绝大多数真菌的ＩＴＳ序列具有高变异性，可以从中获得大量的遗传信息，作为传统的
真菌分类鉴定方法的补充，常被应用于真菌近缘种的分类鉴定［２７，２９］。本研究在形态鉴定的基础上，应用ｒＤＮＡ－
ＩＴＳ序列分析技术作为辅助鉴定玉米根围土壤中分离到的腐霉菌，提高了鉴定的准确性。
在本研究中，虽然Ｐ１６６Ｃ的序列与Ｇｅｎｂａｎｋ上登记的腐霉菌株ＡＹ５９８６８１的同源性最高，位于系统发育树
的同一分支（图４）。但ＡＹ５９８６８１所示腐霉（犘．犱犻狊狊犻犿犻犾犲）的最关键的形态特征之一是该菌的雄器通常完全缺
如［２１］，显然在这一点上菌株Ｐ１６６Ｃ的有性态特征与犘．犱犻狊狊犻犿犻犾犲完全不符合。Ｐ１６６Ｃ始终未观察到孢子囊，藏
卵器光滑、球形，顶生或间生，每一藏卵器上的雄器数目为１～５个，多为同丝生，也有异丝生，不分支或分支，这些
形态学特点与硬腐霉的关键特征相一致［２１］。形态学反复比较研究证明Ｐ１６６Ｃ无论在培养特性上、还是在形态
上，都与硬腐霉基本吻合。分子鉴定结果表明，菌株Ｐ１６６Ｃ的序列与Ｇｅｎｂａｎｋ上登记的菌株ＡＢ２４８９１２（硬腐
霉）和ＡＹ５９８６８０（硬腐霉）在同一进化水平上（图４），支持了Ｐ１６６Ｃ是硬腐霉的形态学鉴定结果。可以看出，只
有形态与分子鉴定技术相结合，才能更准确的鉴定出腐霉菌。另外，菌株Ｐ１６１３Ｃ未鉴定到种，仍有待研究，这
里不再进行讨论。
在研究中，发现Ｐ１３９Ｄ菌株在显微镜视野中虽未观察到排孢管，但有时能见到少量游动孢子。根据资
料［７，２１］初步推断，从玉米根围分离到的以Ｐ１３９Ｄ为代表的菌株有可能是在室温条件下能释放游动孢子的终极腐
霉变种，有待进一步研究。
值得探讨的是，不同的腐霉菌种由于生长习性和生物学特性的差异，通过一种方法分离到土壤中全部的腐霉
３３１第１８卷第３期 草业学报２００９年
菌种几乎是不可能的。随着研究的深入，有必要利用多种分离方法对玉米根围土壤中的腐霉菌进行系统研究，搞
清随季节变化腐霉菌种群的季节变化和数量上的消长规律，探明种群与玉米病害的关系。
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犐狊狅犾犪狋犻狅狀，犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀，犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犇犖犃－犐犜犛狅犳
犘狔狋犺犻狌犿狊狆犲犮犻犲狊狊犪犿狆犾犲犱犳狉狅犿狉犺犻狕狅狊狆犺犲狉犲狊狅犻犾狅犳犮狅狉狀
ＣＨＡＩＺｈａｏｘｉａｎｇ１，２，３，４，ＬＩＪｉｎｈｕａ１，２，ＬＯＵＢｉｎｇｇａｎ５，ＬＩＷｅｉ６，ＧＡＮＨｕｉｌｉｎ１，
ＧＵＯＣｈｅｎｇ１，ＺＨＡＯＬｉｎｇ１，ＤＯＮＧＤｉ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＧａｎｓｕＫｅｙ
ＬａｂｏｆＣｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；４．ＳｉｎｏＵ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓｆｏｒ
ＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；５．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２９，Ｃｈｉｎａ；６．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：犘狔狋犺犻狌犿ｓｐｐ．ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｓｏｆｃｏｒｎｓａｍｐｌｅｄｆｒｏｍＨｏｎｇｇｕａｎｄＱｉｌｉｈｅｄｉｓ
ｔｒｉｃｔｓｏｆＬａｎｚｈｏｕｕｓｉｎｇａｂａｉｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｗｅｎｔｙｔｈｒｅｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｕｌｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｇｒｏｗｔｈｒａｔｅ，ａｄａｐｔａｔｉｏｎｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆｒＤＮＡ－ＩＴＳ，ｔｈｅ２３ｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犘．狊犮犾犲狉狅狋犲犻犮犺狌犿，犘．狌犾狋犻犿狌犿ｏｒ犘狔狋犺犻狌犿ｓｐ．Ｔｈｉｓｉｓ
ｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆ犘．狊犮犾犲狉狅狋犲犻犮犺狌犿ｉｎＣｈｉｎａａｎｄｏｆ犘．狌犾狋犻犿狌犿ｆｒｏｍｃｏｒｎｉｎＧａｎｓｕ．犘．狌犾狋犻犿狌犿ｗａｓｔｈｅｄｏｍｉ
ｎａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓ（６０．９％ｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｓ），ｗｈｉｌｅ犘狔狋犺犻狌犿ｓｐ．（２６．１％）ｗａｓｓｅｃｏｎｄ，ａｎｄ，
犘．狊犮犾犲狉狅狋犲犻犮犺狌犿 （１３．０％）ｗａｓｔｈｉｒｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣犲犪犿犪狔狊；ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌ；犘狔狋犺犻狌犿ｓｐｐ．；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｒＤＮＡ－ＩＴＳ
５３１第１８卷第３期 草业学报２００９年