全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (5) : 619～624
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0520619206
具有解磷能力的相思根瘤菌的筛选
张希涛 , 康丽华 3 , 马海宾 , 江业根
(中国林业科学研究院热带林业研究所 ,广东 广州　510520)
摘要 :对海南、福建、广州、清新分离的根瘤菌和实验室保存的部分根瘤菌进行了解磷能力的研究 ,从 200多株根瘤
菌中筛选出 40株具有解磷能力的菌株 ,通过测定根瘤菌在固体培养基和液体培养基中溶解无机磷和有机磷的能
力 ,筛选出 2株解磷能力较强的菌株 G723和菌株 DH001。菌株 G723在无机磷和有机磷培养基中的解磷量分别是
4. 142、9. 944μg·mL - 1 ,与其它菌株有明显的差异 ;在无机磷液体培养基中 ,菌株 DH001微克菌体解磷量为
0. 086 7μg,和其它菌株有显著差异。对筛选出的菌株进行了 16S rDNA测序分析 ,确定筛选出的菌株除 H12121和
H22122外 ,其它菌株均为根瘤菌。
关键词 :根瘤菌 ;解磷能力 ;解磷量
中图分类号 : S144. 9　　　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2007204211
基金项目 : 国家级星火计划项目“林业专用多功能微生物肥料开发与应用推广 ( 2005EA169010) ”和国家科技基础条件平台项目“林业
微生物菌种资源标准化整理、整合及共享试点 (2005DKA2120724) ”
作者简介 : 张希涛 (1978—) ,男 ,山东平原县人 ,硕士研究生.3 通讯作者
Selection of Acac ia Rh izob ium W h ich Have the Ab ility to D issolve Phosphorus
ZHANG X i2tao, KANG L i2hua, MA Hai2bin, J IANG Ye2gen
(Research Institute of Trop ical Forestry, CAF, Guangzhou　510520, Guangdong, China)
Abstract: Parts of rhizobium collected from Hainan, Fujian, Guangdong and the specimen stored in the laboratory of
Research Institute of Trop ical Forestry were used to study their phosphorus2dissolving ability. 40 isolates were
selected from over 200 rhizobium isolates. By checking their ability of dissolving inorganic and organic phosphorus
in solid media and liquid media, 2 isolates ( G723 and DH001) which had stronger phosphorus2dissolving ability
were chosen. The quantity of phosphorus G723 could dissolved in inorganic and organic media were 4. 142μg·
mL - 1 and 9. 944 μg ·mL - 1 , respectively, which were significantly different from the others. In inorganic
phosphorus liquid media, DH001 inμg thalli dissolved 0. 086 7μg of phosphorus, which had notable difference
with the others. 16S rDNA sequence was used to analyze the isolates selected, it is found that all the isolates were
rhizobium excep t H12121 and H22122.
Key words: rhizobium; phosphorus2dissolving ability; phosphorus2dissolving quantity
　　磷是植物生长所必需的大量元素之一 ,土壤中
磷含量较高 ,但大部分以植物难以利用的无机磷和
有机磷的状态存在。在植物的栽培过程中 ,施用了
大量的磷肥 ,但很快就与土壤中的矿物质作用 ,成为
植物难以利用的磷 [ 1 ] ,所以 ,虽然施用了很多的磷
肥 ,却不能满足植物本身对磷的需求。土壤中很多
微生物可以不同程度的溶解土壤中的非可溶性
磷 [ 2 - 3 ] ,具有解磷能力的微生物称为解磷微生物 [ 4 ]。
豆科植物与根瘤菌共生固氮体系的固氮量约占
全球生物固氮量的一半 [ 5 ] ,在生物固氮中占有重要
地位。长期以来 ,对根瘤菌的研究主要集中在固氮
作用及与宿主植物的相互关系上 [ 6 - 7 ] ,而对其它的作
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
用研究较少 ,特别是根瘤菌的解磷作用。本文研究了
根瘤菌的解磷作用 ,筛选既有固氮作用又有解磷能力
的根瘤菌 ,增加根瘤菌的应用功能和范围 ,为开发有
固氮和解磷作用的多功能根瘤菌肥料提供优良菌株。
1　材料和方法
1. 1　根瘤菌的分离
从海南、福建、广州、清新采集根瘤 ,进行分离纯
化、保存。挑取新鲜、饱满、个大的根瘤 ,自来水冲洗
干净表面泥沙 ,于 95%酒精中浸泡 15～30 s后 ,放
入 0. 1%酸性升汞溶液中表面消毒 3～5 m in,无菌水
冲洗干净。将表面消毒后的根瘤放在 2片无菌载玻
片之间 ,用力挤压使根瘤破碎 ,用接种针沾取根瘤液
在 YMA平板上划线 , 28～30 ℃恒温培养箱培养至
菌落出现 ,挑取典型菌落纯化保存 [ 8 ]。
另外一部分供试菌株来自本实验室保存的根
瘤菌。
1. 2　溶磷能力的测定
1. 2. 1　培养基 　无机磷固体培养基 :蒙金娜无机
磷 [ 9 ]固体培养基加入 0. 01%的溴甲酚紫。
有机磷固体培养基 :牛肉膏蛋白胨培养 [ 9 ]基中
加入 0. 3%的蛋黄液 (有机磷源 )。
蛋黄液的制备 :用酒精消毒棉球擦净鸡蛋外壳 ,
用无菌吸管从鸡蛋中抽取蛋黄置一无菌空试管中 ,
加入等量的生理盐水充分摇匀 ,制成蛋黄液 (注意不
要混有蛋清 )。
　　无机磷液体培养基 :蒙金娜无机磷液体培养基。
有机磷液体培养基 :蒙金娜液体培养基用卵磷
脂作为磷源。
1. 2. 2 　根瘤菌在固体培养基中解磷能力的测
定 　将在斜面上培养好的根瘤菌点样到装有 15 mL
的固体解磷培养基平板上 , 28 ℃培养 96 h,观察解
磷圈的大小。
1. 2. 3 　根瘤菌在液体培养基中解磷能力的测
定 将培养好的 1 mL菌种接入 50 mL灭菌的液体
培养基中 , 28 ℃在摇床上培养 2 d (130 r·m in - 1 ) ,
离心 (7 000 r·m in - 1 ) 20 m in,吸取上清液 ,根瘤菌
解磷能力测定采用钼锑抗比色方法 [ 10 ]。
1. 3　根瘤菌菌体蛋白质含量的测定
采用考马斯亮兰方法测定菌体蛋白质含量 [ 11 ]。
1. 4　pH值和解磷能力动态测定
每隔 12 h取样测定培养液的 pH值和水溶性磷
含量 , pH值采用 pHS23C型酸度计测定 ,磷含量测定
采用钼锑抗比色方法。
2 结果与分析
2. 1 根瘤菌在无机磷固体培养基中的解磷能力
2. 1. 1　具有解磷能力菌株的初步筛选 　将根瘤菌
在无机磷固体培养基上划线 ,根据培养基颜色变化 ,
来判断菌株是否具有解磷能力 ,从 244株菌株中初
步筛选到 40株具有解磷能力的菌株 ,具有解磷能力
的菌株占测试菌株的 16. 39% (表 1)。
表 1　根瘤菌来源及解磷能力的初步筛选
分离地点 宿主植物 测定菌株数 /株 具有解磷能力的菌株
海南尖峰岭
猴耳环 12 7株 ( H12121, H12122, H12123, 12124, 12125, H22121, H22122)
海南黄檀 23 无
白格 5 无
广东清新 马占相思 20 无
福建漳州
珍珠叶相思 20 1株 ( F32226)
卷荚相思 20 无
直杆相思 8 无
多花相思 25 1株 ( F722211)
流苏相思 21 无
广州
黑木相思 17 1株 ( G122)
厚荚相思 27 7株 ( G521, G525, G623, G7Ο3, G725, G822, G825)
马占相思 21 16株 ( G312121, G312122, G312123, G312124, G312125 , G312126, G312127, G312128, G312
129, G3121210, G3121211, G3121212, G312221, G312222, G312223, G312224)
广州 实验室储存菌株 25 7株 ( IS004酸 21, LL007酸 , LH001, IS004, DH001, LR02523, Y木 1 )
　　注 :猴耳环 ( P ithecellobium clypearia (Jack) Benth. ) ;海南黄檀 (D alberg ia hainanensis Merr. et Chun) ;白格 (A libizzia procera ( Roxb. ) Benth) ;
马占相思 (Acacia m angium. W illd) ;珍珠叶相思 (A. podalyriifolia W illd) ;卷荚相思 (A. crassicarpa W illd) ;直杆相思 (A. auriculiform is A. cunn. ex
Benth) ;多花相思 (A. f liriurda (Vent) W illd) ;流苏相思 (A. fim briafa A. Cunn. ex G. Don) ;黑木相思 (A. m elanoxylon. W illd) ;厚荚相思 (A. crassicar2
pa W illd)。
026
第 5期 张希涛等 :具有解磷能力的相思根瘤菌的筛选
　　从筛选出的 40株具有解磷能力的菌株中随机
挑取 20株具有代表性的菌株进行进一步解磷能力
的测定 , 20株菌株分别是 : H12123、H22122、LR02523、
IS004 酸 21、IS004、Y木 1、LL007 酸、LH001、DH001、
G312125、G723、G122、H12121、H22121、G521、G623、F32
226、F722211、G312121、G3121210。
2. 1. 2　根瘤菌在无机磷固体培养基中的解磷能力
　将具有解磷能力的 20株具有代表性的菌株在平
板上点样 ,培养 96 h后 ,测定解磷圈的大小 ,并通过
解磷圈的大小对菌株的解磷能力做初步鉴定。由表
2看出 : 菌株 IS004的解磷圈最大 ,说明该菌株在固
体无机磷培养基中的解磷能力最强 ;菌株 LH001和
表 2　不同菌株在无机磷固体培养基上的解磷圈　cm2
菌株
重复
1 2 3
均值 LSR0. 05
H12123 0. 589 0. 306 0. 353 0. 416 a
H22122 0. 188 0. 188 0. 220 0. 199 a
LRO2523 0. 188 0. 188 0. 306 0. 227 a
ISOO4酸 21 0. 667 1. 484 1. 625 1. 259 b
ISOO4 2. 268 1. 986 1. 986 2. 080 c
LH001 1. 413 1. 413 1. 813 1. 546 b
Y木 1 0. 259 0. 259 0. 188 0. 235 a
LL007酸 0. 212 0. 212 0. 126 0. 183 a
G312125 0. 188 0. 220 0. 306 0. 238 a
G122 0. 259 0. 157 0. 220 0. 212 a
H12121 0. 754 0. 440 0. 306 0. 500 a
H22121 0. 306 0. 157 0. 157 0. 206 a
F32226 0. 157 0. 157 0. 157 0. 157 a
G312121 0. 306 0. 659 0. 659 0. 541 a
　　注 :表中同列相同字母表示无显著差异 ,不同字母表示差异显著
( P = 0. 05) ,下同。
IS004酸 21的解磷圈次之 ,和其它菌株间差异显著 ,
其余菌株间差异不显著。解磷能力最强的菌株
IS004的解磷圈面积是解磷能力差的菌株 F32226的
13. 25 倍。另外菌株 G3121210、G623、G521、G723、
DH001、F722211在无机磷固体培养基中溶磷圈面积
为 0. 05～0. 10 cm2。
2. 1. 3　不同培养时间对根瘤菌解磷能力的影响 　随
机挑取 6个菌株研究不同培养时间与根瘤菌在无机
磷液体培养基中解磷能力的关系 ,结果见表 3。从
表 3看出 :根瘤菌在无机磷液体培养基中培养 48 h
时 , H12123菌株的解磷量最高 , LR02523菌株的最
少 ;培养 96 h时 , IS004酸 21菌株的解磷量最高 ;但
总的趋势是 ,随着培养时间的延长 ,不同菌株的解磷
量都有不同程度的增加。
表 3　根瘤菌在无机磷液体培养基中不同培养时间的磷含量
菌株 磷含量 /
(μg·mL - 1 )
48 h 96 h
H12123 1. 990 2. 249
H22122 1. 619 1. 965
LRO2523 0. 105 1. 398
ISOO4酸 21 1. 461 3. 376
ISOO4 1. 366 2. 060
LH001 0. 862 1. 177
2. 1. 4　根瘤菌在无机磷液体培养基中的解磷能力
　20株根瘤菌在无机磷液体培养基中的溶磷能力见
表 4。从表 4可见 :供试菌株对磷的转化率在 0. 084%
～2. 069%之间 ,转化率越高表明该菌株的溶磷能力
表 4　20株根瘤菌在无机磷液体培养基中的解磷能力
菌株
菌液中磷含量
(μg·mL - 1 ) LSR0. 05
菌体蛋白质含量 /
(μg·mL - 1 )
菌体蛋白质解磷量
(μg·μg - 1 ) LSR0. 05
磷转化率 /%
H12123 0. 830 abcd 37. 111 0. 022 abcd 0. 412
H22122 0. 904 bcd 31. 492 0. 029 bcde 0. 447
LRO2523 0. 599 abcd 27. 639 0. 022 abcd 0. 289
ISOO4酸 21 0. 294 ab 100. 000 0. 003 a 0. 147
ISOO4 1. 177 d 71. 724 0. 016 abc 0. 587
LH001 1. 839 e 69. 518 0. 026 bcde 0. 919
DH001 1. 047 d 12. 841 0. 082 h 0. 557
Y木 1 0. 799 abcd 107. 070 0. 007 ab 0. 399
LL007酸 0. 796 abcd 20. 462 0. 039 def 0. 398
G312125 1. 924 e 43. 499 0. 044 ef 1. 012
G723 4. 142 f 134. 021 0. 031 cdef 2. 069
G122 2. 039 e 41. 053 0. 050 fg 1. 027
H12121 0. 275 abc 56. 321 0. 005 ab 0. 210
H22121 0. 128 a 48. 402 0. 003 a 0. 084
G521 1. 966 e 57. 049 0. 034 cdef 0. 983
G623 0. 100 cd 54. 501 0. 002 a 0. 489
F32226 0. 799 abcd 52. 633 0. 015 abc 0. 401
F722211 0. 210 a 49. 676 0. 004 a 0. 104
G3121210 1. 965 e 55. 798 0. 035 cdef 0. 983
G312121 2. 449 e 35. 993 0. 068 gh 1. 249
CK 1. 390
126
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
越强 ;菌株 G723的磷转化率最高 ( 2. 069% ) ,菌株
G312121的次之 ,其转化率为 1. 249% ,菌株 H22121的
溶磷能力最弱 ,转换率为 0. 084%。LSR分析可知 ,菌
株 G723的溶磷能力与其它菌株之间差异显著。通过
比较 ,初步筛选出溶磷能力最强的菌株是 G723。菌体
蛋白质含量可以反映根瘤菌在培养基中的生长情况 ,
表 4表明 ,菌株 G723的菌体蛋白质含量最高 ,说明此
菌株在该无机磷液体培养基中生长良好。
菌体蛋白质解磷量越高 ,表明该菌株在菌体蛋白
质含量相同的情况下解磷能力越强。表 4中菌体蛋
白质解磷量表明 :菌株 DH001的解磷量最高 ,菌株
G312121的次之 ,与其它菌株的解磷能力有显著差异 ,
而 IS004酸 21、H22121、F722211、G623的溶磷能力较差。
2. 1. 5　溶磷量及对应 pH值动态曲线 选取 3株
菌 ,接种后每 12 h观察 1次 ,测定菌液中磷的含量
及对应的 pH值 ,溶磷量及对应 pH值动态曲线见图
1～3。从图 1～3看出 :在接种根瘤菌后 ,菌液中磷
含量逐渐增加 ,随着培养时间的延长 ,接种 G723菌
株的菌液的磷含量增加明显 ,在 96 h时解磷量达 5.
79μg·mL - 1 ;接种 H22122菌株的菌液在培养 12 h
时菌液的 pH值最低 ,而接种 G723和 F722211菌株
的菌液在培养 24～36 h时菌液的 pH值最低 ,但在
36 h后菌液的 pH值逐渐升高 ,具体原因 ,有待于进
一步研究。
图 1　接种 H22122菌株的菌液的溶磷量及 pH值
图 2　接种 G723菌株的菌液的溶磷量及 pH值
图 3　接种 F722211菌株的菌液的溶磷量及 pH值
2. 2　根瘤菌在有机磷固体培养基上的解磷能力
2. 2. 1　根瘤菌在有机磷固体培养基上的解磷能
力 表 5表明 :不同菌株在有机磷固体培养基中的
溶磷圈大小存在显著差异 ,菌株 G312125的解磷圈
最大 ,故溶磷能力也最强 ,菌株 G521的次之 ,与其
它菌株存在显著差异 ,菌株 H22122、Y木 1、F32226、
DH001、LH001、G122、G3121210、H12123、H22121、
LL007酸在有机磷固体培养基上无溶磷圈产生。
表 5　不同菌株在有机磷固体培养基上的解磷圈　cm2
菌株
重复
1 2 3
均值 LSR0. 05
G312125 5. 521 3. 776 4. 611 4. 636 e
IS004 2. 010 2. 332 1. 130 1. 824 abc
H12121 0. 353 1. 884 0. 754 0. 997 ab
IS004酸 21 0. 542 0. 628 0. 628 0. 599 a
G623 1. 004 3. 768 2. 897 2. 556 bcd
LR02523 0. 628 0. 628 1. 037 0. 764 ab
G723 0. 589 3. 367 1. 413 1. 789 abc
F722211 2. 355 2. 190 2. 669 2. 405 abcd
G312121 2. 669 2. 355 5. 365 3. 463 cde
G521 5. 020 3. 392 3. 298 3. 903 de
2. 2. 2　根瘤菌在有机磷液体培养基上的解磷能
力 　从表 6可见 :在有机磷液体培养基中 ,接种
G723菌株的磷含量和微克菌体蛋白解磷量最高 ,
说明对有机磷的解磷能力最强 ,与其它菌株间差异
显著 ; G312125、Y木 1、DH001菌株的解磷能力次之。
表 6还表明 :菌株 DH001在有机磷液体培养基中
的菌体蛋白质含量最高 ,说明此菌株在有机磷液体
培养基中生长良好。
由表 5、6可以看出 :根瘤菌在有机磷液体培养
基和固体培养基中的解磷能力存在差异 ,这可能和
根瘤菌最适的培养条件有关。
2. 3　16S rD NA序列分析
对筛选到的解磷能力较强的菌株进行了测序 ,
采用 Clustal X和 Treeconw软件获得菌株的系统发
226
第 5期 张希涛等 :具有解磷能力的相思根瘤菌的筛选
表 6　根瘤菌在有机磷液体培养基中的解磷能力
菌株
菌液中磷含量
(μg·mL - 1 ) LSR0. 05
菌体蛋白质含量 /
(μg·mL - 1 )
菌体蛋白质解磷量
(μg·μg - 1 ) LSR0. 05
H12123 0. 197 a 122. 167 0. 001 6 a
H22122 0. 265 a 114. 543 0. 002 3 a
LRO2523 0. 241 a 110. 263 0. 002 2 a
ISOO4酸 21 0. 232 a 117. 120 0. 002 0 a
ISOO4 0. 145 a 115. 310 0. 001 3 a
LH001 3. 269 bcd 95. 927 0. 034 1 cde
DH001 5. 162 g 132. 690 0. 038 9 de
Y木 1 6. 113 h 113. 787 0. 053 7 f
LL007酸 2. 256 b 125. 50 0. 017 9 b
G312125 6. 314 h 118. 737 0. 053 2 f
G723 9. 944 i 89. 877 0. 110 6 g
G122 3. 085 bc 111. 40 0. 027 7 bcd
H12121 4. 159 defg 100. 923 0. 041 2 e
H22121 4. 342 efg 103. 883 0. 041 8 e
G521 3. 722 cde 116. 737 0. 031 9 cde
G623 3. 033 bc 109. 26 0. 027 8 bcd
F32226 4. 089 cdef 128. 833 0. 031 7 cde
F722211 3. 418 cde 127. 733 0. 026 8 bc
G312121 3. 958 cdef 115. 973 0. 034 1 cde
G3121210 4. 848 fg 111. 547 0. 043 5 ef
CK 4. 290
育树状图。从系统发育树可看出 : H12121和 H22122
与根瘤菌的亲缘关系较远 ,在 GenBank上进行比对 ,
H12121和 H22122属于类芽孢杆菌 ,具有固氮能力 ,
同时具有解磷能力 ,其余菌株均为根瘤菌 , G623、
G312125、G3121210、G723、LR02523 属于 R hizobium ,
F722211属于 B radyrh izobium , DH001、LH001、LL007
酸、G521、Y木 1、F32226属于 M esorh izobium。
3　讨论
(1)根瘤菌的解磷量和 pH值变化存在一定的关
系 ,林启美 [ 3 ]等发现培养介质酸度升高是溶解磷矿粉
的重要条件 ,但不是必要条件 ,许多人发现解磷量与
培养介质的 pH值之间缺乏相关性 [ 12 - 13 ] ,从图 1～3
可以看出 ,解磷量和 pH值之间不存在必然的相关性 ,
但也有报道二者之间存在显著的相关性 [ 14 ]。
(2)在根瘤菌解磷能力的研究中 ,发现在固体培养
基中具有很强解磷能力的菌株 ,在液体培养基中解磷
能力降低 ,相反 ,很多菌株在固体培养基中解磷能力较
差 ,而在液体培养基中却表现出很强的解磷能力。
部分菌株在无机磷培养基中有很强的解磷能
力 ,但在有机磷培养基中解磷能力不高 ;在有机磷培
养基中表现出很强的解磷能力的菌株 ,在无机磷培
养基中的解磷能力却较差。可以看出 ,菌株在不同
培养基中的解磷能力表现出很大的差异 ,不同培养
基对菌株的解磷能力有显著的影响。
(3) 测定根瘤菌在液体培养基的解磷能力时发
现 ,部分菌株菌液中的可溶性磷含量比对照的还要
少 ,赵小蓉研究表明 [ 3 ] :这是由于菌体在生长中会利
用一部分磷构建细胞成分。培养基的磷酸三钙微溶
于水 ,当菌体溶解的磷不能满足本身需要时 ,就会消
耗培养基中微溶的磷。不同菌株的解磷能力存在差
异 ,当根瘤菌溶解的磷超过本身的需要时就会释放
磷到菌液中 ,培养基中的磷增加 ,相反则减少。
(4) 本研究中解磷能力最好的根瘤菌为 G723
菌株 ,在无机磷液体培养基中的解磷能力为 4. 142
μg·mL - 1 ,在有机磷液体培养基中的解磷能力为
9. 944μg·mL - 1 ,该结果和文献中报道的解磷菌的
解磷能力有一定的差异 :林启美等 [ 2 ]发现以磷矿粉
作为唯一的磷源培养解磷细菌时 ,可溶性磷的含量
最高可达 11. 73μg·mL - 1 ,解磷能力较强的菌株为
假单胞菌属和欧文氏菌属 ; A sea等 [ 17 ]发现 2株青霉
菌 P. bila ji和 P. fuscum 菌株在纯培养条件下溶解磷
矿粉的能力分别为 203、298μg·mL - 1 ,而在土壤培
养条件下 ,分别为 77. 4、57. 8μg·d - 1。Kucey[ 18 ]报
道真菌的解磷能力一般是细菌的 10倍 ,许多细菌在
进一步的纯化中失去部分或全部的解磷能力 ,而真
菌则始终保持其解磷活力 ;细菌的解磷能力一般为
0. 08～2. 65 mg·mL - 1 ,而大部分真菌的溶磷能力均
超过能力最好的细菌 ,最高可达 12. 8 mg·mL - 1。
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