全 文 ：收稿日期 : 2002201210
基金项目 : 国家自然科学基金资助 (39970532)及国家林业局“948”项目 (9724206)资助
作者简介 : 林荣呈 (1970 —) ,男 ,浙江海宁人 ,中国科学院北京植物研究所博士研究生.
林业科学研究　2003 ,16 (2) :123～128
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2003) 0220123206
提高根癌农杆菌介导的香石竹
遗传转化效率的研究
林荣呈1 , 陈龙清1 , 包满珠1 , 孙振元2
(1. 华中农业大学园艺林学学院 , 湖北 武汉　430070 ; 2. 中国林业科学研究院花卉中心 , 北京　100091)
摘要 : 以无菌苗叶片为外植体 ,在根癌农杆菌介导下建立并优化了香石竹 5 个品种的遗传转化体系。
预培养 2 d 可明显提高转化率 ;香石竹品种间在转化上存在差异 ;培养基中添加 20μmol 的 AgNO3 抑
制不定芽的分化。转化植株在含 25 mg·L - 1卡那霉素的生根培养基上培养 ,生根率为 7211 % , GUS 检
测结果 55 %的转化植株呈蓝色 ,PCR 扩增表明阳性率为 3212 % ,Southern 杂交证实外源基因已整合到
植物基因组中。
关键词 : 香石竹 ; 根癌农杆菌 ; 遗传转化 ; GUS
中图分类号 :S72213 　　　文献标识码 :A
　　香石竹 ( Dianthus caryophyllus L1)是世界四大切花之一。传统育种方法在香石竹的品种演
化中发挥了巨大的作用 ,但是香石竹品种目前存在的一些问题如抗病、延长瓶插寿命等难以用
传统育种方法解决。植物基因工程的应用克服了传统育种方法的不足[1 ] 。自 1983 年首次获
得转基因植株以来 ,转基因技术已在多种植物上获得了成功[2 ] 。花卉也已成为遗传转化研究
的活跃领域之一 ,在香石竹上的研究从 1989 年开始报道[3 ] ,此后 ,Lu 等[4～6 ]都分别将报告基
因 GUS、NPTⅡ转入香石竹体内 ,建立了遗传转化体系。Savin 等[7 ]在延长香石竹花朵瓶插寿命
方面取得了重大进展 ,他们将反义 ACC 氧化酶 (ACO) 基因转入香石竹 ,结果转基因植株花朵
的瓶插寿命比对照延长 8 d。最近 ,余义勋等[8 ]在抗衰老基因的克隆与载体构建方面做了一些
研究 ,Zuker 等[9 ]还利用基因枪法进行了转化试验。
本研究在前人研究的基础上 [10 ] , 在根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens ( Smith et
Townsend) Conn)介导下优化了以香石竹叶片为外植体的植株再生体系 ,从而为香石竹的遗传
改良、分析外源基因的表达情况 ,以及外源基因与内源基因的互作等研究打下基础。
1 　材料
供试香石竹材料采自上海市华安园艺公司。5 个品种为 Master、Oriana、Laurrella、Sahala 和
Virginie。以无菌苗顶芽以上的 2～3 对叶片作外植体。根癌农杆菌两个菌株为 LBA4404 和
EHA101 ,采用双元载体系统 pBECKS4001Zsk (由英国 De Montfort 大学提供 ) 。携带质粒
pBECKS1GUSintron[11 ] 。
2 　方法
211 　培养基
植物培养以 MS[12 ]为基本培养基 ,附加不同浓度的植物激素和抗生素 (卡那霉素购自武汉
卫检科技服务公司 ,头孢酶素购自中国科学院遗传研究所 ,华北制药厂特制) 。培养基 D :MS
+ BA 110 mg·L - 1 + NAA 013 mg·L - 1 + 蔗糖 30 g·L - 1 + 琼脂 6～8 g·L - 1 ;培养基 C :D + 乙酰丁
香酮 20μmol ;培养基 SD :D + 卡那霉素 75 mg·L - 1 + 头孢霉素 400 mg·L - 1 ;培养基 SO :MS + BA
015 mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1 + 蔗糖 30 g·L - 1 + 琼脂 6～8 g·L - 1 + 卡那霉素 75 mg·L - 1 + 头孢
霉素 200 mg·L - 1 ;培养基 SR :1/ 2MS + NAA 011 mg·L - 1 + 蔗糖 30 g·L - 1 + 琼脂 5 g·L - 1 + 卡那霉
素 25 mg·L - 1 ,pH值为 516～518。
根癌农杆菌培养以LB 作培养基 ,pH值为 710 ,固体培养加琼脂 10 g·kg - 1。
用高压灭菌锅灭菌 (111 kg·cm - 2 ,121 ℃) 20 min ,抗生素用 0145μm 滤膜过滤灭菌。
212 　转化方法
将无菌苗叶片平放接种于培养基 D 上 ,置光照培养箱 (LRH22502G,广东省医疗仪器厂生
产)中预培养。温度 25 ±1 ℃,光照强度 1 500～2 000 lx ,每天光照 14 h。
预培养后的叶片置于过夜振荡培养 (28 ℃,150 r·min - 1) 的根癌农杆菌悬液中浸泡 6～8
min ,用无菌滤纸吸去表面多余的菌液 ,并置于培养基 C 上共培养 2～3 d。随后将叶片转到选
择分化培养基 SD 上进行不定芽的诱导。当芽长出约 1 cm 后 ,转入增殖培养基 SO 上增殖。
设立接种于普通培养基上未经农杆菌侵染的叶片为对照。对预培养时间、不同的香石竹
品种 ,以及不同的根癌农杆菌菌株和质粒对转化的影响进行比较。
213 　鉴定方法
21311 　GUS 组织化学检测　将再生植株在含卡那霉素的生根培养基上生根之后 ,参照孙敬三
等[13 ]的方法 ,将无菌苗叶片切成小块 ,置于含 X2Glucuronide 的反应缓冲液中 37 ℃保温过夜 ,
再用 70 %乙醇脱去叶绿素。
21312 　PCR 分析　植物总 DNA 的提取参照张俊卫的微量 SDS 提取法[13 ] 。引物为 npt Ⅱ基因
两端的特异序列 (由上海生工生物工程有限公司合成 ) 。引物 1 : 5’- GAGGCTATTCGGC2
TATGACT- 3’;引物 2 : 5pi- AATCTCGTGATGGCAGGTTG - 3’。反应体系 : 1 ×反应缓冲液 ; 115
mmol MgCl2 ;012 mmol dNTPs ;015μmol 引物 1、2 ;1 u Taq 酶 ;50～100 ng DNA ,加水至反应总体积
20μL ,以矿物油覆盖 (Taq 酶及 dNTPs 购自武汉生物工程有限公司 ,矿物油为 Sigma 公司生产) 。
反应条件 :94 ℃预变性 3 min ,然后 94 ℃1 min ;57 ℃1 min ;72 ℃2 min ,30 个循环 ,之后在 72
℃延伸 10 min ,反应结束后保存于 4 ℃(PCR 基因扩增仪为 Hema 480 ,珠海黑马医学仪器有限
公司生产) 。扩增产物在 14 g·kg - 1琼脂糖凝胶上电泳 ,并紫外照相。
21313 　Southern 杂交分析　方法参照傅荣昭等[14 ] 。5～10μg 植物DNA 经 Hind Ⅲ酶切消化 ,电
泳后变性 ,印迹到尼龙膜上 ,DNA 固定后与探针 (32p2dCTP 标记的 npt Ⅱ基因和λDNA) 杂交 ,最
后放射自显影到 X光片上。
3 　结果
311 　植株再生及转化体筛选
31111 　预培养对香石竹在转化中叶片分化的影响　试验结果表明 :不进行预培养 ,香石竹叶片
421 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
的分化率只有 110 % ,预培养可明显提高农杆菌感染后叶片的分化率 ,预培养 1 d ,其分化率为
613 % ,以预培养 2 d 的效果最好 ,其分化出正常芽的频率最高 ,达 1210 % ,比不预培养提高了 11
倍 ,但随着预培养时间的增加 ,其分化频率又下降 ,到预培养 3 d 时 ,其分化率又降至 711 %。
31112 　不同香石竹品种在转化上的差异　植物不同的品种 ,由于基因型不同 ,其转化频率亦
存在差异。用LBA4404/ pBECKS1GUSintron 对 5 个香石竹品种的转化结果表明 :与对照相比 ,经
根癌农杆菌感染后 ,5 个品种在选择培养基上的不定芽分化时间晚 2～3 d ,外植体膨大 ,伸长
较慢 ,后期外植体逐渐死亡 (图版 I21) 。分化
频率都显著降低 ,平均降低 4918 % ;不同品种
的分化频率不同 ,以 Master、Virginie 品种最高 ,
Oriana、Laurrella 品种次之 ,而 Sahala 品种与其
它品种差别最大 ,其分化频率最低 (表 1) 。
31113 　AgNO3 对香石竹转化的影响 　用
LBA4404/ GUS 对‘Master’、‘Laurrella’、‘Sahala’
表 1 　不同香石竹品种在转化上的差异
品种 Master OrianaLaurrella Sahala Virginie 平均
对照分化率/ % 6612 6819 6510 4910 6015 6119
转化分化率/ % 1611 1510 1313 117 1415 1211
相对分化率/ % 2413 2118 2015 315 2410 /
　　注 :相对分化率 = 转化分化率对照分化率×100 %
3 个品种的转化培养表明 ,未加 AgNO3 者 3 个品种的转化率分别为 1611 %、1313 %和 117 % ,而
加入AgNO3 (20μmol)者其转化率分别为 815 %、212 %和 0 ,其分化率均明显降低 ,并且外植体褐
化现象严重 ,开始褐化的时间也较早 ,一周后外植体的受伤部位开始变为土黄色 ,并逐渐加深
为黄褐色 ,其余部位颜色变暗绿 ,而对照则为黄绿色 ,表明 AgNO3 (20μmol) 对香石竹的转化起
抑制作用。
312 　转基因植株的鉴定
31211 　生根培养　将继代培养 1 代后的转化苗置于含 25 mg·L - 1卡那霉素的生根培养基上生
根 ,生根率为 7211 %(图版 I - 2、I - 3) 。与对照相比 ,出现根的时间晚 3 d 左右 ,且生根速度缓
慢 ,生根量较少。未生根的苗前期茎叶亦能生长 ,但后期茎叶逐渐自下而上枯黄。已生根的植
株初步表明外源基因得到了转化 ,未生根的植株予以淘汰。
31212 　GUS 组织化学分析 　从 LBA4404/ pBECKS1GUS 转化处理的植株中随机抽取 20 株 ,取
其叶片进行 GUS 组织化学染色 ,结果 11 株呈阳性反应 ,占 55 %。显微镜检可见叶片的叶脉部
位明显呈蓝色 ,未转化的对照植株的叶片未见蓝色 (图版 I - 4) 。
31213 　PCR 分析　从生根后的植株中随机选取 28 株 ,提取植物总 DNA ,用 npt Ⅱ基因序列两
端的特异引物作 PCR 扩增。扩增结果有 9 个样品呈阳性反应 ,占 3212 % ,扩增出约 017 Kb 的
片段 ,与质粒 DNA 扩增出的片段大小相同 ,表明外源基因已进入植物体内。而空白对照与未
转化对照均未扩增出特异片段 (图版 I - 5) 。
31214 　Southern 杂交分析　从 PCR 扩增呈阳性的样品中取样品作 Southern 杂交分析。放射自
显影显示有杂交带 (图版 I - 6) ,证实外源基因已整合到植物基因组中。
4 　讨论
关于预培养的效果 ,因植物种类而异。一些研究表明预培养可以提高外源基因的瞬间表
达和转化率 ,如诸葛菜 ( Orychophragmus violaceus (L1) O1E1Schulz) 预培养 2 d ,转化率提高 50
倍[15 ] 。但对烟草 ( Nicotiana tabacum L1)和苜蓿 ( Medicago f alcate Linn1) 的预培养并未提高转化
率。而树番茄 ( Lyphomandra betacea Sendt1)预培养后反而降低了转化率[2 ] 。本试验中以预培养
521第 2 期 林荣呈等 :提高根癌农杆菌介导的香石竹遗传转化效率的研究
　　图版说明
1. 卡那霉素筛选 :左上 :负对照 ;左下 :正对照 ;右 :在 25 mg·L - 1卡那霉素选择压下植株再生状况 ;
2. 在外加 25 mg·L - 1卡那霉素的培养基上生根 ;
3. 逃脱植株在 25 mg·L - 1卡那霉素的培养基上逐渐死亡 ;
4. GUS检测 :左边 3 个叶片呈阳性反应 ,右边为对照 ;
5. PCR 检测 :左边泳道为分子量标记 ,右边两泳道为阳性反应 ;
6. Southern 杂交 :左边泳道为分子量标记 ,右边泳道为阳性反应。
2 d 的转化率最高 ,比对照提高了 11 倍。与国内外已有的报道相比其转化效率也有了明显提
高。其原因可能是外植体刚取下后 ,伤口抵抗能力较低 ,不能立即接受农杆菌的侵染 ,而需要
有个恢复过程 ,但随着预培养时间的增加 ,伤口逐渐愈合 ,农杆菌难以将外源基因携带到植物
细胞内。因此有必要从农杆菌与植物细胞的相互关系上作深入的研究。
AgNO3 是一种乙烯抑制剂。有证据显示 ,它可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎
发生 ,促进一些再生困难物种不定芽的产生 ,增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频
621 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
率。受伤的外植体特别是伤口处易产生较多的乙烯并积累 ,使培养物的生长分化受到影响。
在培养基中加入 AgNO3 ,可以提高小麦 ( Tritictan aestivum L1) ,玉米 ( Zea mays L1)及一些芸苔属
( Brassica)植物的茎芽分化频率[15 ] 。在诸葛菜的试验中 ,加入 AgNO3 可大大减轻褐化现象 ,使
分化率提高约 40 % ,而且 AgNO3 对根癌农杆菌还有一定的抑制作用。在香石竹上的结果则相
反 ,培养基中加入 20μmol 的 AgNO3 ,反而加重了外植体的褐化 ,使分化频率降低。香石竹是一
种乙烯敏感植物 ,采后的花瓣会产生大量乙烯 ,但香石竹组培苗产生乙烯情况未见报道。本试
验中可能是由于 AgNO3 使用浓度过高 ,或者 AgNO3 对香石竹叶片分化培养起抑制作用从而导
致加入 AgNO3 之后转化率反而降低 ,这有待于进一步的研究。
研究中发现转化苗经 3～4 次继代培养后 ,容易出现玻璃化现象 ,而在相同的培养基上 ,对
照未发生类似情况。这表明玻璃化是由转化引起的 ,可能是因为用根癌农杆菌感染后 ,植物细
胞和组织的生理机能发生变化所致。目前 ,有关解决玻璃化问题有较多的研究 ,提出了一些有
效的防止措施[16 ] 。本研究使用 1/ 2 MS 培养基继代培养转化苗 ,很少发生玻璃化现象 ,又可壮
苗。这表明植物激素或培养基盐分含量对玻璃化有一定的影响。此方法可较好地保存转化材
料。
参考文献 :
[1 ] 　Woodson W R1 Biotechnology of floricultural crops[J ] . HortScience ,1991 ,26 (8) :1029～1033
[2 ] 　王关林 , 方宏均. 植物基因工程原理与技术[M] . 北京 : 科学出版社 , 1998
[3 ] 　Woodson W R , Goldsbrough P B. Genetic transformation of carnation using Agrobacterium tumefaciens [J ] . HortScience , 1989 , 24
(1) : 80
[4 ] 　Lu C Y, Nugent G, Wardley2Richardson T , et al . Agrobacterium2mediated transformation of carnation ( Dianthus caryophyllus L. )
[J ] . Bio Technology , 1991 , 9 :864～868
[5 ] 　Van Altvost A C , Riksen T , Kohorst H , et al . Shoot regeneration and Agrobacterium2mediated transformation of carnation[J ] . Acta
Horticulturae , 1995 , 420 : 92～94
[6 ] 　Van Altvost A C , Kohorst H , Jong J , et al . Transgenic carnation plants obtained by Agrobacterium tumefaciens2mediated transforma2
tion of petal explants[J ] . Plant Cell , Tissue and Organ Culture , 1996 , 169 : 169～173
[7 ] 　Savin KL , Baudioette S C , Graham M W , et al . Antisense ACC oxidase RNA delays carnation petal senescence[J ] . HortScience ,
1995 , 30 (5) : 970～972
[8 ] 　余义勋 , 张俊卫 , 孙振元 , 等. 香石竹 ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建[J ] . 林业科学研究 , 2002 , 15 (3) :
256～261
[9 ] 　Zuker A , Lchang P F , Ahroni A , et al . Transformation of carnation by microprojectile bombardment [J ] . Scientia Horticulturae ,
1995 , 64 : 177～185
[10 ] 　林荣呈 , 包满珠. 香石竹的叶片培养及植株再生[J ] . 植物生理学通讯 , 1999 ,35 (3) : 205～206
[11 ] 　McCormac A C , Wu H X , Bao M Z , et al . The use of visual marker genes as cell2specific reporters of Agrobaterium2mediated T2
DNA delivery to wheat ( Triticum aestivum L. ) and barley ( Hordeum vulgare L. ) [J ] . Euphytica , 1998 , 99 :17～25
[12 ] 　Murashige T , Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures [J ] . Plant Physiology 1962 , 15 :
473～497
[13 ] 　张俊卫 , 包满珠 , 陈龙清. 梅、桃、李、杏、樱的 RAPD 分析[J ] . 北京林业大学学报 , 1998 , 20 (2) :12～15
[14 ] 　傅荣昭 , 孙勇如 , 贾士荣. 植物遗传转化技术手册[M] . 北京 : 中国科学技术出版社 , 1994
[15 ] 　周冀明 , 卫志明 , 许智宏 , 等. 根癌农杆菌介导转化诸葛菜子叶获得转基因植株[J ] . 植物生理学报 , 1997 , 23 (1) : 21
～28
[16 ] 　Amita J , Husain S , Kothari S L. Micropropagation of Dianthus caryophyllus L. control of vitrification[J ] . J of Plant Biochemistry
and Biotechnology , 1997 , 6 (1) : 35～37
721第 2 期 林荣呈等 :提高根癌农杆菌介导的香石竹遗传转化效率的研究
Establishment of Efficient Agrobacterium tumefaciens2mediated Genetic
Transformation System of Carnation( Dianthus caryophyllus L. )
　LIN Rong2cheng1 , CHEN Long2qing1 , BAO Man2zhu1 , SUN Zhen2yuan2
(1. College of Horticulture and Forestry Sciences , Huazhong Agricultural University , Wuhan 　430070 , Hubei , China ;
2. Flower Center ,CAF ,Beijing 　100091 ,China)
Abstract : Efficient genetic transformation system of five carnation ( Dianthus caryophyllus) cultivars has been
established and optimized by using leaf explant . The results show that 22daypis pre2culture can increase the trans2
formation frequency obviously. There are differences between carnation cultivars in transformation. 20μmol
AgNO3 in selection medium inhibits the adventitious shoot inducing. 7211 % transformed plants rooted on rooting
medium containing 25 mg·L - 1 kanamycin and 55 % plants show GUS activity according to histochemical assay.
PCR screening indicates that 3212 % of the samples are positive. Southern blot analysis demonstrates that for2
eign genes are integrated into plant genome.
Key words : Dianthus caryophyllus ; Agrobacterium tumefaciens ; genetic transformation ; GUS
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