全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (1) : 6～9
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0120006204
中间锦鸡儿 fad2基因片段克隆、反义表达载体
构建及遗传转化初步研究
汪阳东 1, 2 , 李春秀 1 , 齐力旺 1 , 张守攻 13
(1. 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091;
2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘要 :以我国重要的生物能源灌木 ———中间锦鸡儿枝叶和种子为材料 ,根据 GenBank中已经发表 fad2基因的同源
序列 ,利用 PCR技术克隆得到基因片段。在 GenBank中 B last ( GenBank登录号 AY957393)所得基因片段和同属豆
科的 Glycine max Gm fad222a同源性高达 88% ,位于 fad2基因编码区中部。将所得片段经 BamH I和 Sac I酶切后插
入表达载体质粒 pB I121,构建了反义表达载体 pB I121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片 ,获得了抗卡那霉素
和氨苄青霉素的再生烟草植株。初步分析结果表明 :与对照烟草相比 ,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异 ,
而亚油酸则减少 10. 3%。
关键词 :中间锦鸡儿 ;生物柴油 ; fad2基因 ;反义表达载体 ;遗传转化
中图分类号 : Q75 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006210230
基金项目 : 国家高技术研究发展项目 (“863”)“抗逆优质柠条新品种选育”(2002)资助
作者简介 : 汪阳东 (1973—) ,安徽岳西人 ,硕士 ,助理研究员 ,在读博士生.3 通讯作者
C lon ing of fad2 Gene Fragm en ts from C a ragana in te rm edia, Con structing of
An isence fad2 Expression Vector and Its Genetic Tran sforma tion in Tobacco
WANG Yang2dong1, 2 , L I Chun2xiu1 , Q I L i2wang1 , ZHANG Shou2gong1
(1. Research Institute of Forestry, CAF; Key Laboratory of Tree B reeding and Cultivation, state Forestry Adm inistration, Beijing　100091, China;
2. Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang　311400, Zhejiang, China)
Abstract:△212 fatty acid desaturase is an important enzyme in the route of p roduction of polyunsaturated lip ids. Con2
trol the gene exp ression of △212 fatty acid desaturase can change p lant fatty acid for good p lant biodiesel. Two cDNA
fragments of fad2 gene were cloned using degenerate p rimers from Caragana interm edia, an important biodiesel p lant.
The DNA sequence analysis indicated that the fragments contained 452 and 480 bp respectively, and shared 88% of
homology with Glycine max Gm fad222a in GenBank. Both of the gene fragments were registered in GenBank
(AY957393). The fragment AY957394 (452 bp) was digested with the enzyme BamH I and Sac I, and ligated to the
corresponding sites of the pB I121 in the antisense orientation. The pB I121fad2 vector was introduced into Agrobacteri2
um tum efaciens strain LB4404 by electroporation and transformed to leaves of tobacco via Agrobacterium tum efaciens
system. Plantlets were regenerated in vitro by resistance selection on medium containing Amp icillin and Kanamycin.
PCR amp lification with p rimer designed according to the fad2 gene fragment and NPTII gene in pB I121 demonstrated
that antisense fad2 was integrated into tobacco genomes. The analysis of fatty acids of transgenic tobacco p lants with
antisense fad2 showed that the content of linoleic acid was 10. 3% less than that of the un2transgenic tobacco p lants.
第 1期 汪阳东等 :中间锦鸡儿 fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究
Key words: Caragana in term ed ia; biodiesel; fad2 gene; antisense exp ression vector; genetic transformation
中间锦鸡儿 ( Caragana in term ed ia Kuang et H.
C. Fu )是一种重要的生物质能源灌木 ,广泛分布在
我国华北和西北 [ 1, 2 ]。根据测定 ,中间锦鸡儿种子
中含有各种脂肪酸 ,如硬酯酸、油酸、亚油酸等 ,其中
不饱和脂肪酸含量平均为 87. 5% ,多不饱和脂肪酸
为 60. 1% ,但制造优质生物柴油要求植物油脂中多
不饱和脂肪酸含量尽量低 ,单不饱和脂肪酸含量
高 [ 3 ]。因此 ,降低种子中多不饱和脂肪酸含量是中
间锦鸡儿品质改良的重要目标之一。油酸脱氢酶
( EC1. 3. 1. 35, 12酰基 222油酰基 2sn2甘油 2磷酸胆碱
脱氢酶 )是植物多不饱和脂肪酸合成的关键酶之一。
1994年 , Okely等 [ 4 ] 利用 T2DNA 标签法从拟南芥
(A rabidopsis tha liana (L. ) Heynh. )中克隆得到了油
酸脱氢酶基因。随后 ,陆续从油菜 (B rassica cam pes2
tris L. )、芝麻 ( S esam um ind icum L inn. )、大豆 ( Gly2
cine m ax (L inn. ) Merr. )、向日葵 ( Helian thus annus
L. )等植物中分离出了此基因 ,并转化了油菜等
植物 [ 5～11 ]。
本研究根据 GenBank中发表的 fad2基因序列
设计兼并性引物 ,从中间锦鸡儿中克隆到亚油酸合
成酶基因 fad2片段 ,构建了反义表达载体 ,并通过
根癌农杆菌系统导入烟草 ,获得转基因烟草再生植
株 ,以期通过抑制多不饱和脂肪酸的合成 ,获得高含
量的单不饱和脂肪酸的烟草植株。
1　材料与方法
1. 1 材料
供试材料为盆栽多年生的中间锦鸡儿枝叶和未
成熟种子。逆转录酶购自 Clontech公司 ;普通 Taq
酶购自北京鼎国生物技术有限公司 ; RNA提取试剂
TR IZOL、载体 pGEM T2easy、T4连接酶、限制性内切
酶 EcoR I、Sac I和 BamH I均购自 Promega公司 ; DNA
胶纯化回收试剂盒购自 M ilipore公司。引物分别由
北京赛百盛公司和上海生工公司合成 ,测序由北京
三博远志公司完成。大肠杆菌感受态细胞为北京天
为时代公司生产。
1. 2　方法
1. 2. 1　中间锦鸡儿叶和芽总 RNA的提取与 cDNA
第 1链和第 2链合成 　称取一定量的中间锦鸡儿枝
叶和种子于液氮中充分研磨后 ,按 Promega公司提
供的方法进行 RNA提取、纯化和检测。 cDNA第 1
链和第 2链的合成均按 Clontech公司的 SMART cD2
NA L ibrary Construction Kit说明书进行。
1. 2. 2　cDNA的特异性片断的扩增 　根据 GenBank
中登录的 fad2 基因和蛋白质中氨基酸序列 ,用
Clustalx (1. 8)软件比较其同源性 ,选择一对保守氨
基酸序列设计兼并性引物 :
FAD2F1: 5’2CGTCGCCA ( C /T) CA ( C /T) TC
(C /T) AACAC23’
FAD2R1: 5’2CCCCTAA ( A /G) CCA ( A /G)
TCCCA (C / T) TC23’
PCR扩增为 20μL反应体系 :双链 cDNA 1μL
(2μg·μL - 1 ) , 10 ×PCR 缓冲液 (含镁离子 25
mmol·L - 1 ) 2μL, 1μL FAD2F1 (10μmol·L - 1 ) , 1
μL FAD2R1 ( 10μmol·L - 1 ) , 10 mmol ·L - 1 dNTP
0. 6μL, Taq聚合酶 0. 5μL。扩增条件 : 94 ℃预变
性 5 m in, 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 35个
循环 ; 72 ℃延伸 7 m in。
扩增产物用 1%琼脂糖凝胶检测 ,回收 ,并连接
到 pGEM T2easy载体 ,得到克隆载体 pGEMTfad2,转
化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,涂板 ,挑选阳性克隆
测序。
1. 2. 3 反义表达载体的构建与转化 根据测序结
果选取大小 452 bp的基因片段 (AY957394)进行转
化检测。设计带 Sac I和 BamH I酶切位点的引物 :
N8FAD22Sac IF: 5’2CGC TGA GCT CCG TCG CCA
TCA TTC TAA CAC23’; N8FAD22BamH IR: 5’2CTA
TGG ATC CCC CCT AAG CCA GTC CCA TTC23’。
以 pGEMTfad2为模板进行 PCR,回收 450 bp左右片
段和表达载体 pB I121均用 Sac I和 BamH I双酶切 ,
连接并转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,碱法提取
质粒 DNA,酶切鉴定插入片段大小。构建的植物表
达载体命名为 pB I121 fad2。采用电击法将质粒转化
根癌农杆菌 ( A grobacterium tum efaciens ( Sm ith et
Townsend) Conn ) 感受态细胞 LB4404, 电激仪为
Electroporator 2510,在 2 500 V电压下 (电阻 200Ω )
进行转化 ,电激时间为 3～4 s。具体操作方法在参
考文献 [ 12 ]基础上作了部分修改。
1. 2. 4 根癌农杆菌介导的遗传转化和转基因烟草
的再生 参照文献 [ 13 ] ,将所构建的植物表达载体
pB I121 fad2和空载体 pB I121通过根癌农杆菌介导
导入烟草叶片中 ,并经抗卡那霉素和氨苄青霉素双
7
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
重筛选 ,获得抗性再生烟草植株 ,同时将未转化的烟
草再生植株作为对照。将抗性再生烟草和对照再生
烟草移植温室内 ,正常培养 ,观察其生长状况。
1. 2. 5 转化再生烟草的初步检测 转基因烟草和
对照烟草 DNA提取采取 CTAB法。 PCR鉴定采取
目的基因片段和表达载体 pB I121上 NPTII片段双
重检测。 fad2 基因片段 PCR 检测的引物采用
N8FAD22Sac IF和 N8FAD22BamH IR。NPTII基因引
物由北京赛百盛公司提供。目的基因片段和表达载
体 pB I121上 NPTII片段 PCR检测反应体系均为 25
μL,条件为 : 94 ℃ 5 m in, 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72
℃1 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 m in。
1. 2. 6 烟草种子脂肪酸含量分析 转基因烟草
和对照烟草植株种子按单株收集 ,提取脂肪酸 ,
利用 GC2M S法分别测定脂肪酸含量和成分。
2　结果与分析
2. 1 fad2 cDNA特异性片断的 RT2PCR扩增
用兼并性引物扩增的 PCR产物经 1%的琼脂糖
凝胶电泳检测 ,得到 1条特异性 cDNA ,长度约 450
bp (图 1、2)。序列测序长度为 452 bp。在 GenBank
中进行同源性比较 ,克隆得到的中间锦鸡儿核酸序
列与大豆 fad22a (AB188252)、fad222 ( SOYMO6DA )
的同源性分别高达 88%和 87% ;其氨基酸序列与大
豆、马铃薯、芝麻等的同源性约 80% ～86%。将该
克隆片段在 GenBank 中进行注册 , 获得注册号
为 AY957393。
图 1　中间锦鸡儿 fad2基因片段和大豆 fad22a、fad222序列同源性比较
1: 1 kb DNA分子标记 ; 2～6: PCR结果
图 2　fad2基因 cDNA片段 PCR扩增
2. 2　中间锦鸡儿 fad2基因反义表达载体的构建与
转化烟草
对 pB I121fad2载体扩增出的目的产物及 Sac I
和 BamH I双酶切后的产物用 1%琼脂糖胶电泳
分离 ,结果见图 3,显示均有约 450bp片段 ,说明所克
1: 1 kb DNA 分子标记 ; 2: pB I121fad2载体酶切结果
图 3　pB I121fad2载体 BamH I和 Sac I双酶切
隆的 fad2基因片段已经插入表达载体质粒 pB I121
中。Sac I和 BamH I双酶切后连接 , fad2基因的插入
方向是反向。
2. 3　转化烟草的检测和分析
经过 fad2基因片段和载体 pB I121上 NPTII联
合 PCR检测 (图 4) ,结果成阳性的初步确定为阳性
转基因烟草植株 ,获得 44株。转基因烟草与对照烟
8
第 1期 汪阳东等 :中间锦鸡儿 fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究
草在生长、表型和开花结实方面都无明显差异。种
子脂肪酸初步测定分析 ,与对照烟草相比 ,转基因烟
草的脂肪酸含量没有明显变化 ,其中 32株转基因烟
草多不饱和脂肪酸降低 ,亚油酸平均减少 10. 3%。
1: NPTⅡ基因 PCR检测 ;
2: 1 kb DNA分子标记 ; 3: fad2基因 PCR检测
图 4　转 fad2基因烟草 PCR检测
3　讨论
fad2基因已经从大豆、花生、芝麻等很多草本植
物中克隆得到 ,但从木本植物中克隆并进行反义表
达鲜见报道。植物去饱和脂肪酸酶是一个很大的家
族 ,具有比较高的保守性 ,但在不同植物中克隆的基
因核酸序列和数量都不一样 , fad2 基因也不例
外 [ 7, 8 ]。中间锦鸡儿 fad2基因在烟草中的反义表
达 ,初步分析结果表明转基因烟草种子中多不饱和
脂肪酸含量下降。这为进行下一步锦鸡儿类 (Cara2
gana spp. )植物分子改良 ,获得高含量单不饱和脂
肪酸的优质中间锦鸡儿新品种以及改造其它木本生
物柴油用原料植物奠定了基础。此外 ,该基因在植
物中的作用部位 ,与其它不饱和脂肪酸合成酶基因
之间的相互关系 ,外界温度和光照等环境条件对基
因表达的影响等问题仍需要进一步研究。本研究中
获得转基因烟草还需要进行观测和分析 ,以确定所
导入的 fad2基因的稳定性和表达情况。
参考文献 :
[ 1 ] 阿拉塔 ,赵书元 ,李敬忠. 三种锦鸡儿生物学特性及栽培利用的
研究 [ J ]. 内蒙古畜牧科学 , 1997 (4) : 8～11
[ 2 ] 贾丽 ,曲式曾. 豆科锦鸡儿属植物研究进展 [ J ]. 植物研究 , 2001,
21 (4) : 515～518
[ 3 ] Harrington K J. Chem ical and physical p roperties of vegetable oil es2
ters and their effect on diesel fuel performance [ J ]. B iomass, 1986
(9) : 1～17
[ 4 ] Okuley J, L ightner J, Feldmann K, et a l. A rabidop sis FAD2 gene en2
codes the enzyme that is essential for polyunsaturated lip id synthesis
[ J ]. Plant Cell, 1994, 6 (1) : 147～158
[ 5 ] Marillia E F, Taylor D. Cloning and nucleotide sequencing of a cD2
NA encoding a B rassica carinata FAD2 (Accession No. AF124360)
[ J ]. Plant Physiology, 1999, 120 (1) : 339
[ 6 ] H itzW D, Yadav N S, Relter R S, et al. Reducing polyunsaturation
in oils of transgenic canola and soybean[A ]. In: Kader J C, Mazliak
P. Plant L ip id Metabolism [ C ]. W ilm ington: Kluwer Academ ic Pub2
lishers, 1995: 506～508
[ 7 ] 张羽航 ,林炜铁 ,姚汝华 ,等. 植物油脂基因工程 [ J ]. 中国油脂 ,
1999, 24 (5) : 56～58
[ 8 ] 卢善发. 植物脂肪酸的生物合成与基因工程 [ J ]. 植物学通报 ,
2000, 17 (6) : 481～491
[ 9 ] Sayanova O, Sm ith M A, Lap inskas P, et a l. Exp ression of borage
desaturase cDNA containing an N2term inal cytochrome b5 domain re2
sults in accumulation of high levels of △62desaturated fatty acids in
transgenic tobacco [ J ]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 ( 8 ) :
4211～4216
[ 10 ] Yukawa Y, Takaiwa F, Shojik K, et al. Structure and exp ression of
two seed2specific cDNA encoding stearoyl2acylcarrier p rotein desat2
urase from sesame, Sesam um indicum [ J ]. Plant Cell Physiol,
1996, 37 (2) : 201～205
[ 11 ] Chung C H, Kim J L, Lee Y C, et a l. Cloning and characterization
of a seed2specificω23 fatty acid desaturase cDNA from Perilla fru2
tescens[ J ]. Plant Cell Physiol, 1999, 40 (1) : 114～118
[ 12 ] 萨姆布鲁克 J,氟里奇 E F,曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南
(第二版 ) [M ]. 金冬雁 ,黎盂枫 ,侯云德译. 北京 :科学出版
社 , 1996
[ 13 ] Zabarovsky E R,W inberg G. H igh efficiency electroporation of liga2
ted DNA into bacteria[ J ]. Nucl Acids Res, 1990, 18: 5912～5919
9