全 文 :林业科学研究 2006, 19( 3): 311~ 315
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2006) 03031105
侧柏挥发油成分及抗肿瘤活性的研究
蒋继宏1, 李晓储 1, 2, 高雪芹 1, 高甜惠 1, 陈凤美 1, 冯友建1, 黄利斌2
( 1. 徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏 徐州 221000; 2.江苏省林业科学研究院 江苏 南京 211153)
摘要: 用 A lam ar b lue法对提取的侧柏叶、种皮及种子挥发油进行了抗人肺癌细胞实验,结果表明侧柏叶、种皮和种
子挥发油对肺癌细胞 NCIH 460有明显抑制率,分别为 86. 24%、47. 80%和 97. 73%。其中以叶挥发油和种子挥发
油最高。采用气质联用法对侧柏叶、种皮和种子挥发油的化学成分进行了研究, 其含有的挥发物质种类侧柏叶、种
皮和种子分别为 8, 31和 21个成分,其挥发油成分也不尽相同, 侧柏叶含量最高的是 , , 4, 8四甲基3, 7环癸二
烯1甲醇和雪松醇分别占总挥发油的 27. 213%和 26. 193% , 种皮和种子挥发油中含量最高的都是雪松醇, 分别占
总挥发油的 28. 277%和 26. 919%。其中, 对侧柏叶挥发油 4 低温下重结晶得到的雪松醇进行了鉴定, 纯度达
9706% , 对雪松醇抗人肺癌细胞实验结果是雪松醇对人肺癌细胞 NCIH 460半致死浓度为 44. 98 g mL - 1。
关键词: 侧柏;挥发油; 雪松醇;抗肿瘤活性
中图分类号: S791 38 R965 文献标识码: A
收稿日期: 20051012
基金项目: 国家 !十五 ∀科技攻关重大专项课题 !中国城市森林网络体系#点 ∃的研究与示范 ∀ ( 2001BA516A1507)和国家林业局科技项
目!城镇绿化乔木树及生态功能性树种区试 ∀ ( 200217A )协作研究内容之一。江苏省药用植物生物技术重点实验室开放课题 (编号
( 02AXL12 )研究内容
作者简介: 蒋继宏 ( 1962 % ) ,男,汉族,安徽滁州人,副教授,博士,主要从事药用植物生物技术方面的研究.
Volatile Constituents from Platycladus orentalis and
Their Antitum or Activities
JIANG J ihong1, LI X iaochu1, 2, GAO Xueqin1, GAO T ianhui1,
CHEN Fengm ei1, FENG Youjian1, HUANG L ibin2
( 1Key Laboratory for B iotechnology onM ed icina lP lan ts of Jiangsu P rovince, XuzhouN orm alU nivers ity, Xuzhou 221116, Jiangsu, Ch ina;
2 JiangsuA cadem y of Forestry, N an jing 211153, J iangsu, Ch ina)
Abstract: The antitum or activit ies of volatile constituents from P latycladus orentalis against hum an lung cancer cell line
NC IH460 were determ ined by a lam ar blue assay. The results show ed that the inhib iting rates of volatile constituents from
the leaves, seed and seed capsule ofP. orentalis aga inst hum an lung cancer cell lineNCIH460 w ere 86. 24% , 97. 73%
and 47. 80% respectively. And the volatile o il constituents in leaves and seed w ere the highest. The volatile constituents
from the three organsw ere ana lyzed by GCM Smethod. The varieties of vo latile oil in the lea,f seed and seed capsule ofP.
orentalis w ere 8, 31 and 21 respect ively. The results showed that the leaves contained the h ighest contents of , , 4, 8tet
ram ethy 13, 7cyclodecadiene1m ethjanol and cedro,l wh ich took about 27213% and 26193% respectively. The con
tents of cedro l in seed and seed capsule were the h ighest, which were 28277% and 26919% of the tota.l The purity of ce
drol recrystallized under 4 from leaves ofP. orentaliswas as high as 9706% . The IC50 of cedrol aga inst the lung canc
er cell lineNCIH460 w as 4498 g mL- 1.
K ey words:P la ty cladus orentalis; volat ile const ituents; cedro ;l antitumor activ ities
林 业 科 学 研 究 第 19卷
随着我国国民经济的迅速发展, 城市化与现代
化的推进,人们对环境保健的意识的日益增强,构建
城市森林,发挥绿化植被的生态保健功能, 改善人居
生态环境,提高市民生活质量已成为广大市民的迫
切需求 [ 1, 2]。因此,积极选用具有分泌挥发性物质植
物,构建生态保健型绿化模式, 对改善城市空气质
量,保障市民身心健康具有非常重要的意义 [ 3~ 5]。
许多植物都可产生挥发性物质, 挥发物不是均
一的化合物, 它是由多种成分组成的混合物, 植物
产生的挥发物可能含有几十种乃至几百种化学成
分 [ 6]。挥发物中有许多成分具有较强的生理活性。
对人体健康而言, 其中有些有益, 而有些有害。随
着人们环境意识的增强以及对身心健康的日益重
视, 关于挥发物与人体健康之间的关系越来越受到
人们的关注,郑华等 [ 7]对活体珍珠梅 ( Sorbaria k iril
ow ii ( Rege l) M ax im. )释放的季节性及其对人体脑
波影响进行了研究, 但挥发物中一些成分到底有哪
些生理活性, 对人体健康究竟有哪些影响等, 也很
少报道。据研究,植物能散发多种含有杀菌素、抗生
素等化学物质的气体,这些物质通过肺部及皮肤进
入人体,能够抑制和杀死病原细菌和病毒, 起到防病
强身的作用 [ 6, 7]。特别松柏类植物枝叶散发的气体
对结核病等有防治作用 [ 6~ 8]。侧柏 ( P latycladus
orentalis ( L. ) Franco)为柏科 ( Cupressaceae)侧柏属
(P latycladu s Spach) , 中国特有树种, 是城市绿化尤
其是北方城市常用树种之一。侧柏耐干旱瘠薄, 抗
逆性强, 又是干旱山区主要造林树种。据报道, 侧
柏叶气清香,味苦涩、微辛, 具有凉血止血、清肺止咳
功效, 在临床上常用于治疗出血症、风湿痹痛、高血
压、咳喘等。侧柏挥发油中的雪松醇含量很高,雪松
醇是倍半萜类化合物, 是木香型、檀香型等香精的
重要组分,并且是一种良好的定香剂,雪松醇的一些
衍生物也是重要的香料 [ 8~ 11]。但其抗肿瘤活性未
见报道。因此, 作者在研究扬州古运河生态环境林
生态保健型绿化模式时,选择侧柏, 对其挥发物质及
抗肿瘤活性进行了研究,以便为城市森林生态保健
型绿化模式树种选择及配置提供科学的依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
侧柏叶、种皮和种子, 2005年 8月采自江苏徐
州市, 阴干粉碎, 备用。NC IH460(人肺癌 )细胞株
购于 ATCC公司; RPM I1640培养基购自 G ib ico公
司;青霉素, 链霉素, 胎牛血清, 胰蛋白酶, DM SO购
自上海生工公司; A lamar blue购自 S igm a公司, 96孔
细胞培养板。
1. 2 仪器
RE52A型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂 );
6890/5973NGC /M S联用仪 (美国安捷伦公司 )。
1. 3 方法
1. 3. 1 抗肿瘤活性测定
细胞培养: NCIH460培养用 RPM I1640培养基,
含 100 mL- 1青霉素和 100 g mL- 1链霉素及
10%已灭活的胎牛血清, pH 值 7. 2, 在 37 , 5%
CO2培养箱中培养。
制备待测液: 称取提取物用 DMSO或丙二醇溶
解,制成浓度为 10mg mL- 1的储备液, 0. 22 m过
滤除菌后放在 4 条件下待用。
细胞接种:将处于对数生长期的细胞用 0. 25%
胰酶从培养瓶上消化下来, 1 000 r m in- 1, 5m in, 用
细胞计数板计数, 制成 2 & 104个 mL- 1的细胞悬
液。96孔板中每孔加 100 L, 对照孔加 100 L不
含细胞的培养基, 放入细胞培养箱中过夜,使细胞贴
壁。
加样:每孔补加培养基 80 L,将待测液用培养
基稀释 10倍后每孔加 20 L, 待测液最终浓度为
100 g mL- 1, 继续培养 24 h。
采用 A lam ar blue方法 [ 15, 16] : A lamar b lue贮存液
用培养基以 1∋1比例稀释,每孔加 50 L,每孔终体
积为 250 L, A lam ar blue为 10%, 5 h后用 M2荧光
检测仪检测。将培养板放于 530 nm的激发波长和
590 nm的发射波长下,加入不含细胞的培养基的孔
做空白值,加细胞液不加样品的孔做对照值。细胞
培养孔的值减去空白值为实际值。按照公式计算细
胞存活率: 细胞存活率 = (对照 - 样品 ) /对照 &
100%。
1. 3. 2 挥发油的提取和 GCMS分析
样品制备:取 100 g阴干的侧柏叶、种皮和种子
粉末置于 1 000 mL圆底烧瓶中, 加入 400mL去离
子水浸泡, 用水蒸汽蒸馏 6 h, 馏出液用乙醚连续萃
取 3次, 侧柏叶挥发性化学成分的乙醚萃取液用旋
转蒸发器除去乙醚, 得到黄色透明液体, 用无水硫
酸钠干燥, 称质量。保存于低温冰箱中, 供 GCMS
分析使用。
雪松醇的制备和鉴定: 对得到的侧柏挥发油置
于冰箱 4 低温下,重结晶得到雪松醇,用气质谱联
312
第 3期 蒋继宏等: 侧柏挥发油成分及抗肿瘤活性的研究
用仪鉴定。
气相色谱条件: 6890型气相色谱仪 (美国安捷
伦公司 ) , HP5M S弹性石英毛细管柱 ( 30 m & 0. 25
mm & 0. 25 m ),载气为高纯氦气,柱流量 60 mL
m in
- 1
,气化室温度: 280 ,毛细管柱程序升温从 70
开始,保持 2m in,以 10 m in- 1的速度升到 255
并保持 25m in,再以每分钟 10 的速度升到 270
并保持 5m in。
质谱条件: 5973N型质谱仪 (美国安捷伦公司
Ag ilent), E I离子源 (电子轰击源 ) , 电离电压为 70
eV,离子源温度为 230 , 相对分子质量扫描范围
30~ 550 AMU,进样量 1. 0 L,分流比 50∋1,扫描周
期 1 s。
2 结果与分析
2. 1 侧柏挥发油的抗肿瘤活性
抗肿瘤活性鉴定表明, 100 g mL- 1侧柏叶、
种皮和种子挥发油对肺癌细胞 NC IH460抑制率分
别为 86. 24%、47. 80%和 97. 73%。其中以叶挥发
油和种子挥发油为高。
2. 2 侧柏挥发油的化学成分及比较
测定结果表明,侧柏叶、种皮和种子挥发油的提
取率分别为 1. 75%, 2. 03%和 0. 24% , 种皮挥发油
的提取率最高。经 GCMS对 3种挥发油的化学成
分进行分析, 得到其总离子流图 (略 ) , 侧柏叶、种皮
和种子挥发油分别检测出 8, 31和 21个成分, 对总
离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图,经计
算机质谱数据库检索按各色谱峰的质谱裂片图并结
合有关文献 [ 8, 10, 12, 13]。对基峰质荷比、相对丰度和
保留时间等进行直观比较, 分别对各色谱峰加以确
认,鉴定侧柏植物挥发油组分中的化学成分,按面积
归一化法确定各组分相对含量, 分析比较结果见表
1。从表 1可看出侧柏中含有多种挥发成分, 侧柏
叶、种皮和种子挥发油成分也不尽相同, 侧柏叶含量
最高的是 , , 4, 8四甲基3, 7环癸二烯1甲醇和
雪松醇分别占总挥发油的 27. 213%和 26. 193%, 种
皮和种子挥发油中含量最高的都是雪松醇,分别占
总挥发油的 28. 277%和 26. 919%。
表 1 侧柏种子、种皮和叶的挥发油成分相对百分含量比较
保留时
间 /m in 化 学 成分 分子式
相对百分含量 /%
种子 种皮 叶
3. 586 蒎烯 ( 1R) Pin ene C10H 16 4. 107 0. 681
3. 867 苯甲醛 B enzaldehyde C7H6O 2. 020
3. 992 4( 10 ) 苧烯 4( 10) Thu jene C10H 16 2. 863
4. 116 月桂烯 M yrcen e C10H 16 1. 700
4. 419 3蒈烯 3C arene C10H 16 0. 844
4. 632 D柠檬烯 ( 1, 8萜二烯 ) DL imon ene C10H 16 4. 231
5. 113 2甲基 5异丙基二环 [ 3. 1. 0]己烷 2醇 5isop ropyl2m ethylb icyclo[ 3. 1. 0] h exan2ol C10H18O 0. 803
5. 386 1, 4( 8 ) 萜二烯 pm entha1, 4( 8 )d iene C10H 16 0. 893
5. 830 反 2萜烯 1醇 transpm en th2en1ol C10H18O 0. 648
5. 895 龙脑烯醛 C ampholenal C10H16O 1. 354
6. 067 顺 2萜烯 1醇 cispm enth2en1ol C10H18O 0. 422
6. 109 反 松香芹醇 transP inocarveol C10H16O 1. 914
6. 150 ( S) 马鞭草烯醇 ( 蒎烯 4醇 ) ( S ) Verbenol C10H16O 7. 581
6. 601 ( R) 1萜烯 4醇 ( R) pm enth1en4ol C10H18O 3. 988 16. 354
6. 601 , , 4三甲基 苯甲醇 , , 4trim ethylBenzenem eth anol C10H14O 4. 634
6. 761 ( S) 1萜烯 8醇 ( S) pm en th1en8ol C10H18O 0. 588 5. 308
7. 045 ( S) 马鞭草烯酮 ( 蒎烯 4酮 ) ( S ) Verbenone C10H14O 5. 224
8. 039 乙酸冰片酯 ( 1S, 2R, 4S )B orn eol acetate C12H20O 2 5. 680 3. 173
8. 712 1萜烯 8醇 乙酸酯 pm en th1en8ol acetate C12H20O 2 5. 843
9. 465 榄香烯 E lem ene C15H 24 1. 422
9. 826 8( 15 ) 雪松烯 8( 15) Ced rene C15H 24 2. 827
9. 897 石竹烯 C aryophyllene C15H 24 6. 534
10. 052 罗汉柏烯 Thu jopsene C15H 24 1. 931
10. 324 葎草烯 H umu lene C15H 24 5. 098
10. 526 2, 6, 6, 9四甲基 二环 [ 5. 4. 0]十一碳 1, 8二烯 2, 6, 6, 9tet ram ethylb icyclo[ 5. 4. 0]
undecan1, 8d ien e
C15H 24 0. 300
313
林 业 科 学 研 究 第 19卷
续表
保留时
间 /m in 化 学 成分 分子式
相对百分含量 /%
种子 种皮 叶
10. 650 荜澄茄烯 Cub ebene C15H 24 3. 115
10. 805 !榄香烯 !E lem ene C15H 24 1. 198
11. 424 , , 4, 8四甲基 3, 7环癸二烯 1甲醇 , , 4, 8tetram ethy l3, 7cyclodecad ien e1
m ethano l
C15H26O 3. 409
27. 213
11. 421 榄香醇 E lem ol C15H26O 9. 754
11. 916 环氧化 石竹烯 Caryophy llen e epox ide C15H24O 3. 027 0. 657
11. 973 4, 7, 11, 11四甲基 二环 [ 5. 4. 0]十一碳 1烯 4醇 4, 7, 11, 11tetram ethy lb icyclo[ 5.
4. 0] und ecan1en4o l
C15H26O 0. 486
12. 032 2, 6, 8, 8四甲基 三环 [ 5. 2. 2. 0( 1, 6 ) ]十一碳 2醇 2, 6, 8, 8tetram ethy ltricyclo[ 5. 2.
2. 0( 1, 6 ) ] undecan2ol
C15H26O 2. 045 3. 184
12. 168 雪松醇 C edrol C15H26O 26. 919 28. 277 26. 193
12. 221 1, 5, 5, 8四甲基 12氧杂二环 [ 9. 1. 0]十二3, 7二烯 1, 5, 5, 8tetram ethy l12oxab icy
clo[ 9. 1. 0 ] dodeca3, 7d iene
C15H24O 2. 004
12. 441 杜松 1, 4二烯 Cad ina1, 4d ien e C15H 24 3. 942
12. 444 !桉叶油醇 !Eud esm ol C15H26O 2. 574 2. 073
12. 488 6, 6, 9三甲基2亚甲基 二环 [ 5. 4. 0]十一碳 8烯 2m ethylene6, 6, 9trim ethylb icyclo
[ 5. 4. 0 ] undecan8ene
C
15
H
24
0. 875
12. 684 杜松醇 C ad inol C15H26O 6. 104
12. 690 桉叶油醇 Eud esm ol C15H26O 1. 669 11. 275
13. 959 雪松醇乙酸酯 C edryl acetate C17H28O 2 0. 666
14. 119 , , 6, 8四甲基 三环 [ 4. 4. 0. 0 ( 2, 7 ) ]癸 8烯 3甲醇 , , 6, 8tetram ethyltricyclo
[ 4. 4. 0. 0 ( 2, 7) ] d ec8ene3m ethanol
C15H24O 2. 035
14. 119 顺 1氯 1, 2二甲基硅环己烷 cis1ch loro1, 2d im ethy ls ilacyclohexane C7H15C lS i 5. 472
14. 469 桉叶油醇 Eud esm ol C15H26O 4. 243
14. 504 对甲苯甲酸 2乙基己酯 2ethy lhexyl 4m ethy lbenzoate C16H24O 2 2. 807
17. 617 硬尾醇 S clareo l C20H36O 2 1. 422
17. 682 海松 7, 15二烯 3酮 P im ara7, 15d ien3one C20H30O 6. 042
17. 961 海松 7, 15二烯 3醇 P im ara7, 15d ien3ol C20H32O 9. 564
18. 145 海松 8 ( 14) , 15二烯 18醛 P im ara8 ( 14) , 15d ien18al C20H30O 1. 518
19. 182 14异丙基罗汉松8, 11, 13三烯 13醇 14isop ropylpodocarpa8, 11, 13trien13ol C20H30O 1. 270
2. 3 侧柏挥发油中雪松醇的分离鉴定
由侧柏挥发油中分离纯化出雪松醇, 进行气质
谱鉴定,其结果表明, 侧柏挥发油中分离纯化的雪松
醇纯度很高,分离纯化的雪松醇含量高达 97. 06%。
2. 4 侧柏挥发油中雪松醇的抗肿瘤活性测定及分析
对分离纯化鉴定的雪松醇进行抗肿瘤活性鉴
定,结果见表 2。从表 2看可计算出 IC50 = 44. 98 g
mL- 1,即 44. 98 g mL- 1的雪松醇能抑制 50%
的 NC IH460(人肺癌 )细胞死亡。当雪松醇含量达
50 g mL- 1时, 60. 83%的肺癌细胞受抑制。表明
雪松醇有较强的抗肺癌细胞活性。但这似乎和前面
的抗肿瘤活性结果相矛盾, 侧柏叶、种皮和种子挥发
油成分中雪松醇含量依次为 26. 193%、28277%和
26. 919% ,但抗肿瘤活性却依次为 8624%、47. 80%
和 97. 73%, 分析其原因可能是侧柏叶和种子挥发
油成分中还有其它成分具有较高的抗肿瘤活性或和
雪松醇具有协同抗肿瘤活性。
表 2 不同浓度雪松醇对 NCIH460
(肺癌 )细胞的抑制率
雪松醇 / ( g mL- 1 ) 抑制率 /% 标准偏差
20 10. 92 0. 057
30 18. 06 0. 059
40 41. 21 0. 08
50 60. 83 0. 009
60 62. 69 0. 046
3 结论与讨论
( 1)研究结果表明, 用 A lamar blue法提取的侧
314
第 3期 蒋继宏等: 侧柏挥发油成分及抗肿瘤活性的研究
柏叶、种皮及种子挥发油对肺癌细胞 NC IH460有明
显抑制率。叶为 86. 24% ,种子为 97. 73% , 种皮为
47. 8%。
( 2)对侧柏供试叶、种子挥发油化学成分测定
表明, 叶为 8个成分, 种皮 31个成分, 种子 21个成
分。侧柏叶含量最高的是 2, 2四甲基 3, 7环癸二
烯 1甲醇和雪松醇, 分别占总挥发油含量的 27% ,
21. 3%和 26. 19%。种皮和种子挥发油含量最高的
都是雪松醇, 分别占总挥发物油的 28. 28% 和
2692%。但仅从 3种材料挥发油雪松醇含量来看,
种子含量最低,但其对肺癌细胞 NC IH460的抑制率
最高, 这有可能是种子挥发油中的其它成分对雪松
醇抗肺癌细胞有增效作用, 也可能种皮挥发油中的
其它成分对雪松醇抗肺癌细胞有减效作用。
( 3)采用 4 下重结晶提取的雪松醇纯度达
97. 66% , 进行抗人肺癌细胞试验对肺癌细胞 NC I
H460半致死浓度为 44. 98 g mL- 1。研究结果为
城市森林建设选择侧柏作为生态保健树种提供了科
学依据。至于雪松醇对人体细胞健康的其它影响,
以及抑制肺癌细胞的机理及生物治疗效果尚待继续
测定研究和进行临床试验验证。
( 4)作者采用普通水蒸气蒸馏, 溶剂萃取法提
取挥发油, 收率相对较低, 收率的高低与实验条件
和操作方法有关。而且有可能化合物组分减少了很
多。侧柏挥发油中雪松醇含量很高。雪松醇是倍半
萜类化合物, 是木香型、檀香型等香精的重要组分,
并且是一种良好的定香剂, 雪松醇的一些衍生物也
是重要的香料 [ 6 ]。对侧柏叶、种皮及种子的挥发油
化学成分和相对百分含量的分析及评价, 将对开发
及综合利用山区的侧柏叶资源提供科学依据。
( 5) 蒎烯、 蒎烯都有较强的抗炎作用, 祛痰、
抗真菌 [ 5, 17] ,广东的名牌药三九胃泰就是以其为主
要成分。柠檬烯镇咳、祛痰、抗菌、对肺炎双球菌、甲
型链球菌、卡他双球菌、金黄色葡萄球菌有很强的抑
制作用 [ 6]。很多植物都含有 桉叶油醇, 桉叶油
醇挥发油的主要有效成分之一, 具有解热、抗菌、消
炎作用,其水合物用作祛痰镇咳药 [ 6]。侧柏也含有
桉叶油醇、蒎烯和 石竹烯, 因此, 侧柏可作为
城市森林建设的优良生态保健树种。
( 6)目前, 作者对侧柏挥发油的抗肿瘤研究只
在细胞水平上,还需作动物实验, 查明抑癌物质,才
能进一步用于人体进行医学实验。
参考文献:
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