全 文 ：林业科学研究 2007, 20( 2): 204~ 208
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2007) 02020405
马鞍山林场松墨天牛病原微生物种类
调查鉴定及毒力测定研究
韩 兵 1, 朴春根 2, 汪来发2* , 李 永 2, 申相澈 3, 郑荣镇 3
( 1.安徽省马鞍山市马鞍山林场,安徽 马鞍山 243031; 2中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,
国家林业局森林保护学重点实验室,北京 100091; 3.韩国国立山林科学院,韩国 首尔 130712)
摘要: 在马鞍山市马鞍山林场, 对松材线虫病 ( Bursaphelenchus xy loph ilus )的传媒昆虫松墨天牛 (M onochamu s al
ternatus )的病原微生物进行调查 , 结果鉴定了 8种真菌和 1种细菌。对松墨天牛幼虫的致病率测定显示不同
的微生物种类和同一种白僵菌 (B eauveria bassiana )的不同菌株均有显著差异。白僵菌的高毒力菌株营养生长
无明显差异 , 而产孢量有明显差异。通过测定 , 白僵菌菌株 226可能是优良菌株 , 对生物防治松黑天牛方面有
潜在的实用价值。
关键词: 球孢白僵菌; 松墨天牛; 生物防治
中图分类号: S763 文献标识码: A
收稿日期: 20061228
基金项目: 国家科技部社会公益研究专项 ( 2005DIB3 J139)及中韩林业科研合作课题联合资助
作者简介: 韩兵 ( 1967 ) ,男,安徽无为人,工程师,从事松材线虫病的管理和研究;朴春根 ( 1963 ) ,男,吉林汪清人,博士,副研究员,
从事林业微生物资源工作。韩兵和朴春根均为第一作者.
* 通讯作者: 汪来发,男,安徽望江人,博士,研究员,从事森林病理学和植物线虫学研究. Em ai:l n em a@ forestry. ac. cn
Survey, Indentification and V irulence Test of Pathogens of the P ine Sawyer Beetle,
Monochamus alternatus, at Forest Farm ofMaanshan, Anhui Province
HAN B ing
1
, PIAO Chungen2, WANG Laif a2, LI Yong 2, SH IN X iangche3, ZHENG R ongzhen3
( 1. Forest Farm ofM aanshan, M aanshan C ity, M aanshan 243031, Anhu ,i Ch ina; 2. Research In stitute of Forest
Eco logy, Environm ent and Protect ion , CAF, K ey Laboratory of Fores t Protection, S tate Forestry Adm in istration, B eijing 100091, Ch ina;
3. Korea Fores tReserch Inst itu ,t S eou l 130712, Konea)
Abstract: A survey of pathogens o fM onochamus alterna tus, a vector o fBursaphelenchus xy loph ilus, w as con
ducted at Forest Fa rm ofM aanshan, Anhu i Prov ince. E igh t entomogenous fung i and one bacterium w ere ident i
fied from M onochamu s alterna tu s in pine forests. O f these species, B eauveria bassiana was the m ost common
spec ies. There w as substant ia l variab ility in v iru lence among the stra ins of the sam e spec iesB. bassian and the
different species. The stra ins o fB. bassiana w ere tested on v iru lence toM. alternatu s, co lony g row th and spo
rogenous ability. These resu lts suggested stra in 226 m ight be a effect ive agent for con tro ling o fM . alterna tus.
Key words:B eauveria bassiana; M onochamus alternatus; biological contro l
由松材线虫 Bursaphelenchu s xy loph ilus ( Ster
ner e t Buhrer) N ick le!引起的松材线虫病是我国
松林最严重的森林病害, 目前尚无经济有效的防
治方法。松墨天牛 (M onochamus a lternatus H ope)
是松材线虫病的媒介昆虫, 分布在我国 20省、
市, 因此控制松墨天牛对于防治松材线虫病有着
第 2期 韩 兵等:马鞍山林场松墨天牛病原微生物种类调查鉴定及毒力测定研究
重要的意义。目前降低松墨天牛种群密度的方
法是综合措施的应用, 如清理病死木、化学防治
和生物防治。与此同时, 在自然界一些传染病引
起不同时期的松墨天牛死亡, 这也是松墨天牛种
群密度变化的重要因子。对松材线虫病的传媒
昆虫松墨天牛进行生物防治, 有效地降低种群密
度是控制松材线虫病的途径之一 [ 1, 2]。在自然
界, 经常观察到松墨天牛特别是幼龄阶段的天牛
被微生物感染致死的现象 [ 3 ]。在我国, 对松墨天
牛的病原微生物有过一些调查 [ 4, 5 ] , 但主要是作
面上的调查,对重点地区尚未作系统深入的调查
研究。安徽省马鞍山林场的松林早在 1988年就
发现了松材线虫病 [ 6 ] , 但目前该林场的松材线虫
病仍没有得到有效控制。为了更好地挖掘本地
的松墨天牛天敌微生物资源, 并有目的地进行应
用, 分别于 2001年 3 6月和 2006年 5 10月在
马鞍山林场感染松材线虫病的林分中对松墨天
牛病原微生物进行了调查鉴定, 并对部分菌株对
松墨天牛幼虫的致病率进行了测定, 现将结果报
道如下。
1 材料与方法
1. 1 样本来源
2001年 3 6月和 2006年 5 10月从马鞍
山林场松材线虫病区不同松林内选取松材线虫
病病死松木做样本, 解剖检查松墨天牛幼虫 , 利
用诱捕器诱捕松墨天牛成虫, 统计和收集体躯僵
硬, 体表覆盖菌丝的幼虫、成虫。对采集的松墨
天牛活幼虫分别保存在一灭菌的指形管中, 用脱
脂棉团封口。在 25 ∀ 培养, 直到有些虫体体表
长出菌丝 ,以供分离用。
1. 2 病原菌分离
真菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基
( PDA )、细菌培养基为含 1%酵母浸膏肉汁冻培养
基,经分离、纯化培养, 鉴定每分离菌株。所有菌株
均经过培养、纯化,保存在冰箱内。
1. 3 病原菌鉴定
分离的病原微生物根据真菌形态和细菌形态和
生理生化反应而鉴定 [ 7~ 10 ]。
1. 4 供试松墨天牛幼虫
由江苏省林业科学研究院研究人员在江苏省江
宁区东善桥林场采集松墨天牛幼虫, 以越冬 4龄幼
虫为供试材料,室内饲养 2 d, 剔除带机械损伤和行
为不正常个体,选择健康、大小基本一致的幼虫用于
生物测定试验。
1. 5 不同种类微生物对松墨天牛幼虫的致病率
测定
收集部分菌株孢子稀释至 1. 0 # 107个 ∃ mL- 1
浓度的孢子悬浮液, 以无菌水作对照。用微量注射
器无伤喷洒 50 L的孢子悬浮液接种在每头松墨天
牛体表上,每头松墨天牛经溶液处理后,放在 12 mm
# 75mm的指形管中, 一试管一头虫,管内装有松木
屑,用浸无菌水的脱脂棉封口, 分别置于 25 ∀ 环境
条件下饲养, 每处理 20头幼虫; 同时以等量无菌水
代替孢子悬浮液作为对照。逐天观察记录松墨天牛
颜色变化、死活和感染情况。
1. 6 部分白僵菌菌株营养生长量测定
在 PDA培养基上培养好各白僵菌菌株菌
落。把直径 10 mm球孢白僵菌菌块用接种针放在
置于 PDA平板的中央, 使平板的中央沾满孢子, 每
一菌株 10个培养皿, 即 10个重复, 最后置于 25 ∀
下培养,以后每天定时定点用游标卡尺量出各菌株
的纵横直径, 并作统计分析,比较各菌株营养生长的
速率。
1. 7 部分白僵菌菌株产孢量测定
部分白僵菌菌株在 PDA平板上, 25 ∀ 下培
养 2周。用打孔器在菌落中央到边缘的中点处,
取出一定面积的菌落, 置于 0. 1% 吐温 - 80的定
量无菌水中, 充分振荡 2 m in, 使孢子分散, 用血
球计数板测定孢子数量, 最后换算成每平方毫米
的孢子产量。
2 结果
2. 1 松墨天牛幼虫病原微生物的鉴定
经调查和室内分离培养,在自然状况下,马鞍山
林场松材线虫病疫区松墨天牛感染病原微生物的种
类有 9种,其中有 8种真菌和 1种细菌, 其形态和生
物学特性如下:
Beauveria bassiana ( Balsamo) Vuillem in球孢白
僵菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 菌落生长缓
慢,直径 0. 8~ 1. 2 cm ,菌落初期白色绒毛状, 后期
淡黄色粉末状。产孢细胞浓密簇生在膨大的柄细胞
上,近球形至烧瓶形,颈部延长形成粗 1 m,长达 25
m的产孢轴,轴上具小齿突, 反复向顶部合轴式产
孢。分生孢子无色透明, 光滑,绝大多数为球形, 直
205
林 业 科 学 研 究 第 20卷
径 2~ 3 m 。周性恒等 [ 5 ]发现该菌侵染松墨天牛
幼虫, 本项研究得以证实。
B. brongniartii ( Sacc. ) Petch布氏白僵菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 直径达到
0. 8~ 0. 9 cm, 菌落绒毛状至粉状, 白色, 后变为
淡黄色。产孢细胞单生, 产孢轴纤细, 长 25 m,
宽 1. 0~ 1. 5 m, 膝状弯曲, 具小齿突。分生孢
子无色透明 ,光滑, 椭圆形, 2. 5~ 4. 5 # 2. 0~ 2. 5
m。这个种与周性恒等 [ 5]报道的寄生在松墨天
牛的是同种。
Fusarium moniliform e She ldon串珠镰刀菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 菌落直径达
到 6. 0~ 6. 5 cm。气生菌丝体由稀疏逐渐变得丰富,
白色絮状菌落, 渐变为橘红色。分生孢子梗无分枝
或分枝成单个的管形状。小分生孢子丰富, 头状或
链状着生,无隔膜,卵形, 7. 1~ 11. 5 # 1. 5~ 2. 5 m。
大分生孢子通常都很丰富, 3~ 5个隔膜,微小的镰
刀形状, 24. 3 ~ 50. 0 # 2. 7 ~ 3. 8 m。无厚垣
孢子。
F. oxysp orum Sch leche.t emend. Snyd. & H ans.
尖孢镰刀菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 菌落生长
快,直径达到 7. 0 ~ 7. 5 cm。气生菌丝由少逐渐增
多,先为白色,后逐渐变为紫色或蓝色。产孢细胞瓶
梗状, 不分枝或分枝。小分生孢子丰富, 聚生成头
状,卵形、椭圆形和圆柱形,无隔, 5. 4~ 12. 0 # 2. 3~
3. 5 m。大分生孢子丰富, 镰刀形状, 3 ~ 5个隔,
27. 0 ~ 45. 0 # 3. 0 ~ 4. 5 m。厚垣孢子单生或
串生。
F. solani (M ar.t ) Sacc.茄镰刀菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 直径达到
5. 5~ 6. 0 cm, 菌落牛角灰至紫灰。产孢细胞瓶梗
状,不分枝或分枝。小分生孢子丰富,链状,无隔, 卵
形到圆柱形, 5. 4~ 12. 0 # 2. 3~ 3. 5 m。大分生孢
子丰富、坚实、稠密, 直或微弯, 2 ~ 5隔, 大部分 3
隔, 28. 0~ 42. 0 # 4. 0~ 4. 9 m 。厚垣孢子单生或
串生。这与樊 美珍等 [ 11] 报道的 从美国白 蛾
Hyphantria cunea ( Drury)!分离的种一致。
Paecilomyces farinosus( Ho lm. ex Gray) B rown&
Sm ith粉拟青霉
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 菌落生长速
度中等,直径为 1. 9~ 2. 8 cm, 白色或略带浅黄色, 产
生黄色的孢梗束。瓶梗直立在气生菌丝上, 也可轮
生在 100~ 300 m的孢子梗上。瓶梗基部柱状或瓶
状。分生孢子卵圆形或纺锤形, 2. 0 ~ 3. 0 #
1. 0~ 1. 8 m。陈祝安和陈庆涛 [ 12]报道该种真菌能
侵染柑橘植物 ( C itrus spp. )害虫黑刺粉虱 ( A leuro
can thus sp inif ertus Qua intancs)。
M etarrhizium anisop liae(M etsch. ) Sorok in金龟子
绿僵菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 7 d后, 菌落直径达
到 2. 0 cm, 菌落绒毛状至棉絮状,初为白色, 后为橄
榄绿。菌丝具分隔和分枝。瓶梗末端形成的分生孢
子成长链状排列, 分生孢子大小为 4. 5~ 7. 5 # 2. 5
~ 3. 1 m,略小于以前报道的寄生在松墨天牛幼虫
上的绿僵菌分生孢子 [ 5 ]。
Verticillium lecanii ( Z immerm ann) V iegas蜡蚧轮
枝菌
在 PDA平板上 25 ∀ 下培养 14 d后, 菌落直径
达到 2. 5~ 2. 8 cm,白色至淡黄色,很少有簇生菌丝,
背面为无色或黄色。分生孢子梗不发达, 似营养菌
丝,其上有单生、对生或 3~ 4个轮生的瓶梗,瓶梗纤
细, 15. 0~ 39. 0 # 0. 8~ 2. 5 m。分生孢子在瓶梗顶
部聚成头状, 孢子椭圆形至圆柱形, 2. 3 ~ 10. 0 #
1. 0~ 2. 6 m。无厚垣孢子。这与陈祝安和陈庆
涛 [ 12 ]报道的以柑橘植物 (C itrus spp. )害虫柑橘木虱
(D iapherina citri Kuwayama )为寄主的蜡蚧轮枝菌
一致。
Serratia marcescens B izio粘质沙雷氏菌
细胞杆状, 0. 5~ 1. 0 # 0. 4 ~ 0. 5 m , 周生
鞭毛。革兰氏阴性, 产生粉红色色素。在 LB琼
脂培养基上, 该菌株菌落开始时出现半透明黏稠
液滴, 菌落光滑, 湿润, 表面呈金属光泽, 边缘整
齐或不整齐。生理生化特征是对 V. P、卵磷脂
酶、过氧化氢、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶反应
为阳性, 氧化酶、脲酶反应为阴性, 不利用丙二酸
盐; 水解淀粉能力差, 但水解蛋白能力强; 七叶灵
呈强阳性反应; 在加入蔗糖、山梨糖醇、侧金盏花
醇的培养基中产酸, 在加入树胶醛糖、鼠李糖、纤
维二糖、阿拉伯糖的培养基中不产酸; DNA 酶 2
甲苯胺琼脂反应为正反应; 能够形成菌膜。这与
冯书亮等 [ 13]报道的以染黄胫小车蝗 ( O edaleus in
f erna lis Saussure)为寄主的细菌一致。
2. 2 松墨天牛幼虫病原微生物的种类及频率
从表 1中可以看出: 在自然状况下白僵菌在马
鞍山林场区出现频率最高, 共分离到 43次, 占出现
206
第 2期 韩 兵等:马鞍山林场松墨天牛病原微生物种类调查鉴定及毒力测定研究
频率的 30. 50% ,其次是尖孢镰刀菌也是常见的种,
而经常被认为对昆虫有弱致病力的细菌粘质沙雷氏
菌也常分离得到。
表 1 松墨天牛病原微生物的种类及频率
种类 数量 /次 频度 /%
球孢白僵菌 Beauveria ba ssiana 43 30. 50
布氏白僵菌 B. brongn ia rti ( Sacc. ) Petch 5 3. 55
串珠镰刀菌 Fu sarium m oniliform e 5 3. 55
尖孢镰刀菌 F. oxysporum 26 18. 43
茄镰刀菌 F. solan i 4 2. 84
镰刀菌多种 F. spp. 13 9. 22
粉拟青霉 P aecilom yces farinosus 2 1. 42
金龟子绿僵菌 Me tarrh izium anisop lia e 1 0. 71
蜡蚧轮枝菌 Vertici llium lecan ii 3 2. 12
其它真菌 16 11. 35
粘质沙雷氏菌 Serra tia marcescens 12 8. 51
其它细菌 11 7. 80
(总计 ) 141 100
2. 3 部分种类对松墨天牛幼虫感染死亡率的测定
以 1. 0 # 107个 ∃ mL- 1浓度的 50 L孢子悬浮
液浓度接种,天牛幼虫第 2天即可产生反应,行动也
变得很迟缓,第 14天时部分种类对松墨天牛幼虫感
染死亡率测定结果见表 2。从表中可以看出, 不同
真菌种类对松墨天牛的幼虫感染死亡率是不同的,
真菌感染死亡率的顺序是: 球孢白僵菌 = 金龟子绿
僵菌 >布氏白僵菌 >粉拟青霉 >尖孢镰刀菌。细菌
粘质沙雷氏菌对松墨天牛的幼虫的感染死亡率也达
到 65%。
表 2 部分种类对松墨天牛幼虫的校正死亡率
种类 菌株号 校正死亡率 /%
球孢白僵菌 226 100
布氏白僵菌 98 80
尖孢镰刀菌 121 40
金龟子绿僵菌 158 100
蜡蚧轮枝菌 163 75
粉拟青霉 187 65
粘质沙雷氏菌 145 65
2. 4 球孢白僵菌不同菌株对松墨天牛幼虫感染死
亡率的测定
表 3 球孢白僵菌部分菌株感染松墨
天牛幼虫的校正死亡率
菌株号 校正死亡率 /%
226 100
29 100
205 100
151 100
240 100
13 75
4 50
2 90
由于球孢白僵菌在马鞍山林场区出现频率最
高,试验选择部分白僵菌的菌株进行研究,测定了它
们对松墨天牛幼虫的的感染死亡率, 结果表明 (见表
3), 不同的球孢白僵菌菌株对松墨天牛幼虫的感染
死亡率不同, 选择的 8个菌株其中有 5个菌株对松
墨天牛幼虫的致病率达到 100%。
2. 5 高毒力菌株的营养生长
选择高致病率的球孢白僵菌菌株进行了营养生
长的测定 (表 4)。其菌落直径超过 30 mm, 方差分
析表明菌株间无显著性差异。
表 4 球孢白僵菌部分菌株的营养生长
直径: mm
菌株号 4 d 8 d 14 d
226 10 15 34
29 10 15 34
205 10 15 34
151 9 14 32
240 9 14 32
2. 6 高毒力菌株的产孢量
方差分析表明各菌株产孢量之间存在极显著性
差异 (表 5) ,菌株 226产孢量明显优于其他各菌株,
接近菌株 240的 3倍。
表 5 球孢白僵菌部分菌株 14 d的产孢量
菌株号 平均产孢量 / ( 106个∃ mm - 2 )
226 34. 27
29 26. 85
205 27. 61
151 28. 3
240 11. 34
3 讨论
松墨天牛幼虫在自然界中天敌微生物种类较
多,其中以白僵菌为主,经过测定球孢白僵菌是对松
墨天牛毒力较强的天敌微生物真菌。在安徽和江苏
两省的许多地方调查均发现松墨天牛幼虫感染白僵
菌的情况。在马鞍山林场于 2001年 3 6月的调查
很少发现松墨天牛成虫被感染白僵菌的情况, 而在
2006年 5 10月, 由于该场近两年在林中实施无纺
布防治松墨天牛,出现松墨天牛成虫感染白僵菌的
频率有所增加, 因此在进行真菌频率计算时仅根据
2001年的调查结果。
从 5个致病率最高的白僵菌菌株中发现菌株
226的产孢量最大, 而营养生长和其他菌株没有差
异。菌株的产孢量多少是衡量一个优良菌株非常重
207
林 业 科 学 研 究 第 20卷
要的指标,管氏肿腿蜂携带该菌株所产生的孢子在
松林中防治松墨天牛取得了一定的效果 [ 14] , 今后加
强对该菌株其它生物学特性的研究, 为松墨天牛的
生物防治打下基础。
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