全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (5) : 611～618
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0520611208
国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义
表达载体构建及遗传转化
许 锋 1, 2 , 朱 俊 1 , 张风霞 1 , 王 燕 1 , 程水源 33 , 程述汉 2
(1. 长江大学园艺园林学院 ,湖北 荆州　434025; 2. 山东农业大学园艺科学与工程学院 ,山东 泰安　271018;
3. 黄冈师范学院生命科学与工程学院 ,湖北 黄冈　438000)
摘要 :根据其它植物 PAL基因的保守区域 ,设计一对兼并引物 ,采用 RT2PCR方法从国槐中克隆了一个长 866 bp的
PAL基因片段 ,命名为 S jPAL。序列分析发现 S jPAL多肽与其它植物的 PAL氨基酸序列高度同源 (87%以上 ) ,且包
含与水稻和拟南芥的 PAL类似的活性位点。系统进化树分析表明 S jPAL 与豆科植物的 PAL 亲缘关系较近。RT2
PCR结果显示 , S jPAL在根和茎的表达量约为叶中的 3倍。利用反义 RNA技术将 S jPAL基因克隆至植物表达载体
pB I121,构建了 S jPAL反义 RNA植物表达载体 pB I1212PAL ,通过根癌农杆菌 EHA105将其导入拟南芥基因组 ,对获
得的抗性植株进行 PCR鉴定、Northern杂交分析、PAL活性分析以及总多酚含量和类黄酮含量分析。结果表明 ,该
反义 RNA已整合到拟南芥基因组中 ,转基因拟南芥的 PAL基因表达量、单位材料 PAL活性、总多酚含量和类黄酮含
量均显著低于野生型对照。本研究为下一步利用该基因反义表达载体转化国槐 ,通过调节酚类物质含量提高其在
再生体系中的生根能力提供了试验依据。
关键词 :国槐 ;生根能力 ; PAL基因 ;反义表达载体 ;遗传转化 ;总多酚 ;类黄酮
中图分类号 : S718. 46　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2007212223
基金项目 : 教育部新世纪优秀人才支持计划 (NCET20420746 ) ,湖北省教育厅重大项目 ( Z200627002 ) , 湖北省自然科学基金
(2002AB094)和湖北省青年杰出人才基金 (2003AB 014)
作者简介 : 许锋 (1979— ) ,男 ,湖北武汉人 ,讲师 ,博士 ,主要从事植物次生代谢基因工程方面的研究.3 通讯作者 : EΟmail: s_y_cheng@ sina. com
C lon ing of PAL Gene from Sophora japon ica, Con struction of An ti2Sen se Gene
of S jPAL and Its Genetic Tran sforma tion in A rabidopsis
XU Feng1, 2 , ZHU Jun1 , ZHANG Feng2xia1 , WANG Yan1 , CHENG Shui2yuan3 , CHENG Shu2han2
(1. College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, J ingzhou　434025, Hubei, China;
2. College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taipian　271018, Shandong, China;
3. College of L ife Science and Engineering, Huanggang Normal University, Huanggang　438000, Hubei, China)
Abstract:A PAL gene fragment with 866 bp length ( named as S jPAL ) was cloned from Sophora japon ica by RT2
PCR and using a pair of degenerated p rimers, which were designed basing on the sequence of other p lant PAL genes
conserved region. The deduced S jPAL polypep tide showed high identities ( > 87% ) to other p lant PAL am ino acids
via sequence analysis, and contained the sim ilar active sites in PAL p roteins of O ryza sa tiva and A rabidopsis.
Phylogenetic tree analysis indicated that the S jPAL had a closer relationship with PAL p roteins from legum inous p lant
species. RT2PCR analysis revealed that the relative abundance of S jPAL mRNA in root and stem was about three
times as in leaf. U tilizing anti2sense RNA technology, S jPAL gene was inserted directionally into pB I121, a p lant
exp ression vector, to construct an anti2sense fusion gene and a p lant exp ression vector pB I1212PAL. Genetic
transformation to A rabidopsis was mediated by EHA105. Transgenic A rabidopsis lines were performed using PCR,
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
Northern blot, PAL activity of per unit material, and total polyphenolic and flavonoid concentration analysis. The
results showed that the exp ression level of PAL gene, PAL activities of per unit material, and total polyphenolic and
flavonoid concentration of transformed lines were all significantly lower than the wild control. The p resent studies
p rovided an experimental basis for further genetic transformation in S. japon ica of S jPAL gene anti2sense exp ression
vector to imp rove its rooting ability in regeneration system via regulating its phenolic compound content.
Key words: Sophora japon ica; rooting ability; PAL gene; anti2sense exp ression vector; genetic transformation; total
polyphenolic; flavonoid
　　国槐 (S ophora japon ica L. )原产中国北方 [ 1 ] ,广
泛分布于我国大江南北。其树型美观 ,生长速度中
等 ,寿命极长 ,耐寒、耐旱、耐贫瘠、抗烟尘及有害气
体 ,木材坚韧、纹理美观 ,在水土保持、防风固沙、减
少环境污染、提供民用建筑用材等方面发挥着重要
的作用 ,是城乡绿化的主要树种之一。此外 ,国槐还
具有重要的药用价值。国槐中的干燥花蕾 ,即槐米 ,
内含丰富的芸香苷 ,具有抗菌消炎、抗心律不齐、抗
氧化、降低胆甾醇量等药效 ,是一种广泛应用于心脑
血管疾病的药物 [ 2 - 3 ]。但是 ,国槐这一优良树种的
繁殖仍采用传统的种子种植和嫁接繁殖 ,繁殖系数
低 ,年限长。目前 ,组织培养作为植物离体快速繁殖
的技术已很成熟且应用广泛 ,在国槐上也已有少量
应用 [ 1, 4 - 6 ]。在组织培养的过程中 ,不定芽生根是一
个重要的环节 ,外植体诱导生根的能力随着木质化
的程度加深而显著降低。虽然利用国槐幼嫩树苗的
外植体进行离体繁殖已有成功报道 [ 1 ] ,但由于国槐
外植体在离体培养中生根缓慢 ,生根力低 ,大大限制
了通过组培技术进行国槐的商品化生产 [ 5 - 6 ]。
组织培养中根系的生长和发育由多种生理和化
学因子所调控 ,如培养的温度 ,氧浓度 ,培养基 pH
值 ,根系发育相关的酶 ,植物激素 ,多胺 ,多糖以及酚
类物质 [ 7 ]。许多研究表明 ,外植体中酚类物质的存
在显著抑制不定芽的生根力和生根率 [ 8 - 9 ]。由于国
槐的外植体中含有大量的酚类物质 ,这给国槐外植
体离体培养的生根带来了极大的困难。因此 ,降低
国槐外植体的酚类物质含量可作为提高其生根力和
生根率的一个重要途径。近年来 ,反义 RNA技术已
多次成功应用于抑制植物酚类物质代谢途径中相关
酶基因的表达 ,如杨树 ( Populus sp. )的甲基转移
酶 [ 10 ] , 矮 牵 牛 和 大 丁 草 的 查 尔 酮 合 成 酶
(CHS) [ 11 - 12 ] , 番茄的多酚氧化酶和肉硅酸羟化
酶 [ 13 - 14 ]等 ,这些酶在转基因植株中的表达受到消减
使得相应的代谢产物如木质素、类黄酮、花青苷和多
酚类等物质含量也显著减少。Euch等 [ 8 ]也报道了
通过反义 RNA技术抑制核桃的类黄酮和多酚类化
合物的合成可大幅度提高核桃在离体培养中的生根
力和生根速度 ,并具有良好的商业化前景。
苯丙氨酸解氨酶 ( Phenylalanine ammonia2lyase,
PAL ; EC 4. 3. 1. 5)是植物苯丙烷类代谢的第一个关
键酶 ,它催化 L2苯丙氨酸解氨酶生成反式肉桂酸 ,再
由反式肉桂酸生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产
物 ,这些酸可以进一步转化为香豆素、绿原酸 ,也可
形成 CoA酯 ,再进一步转化为类黄酮、木质素和酚
类等次生代谢产物 ,植物酚类物质的合成与 PAL 基
因的表达密切相关 [ 15 ]。植物 PAL 基因为多基因家
族所编码 , PAL基因的表达受发育和环境信号 (如温
度、光质、机械损伤、激素和营养等 )的调节 ,表现出
严格的组织和发育特异性 [ 15 - 18 ]。目前已从 25种被
子植物与两种裸子植物中克隆到 PAL基因 [ 19 - 20 ] ,但
在国槐中尚未见到包括 PAL基因在内的苯丙烷类代
谢途径中相关酶基因的报道。本研究首次克隆到国
槐 PAL基因片段 ,构建了 PAL反义 RNA植物表达载
体 ,并通过根癌农杆菌系统导入拟南芥 (A rabidopsis
tha liana (L. ) Heynh) ,获得转基因拟南芥再生植株 ,
以期为下一阶段转化国槐 ,提高其外植体离体培养
过程中的生根能力奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1 　菌种及质粒 　大肠杆菌 Escherich ia coli
(M igula Castellani) DH5α,根癌农杆菌 (Ag robacteri2
um tum efaciens ( Sm ith et Townsend) Conn) EHA105,
植物表达载体 pB I121均由本实验室保存。
1. 1. 2　植物材料 　国槐 (Sophora japon ica L. )的叶
片、根与茎取自长江大学银杏 (Ginkgo biloba L. )种
植园 ,拟南芥 (A rabidopsis tha liana (L. ) Heynh. )哥伦
比亚生态型无菌苗为本实验室保存。
1. 1. 3　酶及试剂 　逆转录试剂盒、限制性内切酶、
PCR试剂盒为晶美生物工程有限公司产品 , DNA纯
化回收试剂盒为美国 AXYGEN 公司产品 ,一步法
RT2PCR试剂盒和 pMD182T载体试剂盒购自于大连
216
第 5期 许 　锋等 :国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义表达载体构建及遗传转化
宝生物公司 , Trizol试剂盒购自于上海英骏公司 ,
Northern杂交试剂盒 (D IG Northern Starter kit)购自
于德国罗氏公司 ,抗生素、植物生长调节剂为 Sigma
公司产品。其它试剂均采用进口或国产分析纯。引
物合成及序列测定由上海生工完成。
1. 2　方法
1. 2. 1　国槐不同组织的总 RNA提取及 cDNA第一
链的合成 　国槐根、茎和叶的总 RNA 提取采用
CTAB法 [ 21 ] , cDNA第一链的合成参考逆转录试剂
盒说明书。
1. 2. 2　PAL 基因 cDNA片段的扩增 　根据其他植
物 PAL基因中的保守序列 ,设计了一对兼并引物 :
PAL sP: 5′2GC (A /T/C) TC ( T/C /G) GGT GAT (C /
T) T (A /G) GT ( T/C) 23′, PALaP: 5′2ACA TCT TGG
TT(A /G) TG ( T/C) TGC TC23′。 PCR扩增反应液
为 25μL反应体系 : cDNA第一链 1μL ( 0. 5μg·
μL - 1 ) , 10 ×Buffer 2. 5μL, MgCl2 2μL (25 mmol·
μL - 1 ) , 1μL PAL sP ( 10μmol·L - 1 ) , 1μL PALaP
(10μmol·L - 1 ) , dNTP 0. 5μL ( 10 mmol·L - 1 ) ,
Taq聚合酶 0. 5μL ( 5 U·μL - 1 )。 PCR扩增条件
为 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 1 m in, 49 ℃ 1 m in, 72 ℃
1 m in, 35个循环 ; 72 ℃ 10 m in。
扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,将 PCR
特异条带用胶回收试剂盒回收 ,并连接到 pMD182T
载体 ,连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞
中 ,筛选阳性克隆用于测序。
DNA序列相似性比较及氨基酸活性位点在 NC2
B I网站上用 BLAST和 RPS2BLAST完成 ,氨基酸序
列比较利用 Vector NTI 10. 0完成 ,氨基酸序列进化
树由 Clustal X1. 81和 MEGA3. 0完成。
1. 2. 3　PAL 基因不同组织表达模式分析 　通过序
列比较 ,在已证实获得的片段为国槐 PAL基因片段
的基础之上 ,根据已获得的 PAL 序列设计了一对特
异引物 , PALFP: 5′2CGG GTG ATT TGG TTC CTT
TGT C23′, PALRP: 5′2CAG CCC ATT GTT GTA GAA
GTC A23′。分别提取国槐根、茎和叶的总 RNA,分别
以 0. 5μg总 RNA作为模板进行一步法 RT2PCR,扩
增 PAL 基因的特异片段。反应条件为 : 50 ℃
30 m in; 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 1 m in, 59 ℃ 1 m in, 72 ℃
1 m in, 25个循环 ; 72 ℃ 10 m in。同时利用国槐的看
家基因 18S基因作为对照 ,扩增所用的特异引物根
据 GenBank中已发表的序列设计 (AF174638 ) ,即
18SFP: 5′2TAG AAA TCG TTC AGT GCT CCC C23′,
18SRP: 5′2CTC CAC CAC GGA CTC AGT TTT C23′。
1. 2. 4　反义表达载体的构建与转化 　根据测序结
果 ,设计带 Sac I和 B am H I酶切位点的引物 , PALF2
SacI: 5′2C GAG CTC CGG GTG ATT TGG TTC CTT
TGT C23′, PALR2B am H I: 5′2CG GGA TCC CAG CCC
ATT GTT GTA GAA GTC A23′(下划线表示酶切位
点识别序列 )。以国槐 cDNA 为模板 ,回收纯化
700 bp左右的片段和表达载体 pB I121,均用 Sac I和
B am H I双酶切 ,将酶切后的 PAL 片段与酶切后的
pB I121载体连接 (牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化 ) ,连
接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,碱法提取
质粒 DNA,通过 Sac I和 B am H I酶双酶切和菌落
PCR鉴定插入片段成功与否 ,上游引物利用 pB I121
载体的 35S启动子序列设计 , 35SP: 5′2GTT GAA
GAT GCC TCT GCC GA23′,下游引物利用 PAL片段
的下游引物 PALR2B am H I,片段插入成功后扩增的
目的条带大小应为 35S启动子引物下游碱基数与
PAL基因片段长度之和 937 bp。构建的反义植物表
达载体命名为 pB I1212PAL。采用电击法将质粒转化
进农杆菌感受态细胞 EHA105,电激仪为 B ioRad,转
化电压为 2 500V (电阻 200Ω ) ,电激时间为 3～4 s。
具体操作方法见参考文献 [ 22 ]。
1. 2. 5　根癌农杆菌介导拟南芥的转化和转基因拟
南芥的筛选及鉴定 　农杆菌介导拟南芥的转化参照
花序浸染法进行 [ 23 ]。 T0 代种子在 MS + Kanr
50 mg·L - 1上培养 ,筛选转基因植株 ,再生拟南芥移
至温室里的土壤中生长。待土壤中再生植株长大
后 ,取少量叶片抽提总 DNA,使用 35SP和基因下游
PALR2B am H I引物 PCR检测阳性植株。
1. 2. 6　拟南芥的 RNA提取及 Northern杂交分析 　
分别取野生型对照和转基因型拟南芥叶片 ,利用 Tr2
izol试剂盒提取叶片 RNA。以国槐 PAL基因片段作
为探针 ,分别以对照和转基因拟南芥叶片的总 RNA
为模板进行 Northern 杂交。杂交方法参照 D IG
Northern Starter kit说明书。
1. 2. 7　PAL 活性测定及总多酚与类黄酮含量的测
定 　PAL的提取和活性测定参照文献 [ 24 ] ,略作改
进。取叶片 0. 5 g,加 5 mL 提取液 (含 1% PVP,
1 mmol·L - 1 EDTA, 20 mmol·L - 1巯基乙醇 , 1%甘
油 , 0. 1 mL·L - 1硼酸缓冲液 , pH值 8. 8) ,加入石英
砂 ,冰浴研磨成匀浆 , 4 ℃下 4 层纱布过滤 , 4 ℃
12 000 g离心 20 m in,上清液即为酶粗提液。在 pH
值 8. 8硼酸缓冲液中加入 3底物L - 苯丙氨酸和粗
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
酶液 , 40 ℃保温 60 m in, 6 mol·L - 1 HCl终止反应 ,
测定 290 nm处 OD值。以 290 nm处吸光度的变化
来表示酶活力。规定每小时每毫升粗酶液 OD值变
化值 0. 01为 1个酶活性单位 (U)。
总多酚含量的测定采用 Folin Ciocalteu比色
法 [ 25 ] 。取叶片 1 g,加入液氮研磨成粉状 ,加入
10 mL 80%甲醇溶液混合均匀。混合液在 40 ℃下
过夜超声振荡抽提 ,提取液抽滤得滤液 ,滤液浓缩
除去有机溶剂后用 4 mL蒸馏水定容 ,即为总多酚
浓缩待测液。 Folin Ciocalteu试剂配制参照文献
[ 25 ] ,取 1 mol·L - 1的 Folin Ciocalteu试剂、1 mL
15%Na2 CO3溶液和 1 mL适当稀释的待测液均匀
混合 ( 1 mL蒸馏水作为空白对照 ) ,在室温下反应
10 m in,测定在 760 nm下的吸光值 ,以没食子酸作
为标样。总多酚含量用等量没食子酸 mmol·kg- 1
表示。
类黄酮含量的测定参照文献 [ 26 ] ,取 0. 5 g鲜
叶片加入液氮研磨成粉状 ,加入 10 mL 70%乙醇
40 ℃下过夜超声振荡抽提 ,提取液抽滤得滤液 ,滤
液浓缩除去有机溶剂后用 4 mL蒸馏水定容得类黄
酮浓缩待测液。取适当稀释的 1 mL待测液 ( 1 mL
蒸馏水作为空白对照 )转移至 10 mL容量瓶中 ,加
入 0. 3 mL 5% NaNO2 ,摇匀 ; 放置 5 m in后加入
10%A lCl3 0. 3 mL,摇匀 ;放置 6 m in后再加入 4%
NaOH溶液 2 mL ,摇匀 ;最后用 60%的乙醇定容至
10 mL , 15 m in后于 510 nm处测定吸光值。以芦丁
作为标样 ,类黄酮含量以等量芦丁 mmol· kg- 1
表示。
2　结果与分析
2. 1　PAL 基因 cD NA片段克隆及序列分析
以国槐叶片总 RNA为模板 ,采用兼并引物 RT2
PCR扩增获得预期大小的目的片段 ( 850 bp左右 )。
将目的片段回收 ,经克隆测序得到长度 866 bp 的
DNA序列。BLAST分析显示该序列与其它植物的
PAL基因序列高度同源 ,如豇豆 (V igna ungu icu la ta
(L inn. ) W alp , 86% ) ,杨树 ( Populus k itakam iensis,
81% ) ,花叶木薯 (M anihot escu len ta, 80% ) ,矮牵牛
( Petun ia hybrida V ilm. , 79% ) ,海桐 ( P ittosporum to2
bira ( Thunb. ) A it, 78% )和夹竹桃 (N erium oleander
L. , 76% )。这表明获得的 DNA片段为国槐 PAL基
因 cDNA片段 ,命名为 S jPAL ,在 GenBank中的注册
号为 AY747679。S jPAL 编码 289个氨基酸 ,利用序
列比对软件 Vector NTI 10. 0对 S jPAL编码的蛋白质
序列与其它植物 PAL的蛋白质序列进行多重比较发
现 (图 1) , S jPAL蛋白质与其它植物的 PAL序列都具
有很高的同源性 ,如豇豆 ( 91% ) ,鹰嘴豆 (C icer ari2
etinum L inn. , 89% ) , 紫花苜蓿 (M ed icago sa tiva
L inn. , 88% ) , 大豆 ( Glycine m ax ( L inn. ) Merr. ,
88% ) ,百脉根 (L otus japon icus, 87% )和烟草 (N icoti2
ana tabacum L. , 87% ) ,这进一步验证了 S jPAL为国
槐 PAL基因家族中的成员之一。
2. 2　PAL 氨基酸序列进化树分析
为研究国槐 PAL基因和其它植物 PAL 基因之
间的进化关系 ,利用软件 Clustal X1. 83和 MEGA
3. 0通过 neighbor2joining (NJ )法构建了 PAL 氨基
酸序列的进化树 (图 2 )。基因进化树的分析结果
主要呈现出两大特征。首先 ,以大豆查尔酮合成酶
( GmCHS)作为 PAL 基因的外部分支单独列成一
类 ,进化树中所有植物的 PAL 氨基酸序列聚合成
另外一大类 ,这表明 PAL 基因在植物进化上起源
相同 ,不同植物的 PAL 基因可能具有相同的保守
结构和功能。其次 ,在 PAL基因家族中 ,不同植物
以科为单位分别聚成一类 ,如国槐与苜蓿 ,豇豆以
及大豆等豆科 (Legum inosae)植物聚成一类 ,禾本
科 ( Gram ineae)植物水稻 (O ryza sa tiva L. )、玉米
( Z ea m ays L. )和小麦 ( Triticum aestivum L inn. )也
聚成一类等。此外 ,裸子植物与被子植物的 PAL
基因也由于物种亲缘关系不同而各聚为一类。上
述由 PAL基因进化树分析出的植物分类结果符合
植物形态学上的分类地位。
2. 3　S jPAL 基因的组织表达特异性分析
从国槐的根、茎和叶中分别提取总 RNA ,分别
以 0. 5μg总 RNA作为模板进行一步法 RT2PCR扩
增 ,用特异引物 PCR扩增得到 18S基因片段作为内
参。结果如图 3所示 , S jPAL在根和茎中的表达量较
高 ,大约是叶的 3倍。
2. 4 　S jPAL 基因反义表达载体的构建与转化拟
南芥
重组质粒利用电激法导入农杆菌 EHA105,采
用花序浸染法将载体 pB I1212PAL转化拟南芥 ,收获
T0代种子在 MS + Kanr 50 mg·L - 1上培养 ,转基因阳
性植株在培养基上可以生根萌芽且生长良好 ,而对
照在含有卡那培养基上不能发芽。
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第 5期 许 　锋等 :国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义表达载体构建及遗传转化
PAL蛋白质名称缩写、植物名及 GenBank登录号如下所示 : CaPAL ,鹰嘴豆 , CAB60719; V uPAL ,豇豆 ,
AAD45384; S jPAL ,国槐 , AAX18752; N tPAL ,烟草 , BAA22948; Gm PAL ,大豆 , CAA37129; L jPAL ,百脉根 , BAF36973;M sPAL ,
紫花苜蓿 , CAA41169。完全一致氨基酸序列用黑底白字表示 ,
高度保守氨基酸序列用灰底白字表示 ,非保守氨基酸序列用白底黑字表示 ; 3 表示 PAL保守区域催化活性位点
图 1　S jPAL氨基酸序列与其它植物 PAL蛋白质序列的多重比较
516
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
植物学名后的字母数字表示该植物 PAL蛋白质序列的 GenBank登录号
图 2　S jPAL与其它植物 PAL蛋白质序列的系统进化树分析
图 3　S jPAL在不同组织中的表达特性
M: DNA Marker DL2000;W T:野生型对照
拟南芥 PCR产物 ; C1～C8:转基因拟南芥 PCR产物
图 4　转 S jPAL反义 RNA拟南芥的 PCR鉴定
2. 5　转基因拟南芥的分子鉴定及分析
通过 35S启动子上游引物和基因下游引物 PCR
检测 (图 4 ) ,野生型对照 PCR 产物电泳无目的条
带 , PCR结果成阳性 (可扩增出 937 bp的目的片段 )
的初步确定为转基因拟南芥 ,共获得 42株转基因拟
南芥 ,随机挑选 8株转基因拟南芥做分子和生理性
状分析。Northern杂交分析结果表明 ,转基因拟南
芥 PAL基因的表达量均明显低于对照 (图 5a) ,其中
转基因拟南芥 C1、C2、C6和 C8的 PAL基因表达量
最小 ,约为野生型对照的 10%。PAL活性分析结果
表明 ,转基因拟南芥的单位质量叶片 PAL活性均显
著低于野生型对照 ( 110. 6 U, P < 0. 05) ,转基因拟
南芥 C2、C6和 C8的 PAL活性最低 ,分别为 24. 6 U、
25. 7 U 和 26. 5U,约为野生型对照的 21% ～24%
W T:野生型对照拟南芥 ; C1, C2, C3, C4,
C5, C6, C7, C8:转基因拟南芥株系
图 5　野生型对照和转基因拟南芥分子和生理分析
( a)野生型对照和转基因拟南芥 PAL基因 Northern杂交分析 ;
( b)野生型对照和转基因拟南芥 PAL活性分析 ;
( c)野生型对照和转基因拟南芥总多酚含量分析 ;
( d)野生型对照和转基因拟南芥类黄酮含量分析
（图 5b) ,这与 PAL基因表达量的结果相对应。总多
酚含量和类黄酮含量分析结果与 PAL活性分析结果
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第 5期 许 　锋等 :国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义表达载体构建及遗传转化
相似 ,野生型对照的总多酚含量和类黄酮含量最高
(图 5c 和 5d ) , 分 别 为 1. 35 mmol · kg- 1 和
0. 78 mmol ·kg- 1 ,显著高于其它 8株转基因拟南芥
的总多酚含量和类黄酮含量 ( P < 0. 05) ,转基因拟
南芥中 C8的总多酚含量和类黄酮含量最低 ,分别为
0. 39 mmol·kg- 1和 0. 27 mmol·kg- 1 ,约为对照的
28. 9%和 34. 6%。
3　讨论
3. 1　S jPAL 基因的克隆与表达
本研究首次克隆到国槐的 PAL基因片段 , S jPAL
基因编码的蛋白质序列包含很多 PAL基因的催化活
性位点 (图 1) ,如 P51 , K52 , E53 , G54 , L55 , N59 , Y150 , N183
和 H195 ,这些活性位点与拟南芥和水稻的活性位点
非常相似 [ 27 - 28 ]。通过 PAL 基因进化树分析 ,发现
S jPAL与豆科植物的 PAL 基因聚类关系最近 ,这与
植物分类学上的地位是一致的 ,同时也暗示了国槐
PAL基因与其它豆科植物 PAL 基因的进化起源相
同 ,可能与其它豆科植物 PAL 基因的氨基酸保守结
构、保守区域以及功能是相似的 [ 29, 30 ]。组织特异性
表达分析显示 S jPAL 在根和茎中的表达量较高 ,在
叶中最低 ,这与 Kervinen等 [ 29 ]和 O sakabe等 [ 31 ]的结
果相同。相对叶而言 ,根和茎的木质化程度较高 , S j2
PAL在根和茎的转录本较高表明 S jPAL基因可能参
与调节国槐体内木质素的合成 [ 32 ]。 PAL 基因在植
物体内是由多基因家族编码 , 如拟南芥 [ 27 ]、大
麦 [ 29 ]、松树 ( P inus spp. ) [ 30 ]和杨树 [ 31 ]均有多个 PAL
基因。PAL基因家族中各成员在不同的生物或非生
物因子诱导下具有不同的表达特征 ,它们定位于不
同的组织细胞内 ,调控不同的代谢途径 [ 18, 33 ]。
3. 2　转 S jPAL 反义 RNA拟南芥的获得为提高国
槐组培苗生根能力提供了试验依据
反义 RNA技术是指通过人工导入反义 RNA来
调控细胞内靶基因的表达从而定向控制某些生物性
状。自 Izant等 [ 34 ]首次证实人工构建的反义寡核苷
酸在真核生物中具有生物学效应以来 ,反义技术在
真核生物的研究得到迅速发展。通过反义 RNA技
术调节苯丙烷代谢相关酶基因的表达水平来调控植
物酚类物质和类黄酮含量 ,是目前提高木本植物在
组培苗生根能力的一个重要途径 [ 7 - 8 ]。本研究将
S jPAL反义 RNA导入拟南芥中 ,转基因拟南芥总多
酚和类黄酮含量显著低于对照 (图 5) ,与 Euch等 [ 8 ]
的研究结果一致 ,转 S jPAL反义 RNA拟南芥的获得
为下一步将 S jPAL 反义 RNA导入国槐中以提高国
槐组培生根能力 ,提供了试验依据和技术平台。虽
然近年来国槐的转基因技术也已有报道 ,如张晓英
等 [ 1 ]和 Zhang等 [ 5 ]分别将抗虫基因 sck和 gus基因
导入国槐 ,成功获得转基因国槐再生植株 ,但是由于
国槐抗性芽的生根率低导致获得完整国槐再生植株
的效率也很低。因此 ,下一步利用反义 RNA技术调
控国槐的酚类物质含量提高其生根力将为国槐的转
基因研究奠定基础。此外 ,本研究中 S jPAL 基因在
植物中的作用部位 ,与其它酚类物质和类黄酮合成
酶基因之间的相互关系 ,外界温度和光照等环境条
件对基因表达的影响以及 PAL基因沉默在后代遗传
的稳定性等有待进一步研究。
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