全 文 ：林业科学研究　2005 ,18 (3) :241～245
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2005) 0320241205
地锦与五叶地锦原生质体分离及培养研究
李正红1 , 孙振元2 3 , 刘秀贤1 , 彭镇华2
(11 中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,云南　昆明　650224 ;21 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091)
摘要 :用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液提取地锦和五叶地锦无菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织及地锦幼胚
愈伤组织的原生质体 ,对影响原生质体提取得率及活力因素进行分析 ,对不同材料原生质体得率进行比较 ,对提取
的原生质体进行液体浅层、固液结合及固体等方式培养 ,对原生质体形成的愈伤组织以 MS 和改良 B5 培养基附加
不同浓度 NAA、62BA、2 ,42D、PEG、KT、ZT等进行分化培养。试验结果表明 :纤维素酶对原生质体提取得率有极显著
影响 ,适宜地锦幼叶原生质体提取的酶液组合为 :纤维素酶 0. 5 %、果胶酶 0. 3 %、甘露醇 0. 6 mol·L - 1 、酶解 8 h ;不同
材料原生质体提取得率有显著差异 ;仅五叶地锦胚乳愈伤组织来源的原生质体在固体培养基中形成新的愈伤组织 ,
其它方式培养的不同材料原生质体均无分裂或仅形成数十个细胞的细胞团后便解体 ;用 30 余组配方进行了五叶地
锦胚乳愈伤组织原生质体形成的新愈伤组织的分化培养 ,继代 6～10 次后仍无分化迹象。
关键词 :地锦 ;五叶地锦 ;原生质体 ;培养
中图分类号 :S60214 　　　文献标识码 :A
收稿日期 : 2004212227
基金项目 : 国家“863”资助项目 :“地锦种质资源创新及优良品种培育”(2001AA244031)
作者简介 : 李正红 (1964 —) ,男 ,云南景东人 ,副研究员 ,博士生.3 通讯作者 : 孙振元 ,研究员 ,博士生导师.
Isolation and Culture of Parthenocissus tricuspidata and
P. quenquefolia Protoplasts
LI Zheng2hong1 , SUN Zhen2yuan2 , LIU Xiu2xian1 , PENG Zhen2hua2
(1. Research Institute of Resources Insects , CAF , Kunming 　650224 ,Yunnan ,China ;
2. Research Institute of Forestry , CAF , Beijing 　100091 ,China )
Abstract :Mixed enzyme liquid of cellulase R210 ,Pectolyase Y23and mannitol was used to extract the protoplasts from sterilized
seedling leaves and endosperm callus of Parthenocissus tricuspidata and P. quenquefolia. The factors affectiong the yield and ac2
tivities of portoplasts were analyzed and the yield of protoplast from different sources was compared. The protoplasts obtained were
cultured by liquid ,solid2liquid and solid culture methods. The differentiated cultures were conducted on the callus formed from
protoplasts on MS and modified B5 media with different concentrations of NAA ,62BA ,2 ,42D , PEG, KT ,and ZT. The results
showed that cellulase R210 had extremely singificant influences on the extract yield of protoplasts. The suitable enzyme liquid com2
bination for extracting protoplast of P. tricuspidata was :cellulase R210 013 % ,mannitol 016 mol·L - 1 ,with enzymolysis time 8
hours. There existed significant differences among different sources in the yield of protoplast . Only the protoplast from P. quenque2
folia endosperm callus could form new callus on soild media. While the protoplasts from other sources had no divistion or disinte2
grated after forming cell groups containing dozens of cells. The new callus tissues formed from endosperm callus protoplasts of P.
quenquefolia were differentiated cultured with over thirty prescriptions ,and no differentiation was found after 6210 subculture.
Key words : Parthenocissus tricuspidata ; Parthenocissus quenquefolia ; protoplast ;culture
地锦 ( Parthenocissus tricuspidata (Sieb. & Zucc. )
Planch. )和五叶地锦 ( P. quenquefolia (L. ) Planch. )
为葡萄科 (Vitaceae) 地锦属 ( Parthenocissus Pl . ) 植物 ,
春夏叶色翠绿 ,入秋转为鲜红或紫红 ,观赏效果好 ,
是园林及城市垂直绿化的优良材料 ,也是荒漠、石质
山地、公路及铁路护坡植被恢复的理想树种[1 ,2 ] 。然
而 ,两个种均存在各自的缺陷[3 ,4 ] ,为获得综合此二
种优良特性的地锦新种质所做的杂交试验表明 :两
个种杂交不亲和 ,因此 ,采用体细胞杂交、物理及化
学诱变等现代生物技术进行地锦种质创新 ,可望获
得理想的优良新种质 ,而原生质体培养及植株再生
是体细胞杂交的前提。目前国内外对该属植物原生
质体提取及培养的研究极少 ,仅见 C. Passaquet[5 ]及
Y. Zuily2Fodil [6 ]从地锦根冠瘤分离出原生质体进行
RNA 及氨基酸等代谢的研究 ,提取的原生质体培养
3 周后损失约 30 % ,再生壁细胞约 10 % ,培养开始 1
周内未见细胞分裂迹象 ,但原生质体的蛋白质和
RNA 却仍具活性。未见地锦属植物原生质体提取得
率、活力及原生质体进一步形成愈伤组织及再生植
株的报道。
本试验以地锦及五叶地锦无菌苗幼叶、胚及胚
乳愈伤组织为材料 ,进行原生质体提取及培养研究 ,
着重对影响原生质体提取得率及活力因素进行了分
析 ,并从五叶地锦胚乳愈伤组织提取的原生质体经
培养形成新的愈伤组织 ,对新愈伤组织进行了分化
培养 ,以便为地锦属植物原生质体再生植株及进一
步的体细胞杂交提供技术资料。
1 　材料及方法
111 　影响原生质体提取得率及活力的因素
研究纤维素酶 (Cellulase R210) 、果胶酶 (Pectolyase
Y23) 、甘露醇浓度及酶解时间对地锦无菌苗幼叶原生
质体提取得率及活力的影响。采用 4 因素 3 水平正
交设计 ,共 9 个组合 ,每组合 2 重复 (表 1) 。
表 1 　影响原生质体提取的因素及水平
水平
Cellulase
R210/ % Pectolyase Y23/% 甘露醇/(mol·L - 1) 酶解时间/h
1 0. 3 0. 3 0. 2 4
2 0. 5 0. 5 0. 4 8
3 1. 0 1. 0 0. 6 12
取地锦无菌苗 3 周左右幼叶 0. 3 g ,切成 0. 5～1
mm 细条 ,放入含 10 mL 酶液的 6 cm 培养皿中 (材料
与酶液比例 1∶33 g·mL - 1) ,置恒温 (25 ℃) 摇床 (40
pr·min - 1 ) 黑暗中酶解。酶液用 CPW 溶液配制 ,
pH5. 8。原生质体2酶混合液用 400 目镍丝网过滤 ,
除去大的细胞团块 ,滤液转移到离心管中 ,500 g 离
心 3 min ,弃去酶液 ,收集原生质体 ,再用 CPW 液洗
涤 1 次 ,用原生质体培养液洗涤 2 次 ,最后添加培养
液。用血球计数器计算产量 ,用 FDA 染色法测定原
生质体活力。
112 　不同材料原生质体得率比较
用相同酶液 (Cellulase R210 0. 5 % ,Pectolyase Y23
0. 3 % ,甘露醇 0. 6 mol·L - 1) 处理地锦和五叶地锦无
菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织、地锦幼胚愈伤组
织 ,每种材料均为 0. 3 g ,加酶液 10 mL ,酶解 8 h ,进
行原生质体提取得率比较。
113 　原生质体培养方式
用 112 中提取的原生质体进行不同方式培养。
原生质体培养液 :改良 B5 基本培养基附加水解
酪蛋白 300 mg·L - 1 ,谷氨酰胺 150 mg·L - 1 ,甘氨酸 20
mg·L - 1 ,天冬氨酸 20 mg·L - 1 ,葡萄糖 0. 5 mmol·L - 1 ,
蔗糖 1 % ,甘露醇 0. 6 mol·L - 1 ,CaCl2·2H2O 5 mmol·
L - 1 ,62BA 2 mg·L - 1 , 2 ,42D 0. 5 mg·L - 1。固体培养
基添加琼脂糖 1. 2 %。
用培养液将原生质体密度调为 1～2 ×105 个·
mL - 1 ,以 6 cm培养皿进行液体浅层、固液结合及固体
3 种方式培养 ,每皿加入原生质体 2 mL ,置于生物培
养箱中 25 ℃暗培养。液体浅层及固液结合培养每周
添加一次新鲜培养基 ,渗透压从 0. 6 mol·L - 1降至 0. 4
mol·L - 1 ,再降至 0. 2 mol·L - 1 ,形成愈伤组织后转至改
良B 5 + 6-BA 2 + 2 ,4-D 0. 5 的固体培养基。
114 　愈伤组织分化培养
以 MS 和改良 B5 为基本培养基 ,添加 30 g·L - 1
蔗糖、0. 75 %琼脂粉及不同浓度 PEG、62BA、NAA、2 ,
42D、KT、ZT、GA3 等植物生长调节物质 ,对原生质体
形成的愈伤组织进行分化培养。
2 　结果与讨论
211 　影响地锦幼叶原生质体提取得率及活力的因
素
21111 　影响得率因素分析 　9 个组合酶液处理中 ,
原生质体得率最低为处理 1 (8. 00 ×105 个·g - 1) ,最
高为处理 6 (9. 85 ×106 个·g - 1) ,二者相差近 10 倍。
各处理得率排序为 :6 > 7 > 4 > 8 > 9 > 3 > 5 > 2 > 1
(表 2) 。
242 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
表 2 　不同处理原生质体得率及活力
处理 得率/ (个·g - 1) 活力/ %
1 8. 00 ×105 89. 74
2 1. 13 ×106 91. 89
3 3. 64 ×106 81. 48
4 9. 27 ×106 80. 61
5 3. 56 ×106 82. 23
6 9. 85 ×106 81. 91
7 9. 58 ×106 81. 63
8 6. 40 ×106 69. 12
9 6. 02 ×106 80. 30
方差分析 (表 3)表明 ,纤维素酶对原生质体提取
得率的影响较其它 3 个因素有极显著差异 ,也即纤维
素酶在原生质体提取中起决定性作用 ;而极差分析表
明 (表 4) ,纤维素酶浓度以 0. 5 %处理效果最佳。
其它 3 个因素对原生质体得率的影响均无显著
差异 ,相较而言 ,以酶解时间作用更大 ,极差分析结
果表明 ,酶解时间以 8 h 为最佳。
综合方差及极差分析 ,利于提高地锦幼叶原生
质体提取得率的最佳组合为 :0. 5 %纤维素酶 ,0. 3 %
果胶酶 ,0. 2 mol·L - 1甘露醇 ,酶解 8 h。
表 3 　原生质体提取得率影响因素方差分析
变异来源 Df SS MS F F0. 05 F0. 01
纤维素酶 　 2 　　 　1. 562 3E + 14 　 　　7. 811 7E + 13 　 　　14. 855 1 4. 26 33 8. 02 33
果胶酶 2 2. 669 8E + 13 1. 334 9E + 13 2. 538 5
甘露醇 2 1. 683E + 12 8. 415 1E + 11 0. 160 03
酶解时间 2 3. 562 7E + 13 1. 781 4E + 13 3. 387 51
误差 9 1. 051 7E + 13 5. 258 6E + 12
总和 17 2. 307 6E + 14
表 4 　原生质体提取得率、活力影响因素极差分析
处理 纤维素酶 果胶酶 甘露醇 酶解时间 得率×105/ (个·g - 1) 活力/ %
1 0. 3 0. 3 0. 2 4 8 , 8 90. 47 ,88. 89
2 0. 3 0. 5 0. 4 8 8. 67 , 14 90. 00 ,94. 12
3 0. 3 1 0. 6 12 4. 29 , 31. 4 82. 61 ,80. 00
4 0. 5 0. 3 0. 4 12 87. 5 , 102 86. 84 ,76. 67
5 0. 5 0. 5 0. 6 4 31. 5 , 41. 4 88. 00 ,78. 37
6 0. 5 1 0. 2 8 95 , 102 82. 14 ,81. 58
7 1 0. 3 0. 6 8 108 , 82 87. 18 ,78. 69
8 1 0. 5 0. 2 12 67. 5 , 60. 6 66. 67 ,72. 22
9 1 1 0. 4 4 52. 1 , 68. 2 86. 20 ,75. 68
R1 74. 36 395. 5 341. 1 209. 2
R2 459. 4 223. 67 332. 47 409. 67 得率极差分析
R3 438. 4 352. 99 298. 59 353. 29
R1 418. 88 403. 98 385. 1 403. 29
R2 391. 45 392. 48 406 408. 62 活力极差分析
R3 373. 15 387. 02 392. 38 371. 57
21112 　影响活力因素分析 　原生质体活力最低为
处理 8 (69. 12 %) ,最高为处理 2 (91. 89 %) ,其余处
理差异不显著 ,多在 80 %～90 %之间。各处理活力
排序 :2 > 1 > 5 > 6 > 7 > 3 > 4 > 9 > 8 (表 2) 。
方差分析结果表明 (表 5) ,处理间差异不显著 ,
相对来说 ,以纤维素酶浓度及酶解时间影响稍大。
据极差分析结果 (表 4) ,利于提高地锦幼叶原生质
体提取活力的最佳因素为 :0. 3 %纤维素酶 ,0. 3 %果
胶酶 ,0. 4 mol·L - 1甘露醇 ,酶解 8 h。但从所提取的
原生质体形态来看 ,低于 0. 4 mol·L - 1甘露醇处理的
原生质体有吸胀现象 ,表明渗透压过低 ,因此适宜的
甘露醇浓度应为 0. 6 mol·L - 1。
表 5 　原生质体提取活力影响因素方差分析
变异来源 Df SS MS F F0. 05
纤维素酶 2 　176. 584 9 　88. 292 44 　 0. 006 449 4. 26
黑胶酶 2 24. 983 51 12. 491 76 0. 000 912
甘露醇 2 37. 517 38 18. 758 69 0. 001 37
酶解时间 2 133. 737 2 66. 868 61 0. 004 884
误差 9 123 215 13 690. 56
总和 17 123 587. 8
342第 3 期 李正红等 :地锦与五叶地锦原生质体分离及培养研究
212 　不同外植体原生质体提取得率比较
相同质量的不同材料间原生质体得率差异极显
著 (表 6) ,以五叶地锦幼叶得率最高 ,达 12. 65 ×106
个·g - 1 ,是得率最低的地锦幼胚愈伤组织 (0. 856 ×
106 个·g - 1)的近 15 倍。
表 6 　不同材料原生质体提取得率比较
材料
五叶地锦
幼叶
地锦
幼叶
五叶地锦
胚乳愈伤
地锦幼胚
愈伤
原生质体得率
×106/ (个·g - 1)
12. 65 5. 7 1. 18 0. 856
图 1 　新提五叶地锦胚乳愈伤组织原生质体 图 2 　原生质体培养 7 d 后开始分裂 图 3 　原生质体培养 14 d 后形成的细胞团
213 　原生质体不同培养方式效果比较
不同材料来源的原生质体在不同培养方式下的
表现有所不同 ,但仅有五叶地锦胚乳愈伤组织来源
的原生质体形成了新的愈伤组织 (图 1～4) ,新愈伤
组织转入固体培养基中继代 10 个月后仍生长旺盛 ,
其余原生质体均先后解体 (表 7) 。
214 　愈伤组织分化培养
对五叶地锦胚乳愈伤组织提取的原生质体形成
的愈伤组织进行分化培养 ,采用多种植物生长调节
剂及组合 ,继代 6～10 次 ,到目前为止均无植株再
生。试验采用的植物生长调节剂及组合如表 8。
图 4 　原生质体培养 40 d 后形成的愈伤组织
表 7 　不同材料来源原生质体在不同培养方式下的表现
培养方式 五叶地锦幼叶 地锦幼叶 五叶地锦胚乳愈伤 地锦幼胚愈伤
液体浅层培养
无分裂 ,30 d
后大量解体
无分裂 ,40 d 左右大量
解体
7 d 后第 1 次分裂 ,14 d 后形成 3 个细
胞左右细胞团 ,后逐渐褐化死亡。
无分裂 ,20 d 后褐化 ,
并开始解体。
固液结合培养
无分裂 ,30 d
后大量解体
无分裂 ,40 d 左右大量
解体
7 d 后第 1 次分裂 ,14 d 后形成 30 个
细胞左右细胞团 ,后逐渐褐化死亡。
无分裂 ,20 d 后褐化 ,
并开始解体。
固体培养
无分裂 ,30 d
后开始解体
10 d 后第1 次分裂 ,40 d
后形成 20 个细胞左右
细胞团 ,其后不再继续
分裂 ,80 d 后大量解体
7 d 后第 1 次分裂 ,14 d 后形成 30 个
细胞左右细胞团 ,40 d 后形成 0. 2 mm
左右愈伤。继代 10 个月后仍生长
盛。
无分裂 ,40 d 后开始解体。
3 　结论与讨论
(1)在酶解 4～12 h 条件下 ,在本试验浓度范围
内 ,纤维素酶、果胶酶及甘露醇三因素中仅纤维素酶
对原生质体提取得率有极显著影响 ,其余因素对原
生质体提取得率及活力均无显著影响。综合原生质
体得率、活力及培养效果 ,适宜地锦幼叶原生质体提
取及培养的酶液组合及处理时间以纤维素酶 0. 5 %、
果胶酶 0. 3 %、甘露醇 0. 6 mol·L - 1、酶解 8 h 为宜。
442 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
表 8 　原生质体形成的愈伤组织分化培养基
编号 培养基 编号 培养基
1 改良 B5 + 62BA0. 5 + NAA0. 05 + 2 % PEG 17 MS + GA3 3. 0
2 改良 B5 + 62BA0. 5 + NAA0. 1 + 4 % PEG 18 MS + GA3 5. 0
3 改良 B5 + 62BA0. 5 + NAA0. 5 + 6 % PEG 19 MS + GA3 7. 0
4 改良 B5 + 62BA1. 0 + NAA0. 05 + 4 % PEG 20 MS + GA3 1. 0
5 改良 B5 + 62BA1. 0 + NAA0. 1 + 6 % PEG 21 MS + GA3 10. 0
6 改良 B5 + 62BA1. 0 + NAA0. 5 + 2 % PEG 22 MS + KT0. 2
7 改良 B5 + 62BA2. 0 + NAA0. 05 + 6 % PEG 23 MS + KT1. 0
8 改良 B5 + 62BA2. 0 + NAA0. 1 + 2 % PEG 24 MS + KT2. 0
9 改良 B5 + 62BA2. 0 + NAA0. 5 + 4 % PEG 25 MS + KT4. 0
10 MS + 62BA0. 5 26 MS + KT1. 0 + NAA0. 2
11 MS + 62BA1. 0 27 MS + ZT1. 0 + NAA0. 1
12 MS + 62BA3. 0 28 MS + ZT1. 0 + NAA0. 2
13 MS + 62BA1. 0 + NAA0. 02 29 MS + ZT2. 0 + NAA0. 2
14 MS + 62BA1. 0 + NAA0. 2 30 MS + ZT4. 0 + NAA0. 2
15 MS + 62BA1. 0 + NAA0. 5 31 MS + ZT6. 0 + NAA0. 2
16 MS + GA3 1. 0 32 MS + ZT8. 0 + NAA0. 2
　　(2)用相同酶液处理相同时间 ,不同材料的原生
质体得率差异较大 ,幼叶得率较高 ,愈伤组织得率较
低 ,可能是愈伤组织含水量较多 ,单位质量所含细胞
数较幼叶为少 ,因此提取愈伤组织原生质体时单位
酶液处理的愈伤组织质量应可有所加大。此外 ,其
它植物原生质体提取的研究[7～9 ]表明 ,不同材料及
其生理状态对原生质体提取得率影响较大 ,因此本
试验的酶液组合在应用时应据实际情况进行调整。
(3)本试验采用的原生质体培养基主要参照于
向荣[10 ]培养酿酒葡萄原生质体的成功配方 ,但是仅
五叶地锦愈伤组织来源的原生质体在固体培养基中
形成新的愈伤组织 ,其它方式培养的不同材料原生
质体均无分裂或仅形成数十个细胞的细胞团后便解
体。用 30 余组配方进行了五叶地锦胚乳愈伤组织
原生质体形成的新愈伤组织的分化培养试验 ,继代
6～10 次后仍无分化迹象。上述结果表明地锦及五
叶地锦原生质体培养及植株再生较为困难。地锦属
植物原生质体培养无形成愈伤组织及再生植株的报
道 ,据同科葡萄属植物原生质体培养研究[7 ] ,葡萄原
生质体培养较为困难 ,从 1974 年开始进行研究 ,直
到 1990 年才从欧洲葡萄 ( Vitis vinifera L. ) 悬浮细胞
来源的原生质体再生了植株 ,到目前为止尚未形成
完善的技术体系 ,再生植株仍具有偶然性 ,品种、材
料年龄及生理状态是主要影响因素 ,成功再生植株
的有 4 个基因型 ,其中 3 个为胚性悬浮细胞系。为
此 ,地锦原生质体培养的进一步研究应着重进行易
再生基因型的选择 ,诱导胚性愈伤组织并建立胚性
悬浮系 ,以悬浮细胞游离原生质体 ,同时还需对培养
基配方作更多选择。
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