全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (4) : 451～455
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0420451205
茶尺蠖核型多角体病毒 ( EoNPV)的 PCR检测方法
及其生物活性研究
张永安 1, 2 , 仲国立 1 , 侯玉霞 13 , 贡玉梅 3 , 曲良建 2 , 王玉珠 2
(1. 中国农业大学理学院 ,北京　100094; 2. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 ,北京　100091;
3. 国家林业局科技发展中心 ,北京　100714)
摘要 :根据茶尺蠖核型多角体病毒 ( EoNPV)多角体蛋白基因建立了 PCR检测方法 ,在茶尺蠖子代卵和蛹内检测到
EoNPV存在 ,灵敏度达到 1 fg,此方法可用于田间施用 EoNPV后茶尺蠖种群带毒检测。PCR方法由于操作简单、检
测灵敏度高、特异性好、重复性好等优点 ,值得应用。利用 EoNPV感染茶尺蠖 2龄幼虫 ,幼虫对 EoNPV的敏感性很
高 ,测得 LC50为 2. 2 ×104 P IB·mL - l , EoNPV感染浓度越高 ,则幼虫死亡越快 ,幼虫死亡时间与感染浓度呈正相关。
关键词 : EoNPV;茶尺蠖 ; PCR检测 ;生物活性
中图分类号 : Q966　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2008203219
基金项目 : 国家科技支撑计划资助 (2006BAD08A1202) ;国家林业局重点项目 (2005 - 09)
作者简介 : 张永安 (1959—) ,男 ,陕西西安人 ,研究员 ,博士生. E2mail: zhangyab@caf. ac. cn3 通讯作者 :侯玉霞 ,女 ,博士. Tel: 010262733824; E2mail: houyuxia@ cau. edu. cn
Applica tion of PCR M ethod for D etecting of the EoNPV in
Ectropis oblique and Its B iolog ica l Activ ity
ZHANG Yong2an1, 2 , ZHONG Guo2li1 , HOU Yu2xia13 , GONG Yu2m ei3 , QU L iang2jian 2 , WANG Yu2zhu 2
(1. College of Science, China Agricultural University, Beijing　100094, China; 2. Research Institute of
Forest Ecology, Environment and Protection, CAF, Beijing　100091, China; 3. Science and Technology
Development Centre, State Forestry Adm inistration, Beijing　100714, China)
Abstract: The polymerase chain reaction ( PCR) method for detecting Ectropis obliqua multip le nuclear polyhedrosis
virus was established with self2designed p rimers according to the sequence of polyhedron gene of EoNPV , and
EoNPV could be detected from the offsp ring, the data showed that the method would allow the detection of about 1
fg, this method could be used to identify EoNPV in field p ractices. The method was simp le with good rep roducibility
and selectivity, and high sensitivity, so deserves to be popularized. An infectivity test of EoNPV against the second
instar larvae of Ectropis oblique was carried out in our laboratory, and LC50 of EoNPV was determ ined as 2. 2 ×104
P IB·mL - 1 , the larva was very sensitive to EoNPV, and it had a higher death rate with higher EoNPV
concentration, and the death time p resented positive correlation with the concentration of EoNPV.
Key words: EoNPV; Ectropis obliqua; PCR detection; biological activity
　　茶尺蠖 ( Ectropis obliqua Prout)是苏、浙、皖等省
茶树 ( Thea sinensis L. )上的主要害虫 ,造成严重的经
济损失 ,多年来主要依赖化学农药防治 ,增加了害虫
抗药性 ,加大了防治成本 ,污染了环境 ,危害了天敌
等。针对茶尺蠖的严重危害和无公害茶叶生产的需
要 ,运用茶尺蠖核型多角体病毒 ( Ectropis obliqua Nu2
clear Polyhedrosis V irus, EoNPV )专一致病作用原
理 ,在 7. 5 ×109 ～15. 0 ×109 P IB·hm - 2的使用剂量
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
下防治茶尺蠖 1～2龄幼虫 ,当代防治达到 98%以
上 ,获得好的防治效果 [ 1 - 4 ]。
EoNPV对茶尺蠖幼虫具有较高致病力 [ 5 - 10 ]。
研究人员对 EoNPV 的生物学、毒性 ,环境因子对
EoNPV的影响以及 EoNPV与 B. t. 的混配进行了研
究 [ 11 - 12 ]。研究了多角体病毒 DNA的限制性内切酶
分析 ,核型多角体病毒蛋白性质 ,核型多角体病毒的
血清学等 [ 13 - 15 ] ,但对 EoNPV病毒在虫体内的动态
变化规律研究较少 , PCR技术是一种微量检测 EoN2
PV变化的技术 ,为了比较准确了解 EoNPV在茶尺
蠖虫体中的动态 ,为茶尺蠖防治提供必要的信息 ,有
必要进行 EoNPV微量检测技术和生物活性的研究。
1　材料与方法
1. 1　EoNPV的分离与纯化
从收集大量人工感染典型发病的茶尺蠖幼虫尸
体中 ,分离提取 EoNPV的粗提液 ,然后经蔗糖梯度
离心获得纯净的 EoNPV。
1. 2　EoNPV电镜观察
1. 2. 1　EoNPV形态观察 　将离心后收集到的 EoN2
PV用适量的无菌水悬浮成溶液 ,涂于干净的载玻片
上 ,自然干燥 ,喷金 , DMS26360 LZ型扫描电镜观察。
1. 2. 2　EoNPV超薄切片制备及电镜观察
①取 EoNPV样品置于 1. 0 mL 的离心管底部 ,
用 2 %戊二醛固定 6 h,然后用磷酸缓冲液 ( pH值
6. 8)清洗 2～3次 ,置于 4 ℃冰箱过夜。
②用 2 %的锇酸固定 1. 5 h,用磷酸缓冲液 (pH
值 6. 8)清洗 2～3次 ,置于 4 ℃冰箱过夜。
③在 4 ℃冰箱中用体积分数 70%、80%、95%的
酒精逐次脱水各 15 m in后 ,再用体积分数 100%的
酒精脱水 2次 ,各 10 m in,丙酮脱水 1次 , 10 m in。
④用环氧树脂 Epon812 浸透包埋 ,于 35、45、
60 ℃中分别聚合 12、24、48 h。
⑤用 ULTRACUT型超薄切片机切片 ,切片厚度
为 50～60 nm ,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色 ,在
JEM1230型透射电镜下观察。
1. 3　EoNPV D NA和茶尺蠖总 D NA的制备
纯净的 EoNPV悬液 ,加等体积碱解液 , 37 ℃水
浴裂解 30～60 m in,然后加入 100 mg·mL - 1的 SDS
至终浓度 10 mg·mL - 1 ,加蛋白酶 K至终浓度 200
μg·mL - 1 , 37 ℃水浴裂解 1 h,加入 1. 0 mol·L - 1
HC I,调 pH值接近蛋白等电点 (pH值 6～7)。用酚
∶氯仿 ∶异戊醇 ( 25∶24∶1)抽提 3次 ,氯仿 ∶异戊醇
(24∶1)抽提 1次 ,取上清液 ,加 3. 0 mol·mL - 1醋酸
钠和预冷乙醇混匀 ,置于 - 20 ℃冰箱 20 m in,离心 ,
留沉淀 ,用 70%乙醇洗涤 ,晾干后溶于适量 TE缓冲
液 (pH值 8. 0)中 , - 20 ℃保存备用。分别取 50粒
茶尺蠖卵、1. 5 g蛹采用液氮研磨 ,提取茶尺蠖总
DNA ,具体方法见 Hughes等方法 [ 16 - 17 ]。
1. 4　EoNPV的 PCR检测方法
1. 4. 1　引物设计及 PCR扩增 根据 EoNPV的多角
体蛋白基因设计特异性引物 :
上游 EF: 5 ’2ATGTATACTCGTACAGTTACAA
CCC23’,
下游 ER: 5’2TTAATACGCAGGTCCTGAATAC2
3’,
以 EoNPV DNA为模板 ,进行 PCR扩增 ,预扩增
DNA片断为 741 bp。
PCR反应体系 (25μL) :
10 ×PCR buffer 3μL
10 mmol·L - 1 dNTP 2μL
10μmol·L - 1上游引物 EF 0. 5μL
10μmol·L - 1下游引物 ER 0. 5μL
1μg·mL - 1模板 0. 5μL
2 U·mL - 1 Taq酶 0. 5μL
H2O 18μL
总体积 25μL
将反应液混匀后 ,按以下条件进行 PCR扩增。
PCR条件如下 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 1 m in,
58 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 1 m in,循环 35次 , 72 ℃
最后延伸 10 m in。PCR反应结束后 ,取 5μLPCR产
物经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测 ,回收纯化。
1. 4. 2 PCR扩增产物克隆及测序 将纯化的 PCR
扩增产物按 pGEM 2Teasy vector试剂盒 (购自 Pro2
mega公司 )的方案进行连接反应。将连接反应物转
化大肠杆菌 DH5α感受态细胞内 ,取 20μL X2gal和
7μL IPTG ( 20% )滴在 LB 平板 (含 50μg·mL - 1
Amp)上 ,将其均匀涂布 ,然后将转化物涂布在 LB平
板 , 37 ℃培养过夜 ,经蓝白斑筛选 ,获得大量克隆。
经 PCR鉴定挑选白色克隆划单菌落 ,放入 50μg·
mL - 1氨苄青霉素 (Amp ) LB液体培养基震荡培养 ,
阳性克隆送到上海生物工程技术有限公司 (生工 )
测序。
1. 4. 3　PCR技术检测 EoNPV 以带毒虫卵、蛹的
茶尺蠖总 DNA为模板 ,取 0. 5μLDNA进行 PCR扩
增 , PCR扩增条件同上。
254
第 4期 张永安等 :茶尺蠖核型多角体病毒 ( EoNPV)的 PCR检测方法及其生物活性研究
1. 4. 4　带毒幼虫的卵和蛹的获得 　以 LC50浓度感
染茶尺蠖 3龄幼虫 ,单独收集蛹 ,使其羽化产卵 ,卵
不进行消毒。随机取 50粒卵在 4 ℃下保存 ,其他卵
于 25 ℃养虫室孵化 ,孵化后单头单瓶饲养至化蛹 ,
随机取 20头蛹用于 PCR检测。
1. 5　EoNPV感染茶尺蠖幼虫的生物活性
将病毒稀释 1. 2 ×107、1. 2 ×106、1. 2 ×105、1. 2
×104 P IB·mL - 1 4个浓度 ,每组实验虫数为 30头 ,
每个处理重复 3次 ,设置空白对照。在无菌操作下
对饲料接毒 ,每个养虫杯人工饲料表面滴入 300 uL
的药液 ,阴干后挑取茶尺蠖 2龄幼虫 30头放入。饲
料食进 72 h后更换无病毒新鲜的人工饲料。待幼
虫开始死亡后 ,每日定时检查记录死虫数 ,并取出虫
尸。试验完毕后 ,计算逐日死亡率。用 SPSS统计软
件计算出致死浓度 LC50和半致死天数 LT50 ,比较
EoNPV对茶尺蠖幼虫的敏感性及其死亡速度 [ 18 - 19 ]。
2　结果与分析
2. 1　EoNPV的形态特征研究
扫描电镜观察到 :茶尺蠖核型多角体病毒多角
体为不规则的多面体 ,表面呈皱纹 ,高低不平 ,有的
还出现较深的沟痕和凹窝的结构。多角体大小不一
致 ,其直径约为 0. 8 ～ 1. 5 μm , 平均直径约为
1. 2μm,如图 1所示。
图 1　茶尺蠖核型多角体病毒多角体扫描电镜图 (20 000 ×)
透射电镜观察表明 :该 EoNPV病毒多角体切片
在透射电镜下呈不规则形状 ,多角包涵体中有多个
病毒粒子 ,在多角体中零散分布 ,排列方式无规律 ,
粒子呈杆状 ,大小约 60 ×200 nm ,为单核衣壳类型
( SNPV ) ,如图 2所示。
图 2　多角体超薄切片的透射电镜图 (单核衣壳类型 ) (60 000 ×)
2. 2　EoNPV基因组 D NA PCR扩增和测序
根据 EoNPV的多角体蛋白基因设计特异性引
物 EF和 ER,以 EoNPV 基因组 DNA 为模板 ,进行
PCR扩增。将 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,
发现 EoNPV DNA序列的扩增产物有一条清晰、特异
的 DNA条带 (图 3)。扩增条带在 700 bp和 800 bp
之间 ,与预期 741 bp结果相符。扩增产物经过回收
并连接到 pGEM 2T easy载体 ,然后转化到大肠杆菌
DH5α中。通过菌落 PCR法筛选重组的阳性克隆
后 ,提取阳性克隆的质粒 DNA,鉴定目的片段插入
的结果 ,然后送到上海生工进行测序。所得 PCR扩
增 DNA片断序列测序结果证实为 741 bp,与理论
EoNPV的多角体蛋白基因相同 ,所以此方法可以用
于 EoNPV的微量检测。
图 3　EoNPV基因组 DNA PCR扩增图谱
(M: Marker Ⅲ; 1、2: EoNPV基因组 DNA PCR结果 )
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
2. 3　PCR检测 EoNPV基因组 D NA敏感性的研究
将纯化的 EoN PV 基因组 DNA 浓度调整为
1μg·mL - 1 , 等比稀释为 1 ng·mL - 1、1 pg·
mL - 1、100 fg·mL - 1、10 fg·mL - 1、1 fg·mL - 1 ,
各取 0. 5μL EoN PV DNA做模板进行 PCR扩增 ,
结果如图 4。从图 4看到 ,当模板浓度为 1 fg·
mL - 1时 ,仍可见清晰扩增条带 ,其检测水平可以
达到 1 fg·mL - 1。
图 4　PCR检测 EoNPV基因组 DNA敏感性
(M: Marker Ⅴ; 1: 1 fg·mL - 1 ; 2: 10 fg·mL - 1 ;
3: 100 fg·mL - 1 ; 4: 1 pg·mL - 1 ; 5: 1 ng·mL - 1 )
2. 4　PCR技术检测带毒茶尺蠖虫卵、蛹研究
分别以带毒茶尺蠖卵、蛹总 DNA作为模板进行
PCR 扩增 , PCR 产物电泳结果如图 5 所示。在
700 bp和 800 bp之间有一清晰的、特异条带 ,健康虫
的总 DNA则没有扩增出任何条带 ,这说明检测设计
是合理的、可行的。
图 5　带毒卵、蛹总 DNA的 PCR扩增图谱
( M: MarkerⅤ; 1: 卵 ; 2: 蛹 ; CK - : 阴性对照 ; CK + : 阳性对照 )
2. 5　EoNPV生物活性研究
经 EoNPV感染茶尺蠖二龄幼虫后 ,死虫表现为
核型多角体病毒致死症状 ,死虫组织液涂片可见大
量病毒多角体。
研究结果表明 ,茶尺蠖二龄幼虫对 EoNPV的敏
感性很高 ,其 LC50为 2. 2 ×104 P IB·mL - 1 ,见表 1;
当 EoNPV浓度为 1. 2 ×107 P IB ·mL - 1时 , LT50为
5. 93 d,由此得出 EoNPV感染茶尺蠖二龄幼虫浓度
越高 ,幼虫死亡越快 ,幼虫死亡时间与感染浓度呈正
相关 ,见表 2所示。
结果表明 ,幼虫死亡时间与感染浓度呈正相关 ,
感染浓度越高 ,则幼虫死亡越快。
表 1　EoM NPV感染茶尺蠖二龄幼虫的 LC50测定结果
虫龄 回归方程 相关系数 LC50 / ( P IB·mL - 1 ) 95 %置信限 / ( P IB·mL - 1 )
二龄 Y = - 4. 667 52 + 1. 074 05x 0. 966 2. 2 ×104 1. 02 ×104 ～4. 06 ×104
表 2　EoM NPV感染茶尺蠖二龄幼虫的 L T50测定结果
浓度 / ( P IB·mL - 1 ) 回归方程 相关系数 LT50 / d 95% 置信限 /d
1. 2 ×107 y = - 4. 149 81 + 5. 365 58x 0. 958 5. 93 5. 34～6. 53
1. 2 ×106 y = - 4. 875 42 + 5. 803 74x 0. 978 6. 91 6. 29～7. 52
1. 2 ×105 y = - 4. 314 41 + 5. 123 03x 0. 965 6. 95 6. 30～7. 67
1. 2 ×104 y = - 2. 897 95 + 2. 722 05x 0. 953 11. 60 9. 60～16. 97
3　结论与讨论
(1) 通过光学显微镜观察手段检测 NPV ,其最
低检测水平为 106 P IB ·mL - 1 [ 7 ] ; DNA杂交法最低
检测水平可以达到 0. 1 ng(20～5 000 P IB·mL - 1 )。
(2) 本文根据 EoNPV 多角体蛋白基因建立
PCR检测体系 ,检测到 EoNPV存在子代卵和蛹内 ,
灵敏度达到 1 fg,此方法可用于田间施用 EoNPV后
茶尺蠖种群带毒检测。PCR法由于操作简单、检测
灵敏度高、特异性好、重复性好等优点 ,此方法值得
应用。
(3)应用 PCR技术可以比较灵敏地检测到病毒
在昆虫体内的存在 ,但还无法检测到昆虫所携带的
病毒量 ,也无法通过该项技术准确掌握病毒在昆虫
种群中的动态规律 ,发展更加灵敏的病毒检测技术
对充分发挥病毒的作用非常重要。
(4) EoNPV对茶尺蠖非常敏感 ,特别对 3龄前
幼虫 ,所以在应用病毒防治茶尺蠖时宜在 3龄前喷
洒 ,且喷洒浓度不低于 1 ×106 P IB·mL - 1 ;另外建议
病毒与 B. t. 等其他生物农药混配使用 ,以减少茶尺
蠖造成的经济损失。
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第 4期 张永安等 :茶尺蠖核型多角体病毒 ( EoNPV)的 PCR检测方法及其生物活性研究
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