全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (2) : 224～229
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0220224206
黑松花粉体外萌发与花粉管生长的研究
李国平 1, 2 , 黄群策 13 , 杨鹭生 2 , 秦广雍 1
(1. 郑州大学离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州　450052; 2. 莆田学院环境与生命科学系 ,福建 莆田　351100)
摘要 :应用荧光标记和激光扫描共聚焦显微镜术研究了黑松花粉和花粉管的形态结构 ,结果表明 :黑松成熟花粉含
2个退化的原叶细胞、1个生殖细胞和 1个管细胞 ;花粉水合 12 h后才开始萌发 ,花粉萌发后管细胞核移动进入花粉
管内 ,而生殖细胞仍留在花粉粒内 ;伸长的花粉管可分淀粉粒区和透明区 ;花粉管内原生质的流动呈喷泉式 ;花粉管
壁具纤维素层 ;年青的花粉管壁有胼胝质沉积 ,而较老的花粉管壁不具胼胝质层 ,花粉管内亦不具胼胝质塞 ;花粉管
易于形成分枝 ,培养基中蔗糖浓度与分枝的形成有关 ;培养基中高浓度蔗糖可抑制花粉管的伸长。裸子植物在花粉
结构、花粉萌发和花粉管的形态结构方面与被子植物存在较大差异。
关键词 :裸子植物 ;黑松 ;花粉 ;花粉管
中图分类号 : S791. 256 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006206208
基金项目 : 福建省自然科学基金计划资助项目 (B0610031) ;福建省莆田市科技计划项目 (2006N17)
作者简介 : 李国平 (1966—) ,男 ,副教授 ,博士生 ,主要从事植物生殖生物学与离子束植物生物技术研究.3 通讯作者
In V itro Pollen Germ ina tion and Pollen Tube Growth of P inus thunberg ii
L I Guo2ping1, 2 , HUANG Qun2ce1 , YANG Lu2sheng2 , Q IN Guang2yong1
(1. Provincial Key Laboratory of Ion Beam B io2engineering, Zhengzhou University, Zhengzhou　450052, He’nan, China;
2. Department of Environment and L ife Science, Putian University, Putian　351100, Fujian, China)
Abstract: The organization of pollen and pollen tubes of P inus thunberg ii was studied by using a confocal laser scan2
ning m icroscope after fluorescence labeling. A P inus thunberg ii pollen was 42celled pollen with two degenerated p ro2
thallial cells, one generative cell and one tube cell. In culture, pollen germ ination occurred after app roximately 12
h of hydration. During tube growth, the tube cell nucleusmoved into the elongating tube, but the generative cells re2
mained within the pollen grain. There are two distinct zones in elongating pollen tubes. One began in the pollen and
extended towards the pollen tube tip , containing abounding amylop lasts. The other zone was the clear zone lacking
amylop lasts at the elongating pollen tube tip. The cytop lasm ic2stream ing type in the tube cellwas a regular fountain2
like pattern, with organelles moving towards the tip in the center of the tube and away from the tip along the cell
cortex. Fluorescence m icroscopy indicated that the pollen tube wall contained cellulose m icrofibrils and, callose was
p resent in the younger pollen tubes, but disappeared from the older tubes. No callose p lug was detected within the
pollen tube. The pollen tube generally developed two to six branches. The sucrose concentration in culture medium
affected the formation of tube branching and the growth rate of tubes to a great extent. The p resent study suggested
that the development and cellular organization of gymnosperm s pollen tubes were considerably different from those of
angiosperm pollen tubes.
Key words: gymnosperm s; P inus thunberg ii; pollen; pollen tube
第 2期 李国平等 :黑松花粉体外萌发与花粉管生长的研究
在植物界中 ,裸子植物与被子植物均可产生花
粉 ,以花粉管为通道输送精子 ,完成受精过程 [ 1. 2 ]。
被子植物的花粉落在柱头上萌发 ,花粉管穿越花柱
到达胚珠 ,受精作用为双受精 ;而裸子植物的胚珠裸
露 ,传粉时花粉直达胚珠 ,花粉在珠孔室内萌发 ,除
买麻藤类外 [ 3 ] ,受精作用为单受精。裸子植物的有
性生殖过程代表一种较原始的有性生殖方式 ,研究
裸子植物的花粉和花粉管发育对于了解植物界有性
生殖方式的这一重要进化阶段和雄配子体发育的多
样性具有重要意义。
花粉管的生长与根毛、苔藓及蕨类植物的原丝
体、真菌菌丝及动物神经轴突细胞的生长相似 ,是一
种典型的极性顶端生长 ,即生长部位仅限于花粉管
的顶端区域。由于花粉管便于培养和离体操作 ,一
直是研究细胞极性生长、细胞间相互作用以及信号
传导等细胞学问题的理想模式系统。关于花粉萌发
和花粉管顶端生长的研究已有很多报道 ,但多数集
中在被子植物方面 [ 4～6 ]。裸子植物在进化上较被子
植物原始 ,裸子植物的花粉发育、传粉和受精过程有
别于被子植物的 [ 7 ] ,目前对于裸子植物花粉萌发和
花粉管生长的研究较少。
黑松 ( P inus thunberg ii Parl. ) ,别名日本黑松 ,为
松科松属常绿乔木 ,原产于日本和朝鲜 ,我国东南沿
海、江苏、浙江、安徽、河南及辽东半岛等地均有栽
培 [ 8 ]。本研究以黑松花粉为材料 ,应用荧光染色和
激光扫描共聚焦显微镜术研究其花粉管的形态结构
和生长特点 ,并与被子植物的进行比较 ,为揭示裸子
植物花粉管顶端生长机制提供资料。
1　材料和方法
1. 1　花粉采集与保存
2005年 4月中上旬黑松花粉散发期 ,在河南郑
州市滨河公园内人工栽培的成熟黑松树上采集刚开
始散粉的雄球花 ,置室内自然干燥 24 h,让花粉散
出。收集的花粉置 - 20 ℃冰箱保存。
1. 2　花粉与花粉管形态结构的观察
2005年 6 月 , 花粉培养于含 0. 01%硼酸 +
0. 01%氯化钙 + 0. 25%蔗糖的液体培养基中 , 28 ℃
下振荡培养 ,定时取样并用配置有 Leica DM IRE2研
究型电动倒置显微镜的 Leica TCS2SP2型激光扫描
共聚焦显微镜 ( laser scanning confocal m icroscope,
LSCM )观察花粉与花粉管形态结构 ,方法为 :萌发花
粉不经固定与染色 ,直接制成水装片用 LSCM 的透
射光模式观察活体花粉管顶端原生质流动情况 ;萌
发花粉经 4%戊二醛固定 , 10μg·mL - 1 DAP I( 4 ’, 62
diam idino222phenylindole, Sigma产品 )染色 , LSCM下
UV激发以显示细胞核移动情况 , LSCM 下 488 nm
激发以显示花粉和花粉管的整体形态结构 ;萌发花
粉经 4%多聚甲醛固定 , PBS (pH值 7. 2)洗 3次 ,以
0. 01%荧光增白剂 ( Fluorescent B rightener 28, Sigma
产品 )染色 , LSCM下 UV激发观察细胞壁纤维素分
布 ,以 0. 05%水溶性苯胺篮 (0. 15 mol·L - 1 K2 HPO4
缓冲液配制 , pH值 8. 2)染色 , LSCM 下 UV激发观
察细胞壁胼胝质分布。上述实验以不进行荧光染色
过程作为对照。
1. 3　蔗糖浓度对花粉萌发与花粉管生长的影响
2005年 10 月 ,花粉培养于含 0. 01%硼酸 +
0. 01%氯化钙的液体培养基中 ,分别附加 0. 00%、
0. 10%、0. 25%、0. 50%、1. 00%、5. 00%、10. 00%蔗
糖 , 28 ℃下振荡培养 , 72 h后以 4%戊二醛固定并检
查花粉萌发率、分枝花粉管的百分率、花粉管的长度
以及花粉管生长速率 ,重复 3次。检查花粉萌发率
时 ,每处理至少观察 5个以上视野 ,统计花粉总数不
少于 300个。花粉管长度大于花粉粒体高的被视为
萌发花粉。花粉萌发率 =萌发花粉数 /花粉粒总数
×100%。在统计花粉萌发率时 ,同时统计具分枝花
粉管的百分率。检查花粉管的长宽度时 ,每处理至
少随机测量 25个花粉管。应用 SPSS统计软件对实
验结果进行单因素方差分析。
把在含 5%蔗糖的培养基中生长的花粉管以
DAP I染色 , LSCM下 488 nm激发以观察花粉管的各
种分枝情况。
2　结果与分析
2. 1　黑松花粉与花粉管的形态结构
黑松成熟花粉为 4 2细胞花粉 ,包含 2个退化
原叶细胞、1个生殖细胞和 1个管细胞 (图版 Ⅰ,
1 ) 。在成熟花粉中 ,管细胞占据花粉粒大部分面
积 ,生殖细胞呈椭圆型 ,具 1个较大的扁圆形细
胞核 , 2个原叶细胞已退化成线状。花粉粒中管
细胞核和生殖细胞核见图版 Ⅰ, 2。黑松花粉细
胞壁由内层和外层组成 ,细胞壁外层又可分为外
壁内层和外壁外层。黑松花粉具 2个气囊 ,气囊
由外壁外层向外扩张而成。
522
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
图版Ⅰ　黑松花粉与花粉管形态结构的激光扫描共聚焦显微镜观察
图版说明 : 1. 黑松成熟花粉含 2个退化原叶细胞 ( PC)、1个生殖细胞 ( GC)和 1个管细胞 ( TC) (DAP I染色 , 488 nm激光激发 ) ; 2. 花粉管细
胞核 ( TN)和生殖细胞核 ( GN) (DAP I染色 , UV激光激发 ) ; 3～4. 花粉管分淀粉粒区和透明区 ,黑线示顶端透明区 (DAP I染色 , LSCM透射光
扫描图像 ) ; 5～6. 花粉萌发后管细胞核移动进入花粉管内 ,而生殖细胞仍留在花粉粒内 (图 5为 488 nm激光扫描图像 ,图 6为 UV激光扫描
图像 ) ; 7. 萌发后 24 h花粉管壁具胼胝质 (水溶性苯胺蓝染色 , UV激光激发 ) ; 8. 萌发后 36 h花粉管壁不具胼胝质 ,仅与长花粉管相对端的
略向外突出的花粉壁仍具胼胝质荧光 (水溶性苯胺蓝染色 , UV激光激发 ) ; 9. 为图 8萌发花粉的 LSCM透射光扫描图像 ; 10. 示花粉管壁具纤
维素层 ,箭头指示花粉管顶端区域的荧光较弱 (荧光增白剂染色 , UV激光激发 ) ; 11～15. 花粉管生长过程中出现的几种分枝形式 (DAP I染
色 , 488 nm激光激发 )。
622
第 2期 李国平等 :黑松花粉体外萌发与花粉管生长的研究
　　黑松花粉在培养基中至少培养 12 h后才开始
萌发。花粉萌发时 ,花粉内壁突出位于两气囊间的
萌发孔并延伸成花粉管。伸长的花粉管可分为 2个
明显的区 ,即位于花粉管顶端的不含大淀粉粒的透
明区和其后的含淀粉粒区 (图版 Ⅰ, 3、4)。透明区
是动态的 ,长约 15～45μm。处于生长的花粉管透
明区内可见原生质流动现象 ,通过原生质中颗粒的
移动路线判断其原生质流动呈喷泉式 ,即细胞质从
花粉管中央流向顶端 ,然后再从花粉管两侧向后返
回。花粉萌发后 ,管细胞核进入花粉管 ,而生殖细胞
保留在花粉粒内。图版 Ⅰ, 5、6显示萌发花粉中管
细胞核和生殖细胞核的位置 ,管细胞核一般位于透
明区和淀粉粒区的交界处。在人工培养条件下 ,未
观察到生殖细胞进入花粉管的现象 ,也未观察到生
殖细胞分裂为体细胞和柄细胞的过程。
水溶性苯胺篮染色结果表明 ,年青的花粉管壁
上具有胼胝质分布 (图版 Ⅰ, 7) ,而随着花粉管的生
长 ,老花粉管壁上的胼胝质层消失 (图版 Ⅰ, 8、9)。
花粉管中未发现与被子植物相似的胼胝质塞。
荧光增白剂染色结果表明 ,伸长的花粉管壁具
发达的纤维素层 ,花粉管顶端的纤维素荧光比其余
部分的弱 ,而花粉壁不具纤维素荧光或荧光较弱 (图
版 Ⅰ, 10)。
2. 2　蔗糖浓度对花粉萌发与花粉管生长的影响
黑松花粉在不同蔗糖浓度的培养基中萌发和生
长的结果见表 1。蔗糖浓度对黑松花粉萌发和花粉
管生长的影响突出表现在 : ( 1)黑松花粉可在无蔗
糖的培养基中萌发 ,但萌发率较低 ,显著低于其它添
加蔗糖的处理 ( p < 0. 05)。在预备实验中发现 ,黑松
花粉在蒸馏水中也能萌发。可见 ,黑松花粉易于人
工培养。 (2)蔗糖浓度从 0. 10%提高到 0. 50% ,花
粉萌发率和花粉管伸长速率显著提高 ;但随着蔗糖
浓度从 0. 50%提高到 10. 00% ,花粉萌发率无差异 ,
而花粉管长度和伸长速率递减 ,特别是在 10%蔗糖
培养基中的花粉管长度显著低于其它处理。可见 ,
高浓度的蔗糖 (10% )不影响花粉的萌发 ,但抑制了
花粉管的生长。 (3)培养黑松花粉的适宜蔗糖浓度
为 0. 50% ～1. 00%。 (4)蔗糖浓度对花粉管的分枝
形成有较大影响。在无蔗糖或蔗糖浓度较低时 ,黑
松花粉管几乎不形成分枝 ;随着蔗糖浓度从 0. 25%
提高到 5. 00% ,具分枝花粉管的频率也递增 ;可见 ,
在一定范围内 ,培养基中蔗糖浓度促进黑松花粉管
形成分枝 ;但是 ,在 10. 00%蔗糖的培养基中不见分
枝花粉管 ;可见 ,高浓度的蔗糖 ( 10% )不仅抑制了
花粉管的伸长 ,也抑制了花粉管分枝的形成。
易于形成分枝花粉管是黑松区别于被子植物花
粉管生长的一个显著特征 ,图版 Ⅰ, 11～15显示了
在 5. 00%蔗糖的培养基中观察到的几种花粉管分
枝类型。
表 1　蔗糖浓度对黑松花粉萌发与花粉管生长的影响
蔗糖浓度 /% 萌发率 /% 花粉管长 /μm 花粉管生长速率 / (μm·h - 1 ) 分枝花粉管 /%
0. 00 21. 68 ± 3. 99 c 74. 38 ±14. 24 cd 1. 24 ±0. 06 cd 0. 00
0. 10 38. 36 ± 6. 52 b 85. 45 ±33. 38 c 1. 42 ±0. 46 c 0. 39 ±0. 07 d
0. 25 42. 33 ± 7. 26 b 88. 70 ±34. 68 c 1. 48 ±0. 48 c 2. 70 ±0. 85 c
0. 50 69. 72 ± 9. 16 a 139. 11 ±44. 32 a 2. 32 ±0. 62 a 11. 70 ±0. 90 b
1. 00 79. 12 ± 1. 73 a 132. 10 ±39. 68 ab 2. 20 ±0. 13 ab 17. 05 ±2. 92 b
5. 00 76. 98 ± 6. 68 a 115. 17 ±38. 70 b 1. 92 ±0. 53 b 30. 87 ±4. 17 a
10. 00 76. 38 ±10. 37 a 64. 81 ±24. 72 d 1. 08 ±0. 34 d 0. 00
　　注 :同列数据后面字母不相同者 ,表示差异显著 ( P < 0. 05)。
3　结论与讨论
应用激光扫描共聚焦显微镜术研究黑松花粉体
外萌发和花粉管生长特征 ,结果表明 :黑松在花粉结
构、萌发过程和花粉管生长等方面与被子植物有较
大的差异。
黑松成熟花粉含有 4个细胞 ,松杉类植物中油
杉属 ( Keteleeria Carr. ) [ 9 ]、雪松属 ( Cedrus Trew ) [ 10 ]
的成熟花粉含有 5个细胞 ,但松科银杉属 ( Cathaya
Chun et Kuang)在 32细胞阶段传粉 [ 11 ]。被子植物的
成熟花粉为 22细胞或 32细胞。实际上 ,黑松成熟花
粉中也仅含 2个完整细胞 , 2个原叶细胞退化仅留
痕迹。吕世友 [ 12 ] 研究表明 , 云杉 ( P icea aspera ta
Mast. )和油松 ( P inus tabu laeform is Carr. )花粉发育
过程中 , 2个原叶细胞的退化是一种典型的细胞程
序性死亡 (p rogrammed cell death, PCD ) ,并认为具原
叶细胞的松杉类植物花粉是研究植物 PCD较为理
想的天然模式系统。作者认为 ,黑松花粉发育过程
722
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
中 2 个原叶细胞的退化也是细胞程序性死亡的
结果。
黑松花粉水合 12 h后萌发 ,花粉管生长速率
1. 1～2. 3μm·h - 1。花粉萌发慢、花粉管伸长慢是
裸子植物花粉管生长的普遍特征 [ 13～15 ]。松属植物
从传粉至受精作用完成要经历 1年多时间 [ 7 ]。裸子
植物花粉管生长慢可能与下列因素有关 :花粉含水
量低 ,花粉粒中缺乏多聚核糖体 ,花粉萌发时需要由
珠孔、珠心或雌配子体分泌的促进因子 ,花粉管壁存
在酸性果胶质和胼胝质层以及花粉管伸长时对一些
蛋白质合成的依赖 [ 16 ]。被子植物花粉萌发与花粉
管生长均较快 ,如玉米花粉在其丝状花柱上 5 m in
后即可萌发 ,花粉管以 1 cm·h - 1的速度伸长 [ 17 ]。
黑松花粉管顶端为透明区 ,其后为淀粉粒区 ,这
种分区结构也在其它裸子植物花粉管中观察
到 [ 13～16 ]。被子植物典型的花粉管结构分成 5个区 :
即顶端生长区、光滑内质网区、粗糙内质网区、液泡
区和退化区 [ 18 ]。
黑松花粉管原生质流动呈喷泉式 ,观察结果与
欧洲赤松 ( P inus sy lvestris L inn. )和欧洲云杉 ( P icea
abies (L. ) Karst. )的类似 [ 13, 19 ]。在被子植物花粉管
中细胞质呈典型的回喷泉式流动状态 ,即细胞质从
花粉 管 两 侧 流 向 顶 端 , 然 后 再 从 中 央 向 后
返回 [ 20, 21 ]。
通过荧光增白剂染色鉴定 ,黑松花粉管壁具纤
维素层。欧洲赤松和欧洲云杉花粉管壁中也存在纤
维素 ,纤维素微纤丝的沉积方向与被子植物的类似 ,
但是其顶端的纤维素微纤丝密度比被子植物的
高 [ 22, 23 ]。裸子植物花粉管顶端具较发达的纤维素
层可能对花粉管的顶端生长有限制作用 ,同时也加
强了细胞壁的保护作用 ,这个结构特点与裸子植物
花粉管停留在珠孔室较长时间、花粉管生长缓慢的
特性相适应。
通过苯胺蓝鉴定 ,可观察到黑松新生的花粉管
壁顶端有胼胝质沉积现象 ,相对较老的花粉管则无
胼胝质 ;未观察到与被子植物相似的胼胝质塞。裸
子植物花粉管缺乏胼胝质塞与其花粉萌发后生殖细
胞未进入花粉管的现象相吻合。欧洲赤松花粉管壁
的胼胝质沉积现象与黑松的相似 [ 22 ]。通常被子植
物花粉管壁可分为两层结构 ,即外层以果胶、纤维素
为主 ,内层则以胼胝质为主 [ 2, 5 ]。在被子植物花粉
管生长过程中还有胼胝质塞的形成 ,并几乎以相等
的间距产生 [ 24 ]。
黑松花粉离体培养中易于形成分枝花粉管 ,分
枝的形成与蔗糖浓度有关 ,其有关机理有待进一步
研究。形成分枝花粉管是裸子植物的一个普遍特
征 ,分枝花粉管可能在花粉管伸长过程中起到营养
吸收和铆钉花粉管的作用 [ 14, 16 ]。被子植物的花粉
管一般为单管或不出现分枝 ,但在锦葵科、葫芦科和
桔梗科等的一些植物花粉 ,可长出多条花粉管 ,另有
一些植物的花粉管可以分枝 ,如菠菜 [ 25 ]。
黑松花粉粒中贮存有淀粉粒 ,可在无蔗糖的培
养基中萌发 ,添加适当浓度的蔗糖有利于花粉萌发
和花粉管生长 ,但高浓度蔗糖抑制花粉管的伸长。
花粉管的脉冲式生长是由膨压决定的 [ 26 ] ,培养基中
蔗糖浓度可能与花粉管中的膨压大小有关 ,从而影
响花粉管的伸长 ,对此 ,尚需进一步研究。
总之 ,裸子植物的花粉管发育过程具有一些独
特的特征 ,可能代表着一种有别于被子植物的顶端
生长模式。关于裸子植物花粉管顶端生长机制的研
究报道相对有限 ,且主要来自美国 Charleston学院生
物系的 Lazzaro实验室以欧洲云杉为模式材料进行
了初步研究。当前 ,这领域的研究刚刚开始 ,涉及的
对象有限 ,有必要对更多的裸子植物进行研究 ,以便
揭示其普遍规律。黑松花粉易于人工培养 ,花粉量
大 ,耐贮存 ,是研究裸子植物花粉管顶端生长机制的
理想实验系统。
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