全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿袁圆远渊源冤院源怨源 缘园园云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤园源鄄园源怨源鄄园苑
泡桐丛枝植原体 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源编码蛋白的
抗体制备和表达分析
耿显胜袁 田国忠袁 任争光袁 宋传生袁 林彩丽鄢
渊中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所袁国家林业局森林保护学重点实验室袁北京摇 员园园园怨员冤
收稿日期院 圆园员猿鄄园猿鄄圆缘
基金项目院 国家自然科学基金面上项目野泡桐丛枝植原体质粒蛋白 责圆猿 及寄主互作蛋白功能研究冶渊猿员员苑园远圆冤
作者简介院 耿显胜渊员怨愿圆要冤袁男袁河南信阳人袁博士袁主要从事森林保护方面的工作援
鄢 通讯作者院助理研究员袁主要从事植物病原分子互作援 栽藻造院 园员园鄄远圆愿愿怨圆愿源援 耘鄄皂葬蚤造院 造蚤灶糟造岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶
摘要院以感病泡桐组培苗提取的 阅晕粤为模板袁采用 孕悦砸方法扩增 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 的部分片段遥 将目的片段克隆
到原核表达载体 责郧耘载鄄源栽鄄猿袁重组质粒 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 转化大肠杆菌 砸燥泽泽藻贼葬渊阅耘猿冤菌株遥 陨孕栽郧诱导表达袁分子量约
为 猿愿 噪阅葬的含 郧杂栽标签的融合蛋白得到表达遥 切胶回收目的蛋白袁免疫大白兔制备抗血清遥 间接 耘蕴陨杂粤测定抗血
清的效价约为 员 颐 源 园怨远袁免疫印迹实验显示院抗血清能够与原核表达的 郧杂栽 融合蛋白发生特异的免疫反应袁与
责孕葬宰月晕赠鄄员鄄韵砸云缘 的原核表达蛋白无明显的交叉反应遥 利用制备的抗血清袁在感病泡桐饲毒的茶翅蝽中检测到分
子量约为 员愿 噪阅葬的蛋白条带袁而在无菌茶翅蝽和感病泡桐组培苗中均未检测到袁表明 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 在饲毒的
茶翅蝽中表达袁而在感病泡桐组培苗中未表达或表达量低于检测水平遥 据此推测袁该基因参与茶翅蝽传播泡桐丛枝
植原体遥
关键词院茶翅蝽曰多克隆抗体曰昆虫传播曰植原体
中图分类号院杂苑员愿援 愿 文献标识码院粤
孕则藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 孕燥造赠糟造燥灶葬造 粤灶贼蚤遭燥凿赠 粤早葬蚤灶泽贼 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 燥枣
孕葬怎造燥憎灶蚤葬 宰蚤贼糟澡藻泽爷 鄄遭则燥燥皂 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬 葬灶凿 陨贼泽 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 粤灶葬造赠泽蚤泽
郧耘晕郧 载蚤葬灶鄄泽澡藻灶早袁 栽陨粤晕 郧怎燥鄄扎澡燥灶早袁 砸耘晕 在澡藻灶早鄄早怎葬灶早袁 杂韵晕郧 悦澡怎葬灶鄄泽澡藻灶早袁 蕴陨晕 悦葬蚤鄄造蚤
渊砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼 耘糟燥造燥早赠袁 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼 葬灶凿 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 云燥则藻泽贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁
悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽澡藻 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 憎葬泽 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则燥皂 早藻灶燥皂藻 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 枣则燥皂 蚤灶枣藻糟贼藻凿 责葬怎造燥憎灶蚤葬 责造葬灶贼造藻贼泽 遭赠
孕悦砸援 栽澡藻 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 阅晕粤 枣则葬早皂藻灶贼泽 憎藻则藻 蚤灶泽藻则贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责郧耘载鄄源栽鄄猿援 栽澡藻 则藻糟燥皂遭蚤鄄
灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 憎葬泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 砸燥泽泽藻贼葬 渊阅耘猿冤 泽贼则葬蚤灶援 栽澡藻 猿愿 噪阅葬 郧杂栽鄄
贼葬早早藻凿 责圆韵砸云源 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼造赠 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 砸燥泽泽藻贼葬 渊阅耘猿冤 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧援 栽澡藻 枣怎泽蚤燥灶 责则燥鄄
贼藻蚤灶 憎葬泽 责怎则蚤枣蚤藻凿 葬灶凿 蚤灶躁藻糟贼藻凿 蚤灶贼燥 葬 则葬遭遭蚤贼 贼燥 则葬蚤泽藻 葬灶贼蚤泽藻则怎皂援 栽澡藻 贼蚤贼藻则 燥枣 贼澡藻 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 憎葬泽 员颐 源 园怨远 凿藻贼藻则皂蚤灶藻凿 遭赠
蚤灶凿蚤则藻糟贼 耘蕴陨杂粤援 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠 糟燥怎造凿 则藻葬糟贼 憎蚤贼澡 郧杂栽鄄贼葬早早藻凿
责圆韵砸云源 责则燥贼藻蚤灶 遭怎贼 澡葬凿 灶燥 则藻葬糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 责孕葬宰月晕赠鄄员鄄韵砸云缘 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 耘援 糟燥造蚤援 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽 葬造泽燥
则藻增藻葬造藻凿 葬 泽责藻糟蚤枣蚤糟员愿 噪阅葬 责则燥贼藻蚤灶 遭葬灶凿 蚤灶 匀葬造赠燥皂燥则责澡葬 澡葬造赠泽 渊杂贼覽造冤 藻曾责燥泽怎则藻 贼燥 孕葬宰月鄄蚤灶枣藻糟贼藻凿 责葬怎造燥憎灶蚤葬袁 遭怎贼 灶燥贼
蚤灶 灶燥灶鄄蚤灶枣藻糟贼藻凿 匀援 澡葬造赠泽 葬灶凿 孕葬宰月鄄蚤灶枣藻糟贼藻凿 责葬怎造燥憎灶蚤葬援 陨贼 憎葬泽 蚤灶枣藻则则藻凿 贼澡葬贼 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 皂蚤早澡贼 遭藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶
贼澡藻 贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶 燥枣 匀援 澡葬造赠泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 匀葬造赠燥皂燥则责澡葬 澡葬造赠泽 渊杂贼覽造冤曰 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠曰 蚤灶泽藻糟贼 贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶曰 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬
第 源 期 耿显胜等院泡桐丛枝植原体 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 编码蛋白的抗体制备和表达分析
植原体是一类缺乏细胞壁的植物病原细菌袁它
造成世界范围内 苑园园 多种植物的病害咱员暂 遥 由植原
体引起的泡桐丛枝病渊 责葬怎造燥憎灶蚤葬 憎蚤贼糟澡藻泽爷 鄄遭则燥燥皂袁
孕葬宰月冤在我国分布广泛袁为害严重遥 据调查袁全国
丛枝病发生面积达 愿愿 万 澡皂圆袁每年造成直接经济
损失超过 员 亿元遥 泡桐丛枝病造成苗木死亡袁幼树
树体生长减弱袁成年树木的胸径尧树高尧材积生长
量降低咱圆暂 袁该病也会导致泡桐木材抗变形能力明
显下降和木材力学强度的降低咱猿暂 遥 植原体主要通
过无性繁殖材料的嫁接和繁殖尧通过寄生植物造成
的侵染植物与非侵染植物间的微管束连接以及通
过韧皮部取食的刺吸式口器的昆虫渊叶蝉尧蝽象尧
飞虱和木虱等冤传播遥 植原体在介体昆虫中一般
以增殖型持续性的方式传播咱源 原 缘暂 袁传播植原体的介
体多数属于叶蝉科渊悦蚤糟葬凿藻造造蚤凿葬藻冤尧菱蜡蝉科渊悦蚤曾蚤鄄
蚤凿葬藻冤尧木虱科渊孕泽赠造造蚤凿葬藻冤尧飞虱科渊阅藻造责澡葬糟蚤凿葬藻冤尧袖
蜡蝉科渊阅藻则遭蚤凿葬藻冤尧酝藻灶燥责造蚤凿葬藻 和蛾蜡蝉科渊 云造葬贼蚤凿鄄
葬藻冤袁而目前发现的多于 苑缘豫的传毒介体种属于叶
蝉科的角顶叶蝉亚科渊阅藻造贼燥糟藻责澡葬造蚤灶葬藻冤 咱远暂 遥 目前报
道的传播泡桐丛枝植原体的介体昆虫是蝽科的茶
翅蝽渊匀葬造赠燥皂燥则责澡葬 澡葬造赠泽 渊 杂贼覽造冤冤 咱苑 原 怨暂 尧盲蝽科的烟
草盲蝽渊悦则赠贼燥责藻造贼蚤泽 贼藻灶怎蚤泽 渊砸藻怎贼藻则冤冤 咱怨暂和叶蝉科的
小绿叶蝉渊耘皂责燥葬泽糟葬 枣造葬增藻泽糟藻灶泽 渊 云葬遭则蚤糟蚤怎泽冤冤 咱员园 原 员员暂 袁
而对于这些介体昆虫传播泡桐丛枝植原体的分子
机制还缺乏研究遥
植物病原细菌的质粒基因通常涉及致病性或寄
主专化性咱员圆暂 袁在细菌的生活史中发挥重要的功能遥
植原体质粒基因与介体昆虫传播有关的报道包括院
三叶草绿变植原体中一个 源援 愿 噪遭 染色质外
阅晕粤咱员猿暂 袁翠菊黄化丛枝植原体潜在可移动单元
孕酝哉员 中的 杂粤孕猿远咱员源暂 袁洋葱黄化植原体株系 韵再鄄酝
质粒基因 韵砸云猿咱员缘暂 遥 蕴蚤灶等咱员远暂从泡桐丛枝植原体南
阳株系中克隆到 圆 个质粒袁同源性分析发现袁
责孕葬宰月晕赠鄄员鄄韵砸云缘 渊简称 责员韵砸云缘 冤 和 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄
韵砸云源渊简称 责圆韵砸云源冤都与 韵再鄄酝植原体质粒上的虫
传相关基因 韵砸云猿 具有很高的同源性遥 本文以感病
泡桐组培苗为材料袁利用 孕悦砸扩增了 责圆韵砸云源 基因袁
制备了抗 责圆韵砸云源 编码蛋白的抗血清遥 利用制备的
抗血清对原核表达的融合蛋白尧感病泡桐组培苗提
取的蛋白和饲毒茶翅蝽提取的蛋白进行免疫印迹试
验袁分析了 责圆韵砸云源 在不同材料中的表达情况遥 本
研究将为泡桐丛枝植原体与介体昆虫的分子互作研
究提供基础遥
员摇 材料和方法
员援 员摇 材料和主要试剂
责郧耘载鄄源栽鄄猿 原核表达载体尧含 责耘栽圆愿葬鄄韵砸云缘鄄缘
的大肠杆菌渊耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤冤砸燥泽泽藻贼葬渊阅耘猿冤菌株尧健
康和感染泡桐丛枝植原体南阳株系的泡桐组培苗由
中国林科院森林生态环境与保护研究所植物病理实
验室保存遥 雄性大白兔由中国农业大学养殖场提
供袁大肠杆菌 阅匀缘琢尧大肠杆菌 砸燥泽藻贼贼葬渊阅耘猿冤菌株购
于博迈德生物公司遥
质粒提取试剂盒尧普通 阅晕粤产物纯化试剂盒尧圆
伊 孕悦砸 酝蚤曾尧蛋白质 酝葬则噪藻则和 阅晕粤 分子量标准购于
天根生化科技有限公司遥 限制性内切酶购于大连宝
生物有限公司遥 植物材料 阅晕粤 提取试剂盒尧蓝色预
染蛋白质 酝葬则噪藻则和 月悦陨孕 辕 晕月栽显色试剂盒购自博迈
德公司遥 碱性磷酸酶标记的蛋白 粤 购于 杂蚤早皂葬 公
司遥 设计的引物由赛百盛有限公司合成遥 阅晕粤 序
列测定由华大基因有限公司完成遥
员援 圆摇 方法
员援 圆援 员摇 责圆韵砸云源 的生物信息学分析摇 责圆韵砸云源渊郧藻灶鄄
月葬灶噪 登录号院耘云源圆远源苑猿冤编码蛋白使用 孕则燥贼孕葬则葬皂
贼燥燥造 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎藻遭援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 责则燥贼责葬则葬皂 辕 冤预测其分
子量和等电点曰使用 杂韵杂哉陨渊澡贼贼责院 辕 辕 遭责援 灶怎葬责援 灶葬早燥赠葬鄄
怎援 葬糟援 躁责 辕 泽燥泽怎蚤 辕 泽燥泽怎蚤赃泽怎遭皂蚤贼援 澡贼皂造冤进行氨基酸跨膜
结构预测曰使用 阅晕粤酝粤晕 远援 园 软件对 责圆韵砸云源 和
责员韵砸云缘 编码蛋白的氨基酸序列进行比对曰郧藻灶月葬灶噪
下载植原体的虫传相关基因袁使用酝耘郧粤源援 员 软件进
行系统发育分析袁采用邻位相连法渊灶藻蚤早澡遭燥则鄄躁燥蚤灶蚤灶早袁
晕允冤构建系统发育树遥
员援 圆援 圆摇 泡桐组培苗总 阅晕粤 提取和 责圆韵砸云源 的扩增
摇 以泡桐丛枝植原体南阳株系侵染的泡桐组培苗为
材料袁使用植物 阅晕粤提取试剂盒提取总 阅晕粤遥 根据
责圆韵砸云源 序列设计用于特异性 孕悦砸 扩增引物遥 引物
序列为渊下划线部分为添加的酶切位点冤院责圆韵砸云源云鄄
月葬皂匀 陨 缘忆鄄郧悦悦 郧郧粤 栽悦悦 栽栽栽 粤粤粤 栽悦粤 粤栽栽 悦粤粤
郧粤栽 粤粤粤 粤粤栽 粤鄄猿忆袁责圆韵砸云源砸鄄杂葬造 陨 缘忆 原 悦栽郧 郧栽悦
郧粤悦 栽郧栽 栽粤郧 粤粤悦 栽粤粤 粤悦粤 郧悦悦 粤粤栽 粤粤悦 原 猿忆遥
以提取的总 阅晕粤 为模板进行 孕悦砸 扩增袁孕悦砸 扩增
的产物使用 员援 缘豫的琼脂糖凝胶进行电泳分析遥
员援 圆援 猿摇 责圆韵砸云源 编码蛋白的原核表达摇 纯化的 孕悦砸
扩增产物和原核表达载体 责郧耘载鄄源栽鄄猿 分别使用
月葬皂匀 陨 和 杂葬造 陨 双酶切袁双酶切的产物纯化后使用
杂燥造怎贼蚤燥灶 陨渊责酝阅鄄员愿栽 杂蚤皂责造藻 试剂盒冤在 员圆 益下连接
缘怨源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
过夜遥 连接产物转化大肠杆菌 阅匀缘琢 感受态细胞遥
孕悦砸检测阳性的克隆送华大基因公司测序袁测序验
证 重 组 子袁 序 列 正 确 的 重 组 子 命 名 为
责郧耘载鄄责圆韵砸云源遥
分别取重组质粒 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 和空载体
责郧耘载鄄源栽鄄猿袁转化大肠杆菌 砸燥泽泽藻贼葬渊阅耘猿冤感受态细
胞遥 孕悦砸筛选的重组子按照 员颐 员园园 分别接种到含氨
苄青霉素渊员园园 皂早窑蕴 原员冤和氯霉素渊猿源 皂早窑蕴 原员冤的
蕴月液体培养基中袁猿苑 益下 员愿园 则窑皂蚤灶 原员摇菌 圆援 园尧
圆郾 缘尧猿援 园尧猿援 缘 澡遥 添加 陨孕栽郧 到终浓度为 员 皂皂燥造窑
蕴 原员袁猿苑 益下 员愿园 则窑皂蚤灶 原员诱导 缘 澡遥 收集菌液 圆 猿
皂蕴袁使用 员园园 滋蕴 蛋白质提取液提取细菌总蛋白遥
取 员缘 滋蕴提取的蛋白在 员缘豫的 杂阅杂鄄孕粤郧耘凝胶上电
泳分析蛋白质诱导表达情况袁扫描仪扫描染色后的
杂阅杂鄄孕粤郧耘凝胶遥
员援 圆援 源摇 表达产物的纯化和抗体的制备摇 提取的总
蛋白 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳后袁凝胶在蒸馏水中漂洗 圆
皂蚤灶袁用预冷的染色液渊园援 圆缘 皂燥造窑蕴 原员 运悦造袁员 皂皂燥造窑
蕴 原员 阅栽栽冤染色至条带清楚袁切下目的条带袁加入适量
的预冷 园郾 愿缘豫的生理盐水袁在洁净的 原 圆园 益预冷的
研钵中研碎袁源 益静置过夜遥 用移液器吸取研磨物
到 员郾 缘 皂蕴离心管中袁员圆 园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 缘 皂蚤灶袁上
清即为纯化的融合蛋白遥
纯化的融合蛋白溶液与等体积的弗氏不完全佐
剂混匀并免疫大白兔袁免疫时采用皮下多点注射结
合肌肉注射的方法进行遥 首次免疫之前耳静脉取血
员 皂蕴袁用于阴性对照遥 第 源 次注射之后 员园 凿袁颈动脉
一次性采血遥 血液在室温下温育 圆 澡后袁源 益过夜袁猿
园园园 则窑皂蚤灶 原员离心 猿园 皂蚤灶袁上清即为抗血清遥
员援 圆援 缘摇 多克隆抗体鉴定
员援 圆援 缘援 员摇 免疫印迹鉴定摇 诱导表达后提取的细菌
总蛋白经 杂阅杂鄄孕粤郧耘 分离后转移 孕灾阅云 膜袁于 源 益
下封闭过夜或 猿苑 益下封闭 员 澡遥 栽月杂栽洗膜 员园 皂蚤灶袁
重复 猿 次遥 加入用 栽月杂栽 稀释制备的多克隆抗体渊员
颐 缘园园冤袁猿苑 益下摇床上温育 圆 澡袁栽月杂栽 洗膜 猿 次袁每
次 员园 皂蚤灶遥 用碱性磷酸酶标记的蛋白质 粤渊员颐 圆 缘园园
稀释冤孵育 圆 澡袁栽月杂栽洗膜 猿 次袁每次 员园 皂蚤灶遥 月悦陨孕 辕
晕月栽显色试剂盒显色 缘 员缘 皂蚤灶袁待蛋白膜上条带
呈色明显且无明显背景的时候袁把膜浸入水中漂洗袁
停止反应遥
含重组质粒 责耘栽圆愿葬鄄韵砸云缘鄄缘 的菌液诱导表达并
提取蛋白作为抗原袁使用本研究制备的抗血清进行
免疫试验袁验证 责员韵砸云缘 编码蛋白是否与抗 责圆韵砸云源
编码蛋白的抗体发生交叉反应遥 试验方法同上一段
描述遥
员援 圆援 缘援 圆摇 免疫印迹鉴定摇 原核表达的融合蛋白切
胶纯化袁使用核酸仪定量之后袁用碳酸盐包被液渊员缘
皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬圆悦韵猿袁猿缘 皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬匀悦韵猿袁猿 皂皂燥造
窑蕴 原员 晕葬晕猿曰责匀值 怨援 远冤稀释成 缘 滋早窑皂蕴 原员袁采用间
接 耘蕴陨杂粤实验测定效价袁参照林彩丽咱员苑暂的实验方
法遥 实验中以免疫前兔子血清为阴性对照血清袁以
制备的抗血清为阳性抗血清遥 阴性和阳性抗血清用
封闭液按 圆愿 圆员苑倍比稀释袁每个浓度的阳性抗血清
重复 猿 次遥 酶标仪上测定 韵阅源园缘读数袁以与阴性对照
孔 韵阅值的比值 孕 辕 晕逸圆援 员 作为判断阳性或确定效
价的临界点遥
员援 圆援 远摇 茶翅蝽和感病泡桐组培苗中 责圆韵砸云源 基因
的表达分析摇 于 圆园员圆 年 员园 月 愿 日至 员园 月 员远 日袁在
河南省南阳市潦河镇泡桐人工林袁使用捕虫网捕捉
泡桐树上的蝽象样本遥 从林业科学研究院内采集感
病泡桐病枝袁将其剪成约每段 员缘 糟皂袁远 员园 段病枝
为 员 束袁病枝的下部裹上沾水的脱脂棉袁放在塑料养
虫笼中袁每笼 员 束遥 南阳采集的茶翅蝽样本置于养
虫笼中袁进行为期 苑 凿 的获毒袁在 苑 凿 中共更换树枝
束 猿 次遥 之后将单头蝽象转移到含有饲料和水源的
透气组培瓶中恢复饲养 员怨 凿遥 恢复饲养的茶翅蝽按
照 杂怎扎怎噪蚤等咱员愿暂的方法提取总蛋白遥 以提取的蛋白
作为抗原进行免疫印迹试验袁免疫印迹试验的方法
同 员郾 圆郾 缘郾 员遥
感病组培苗采用直接提取总蛋白和先差速离心
富集植原体后提取蛋白的方法提取蛋白遥 直接提取
蛋白的方法是院组培苗在液氮中研磨成粉末袁称取约
园郾 圆 早粉末袁加入总蛋白提取液渊猿园 皂皂燥造窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄
匀悦造 渊责匀值 远援 愿冤袁圆豫 杂阅杂袁远豫 茁鄄巯基乙醇冤充分混
匀袁在沸水中加热 缘 皂蚤灶袁员愿 园园园 早 离心 员缘 皂蚤灶袁上清
即为提取的蛋白样本遥 差速离心富集植原体后提取
蛋白的方法按以下步骤进行院称取感病泡桐组培苗
缘 早袁加入 缘 皂蕴 预冷的植原体提取缓冲液渊员园 皂皂燥造
窑蕴 原员磷酸钾缓冲液渊责匀 值 苑郾 源冤袁园郾 猿缘 皂燥造窑蕴 原员蔗
糖袁员 皂皂燥造窑蕴 原员 悦葬渊晕韵猿 冤圆袁员 皂皂燥造窑蕴 原员 酝早悦造圆袁园郾 园员豫 茁鄄巯基乙醇袁园郾 员缘豫牛血清白蛋白袁圆豫 孕灾孕鄄
员园冤充分研磨袁源 益放置 员 澡曰研磨液用 源 层纱布过
滤袁滤液装入 缘园 皂蕴 离心管袁源 益下 员 缘园园 早 离心 员园
皂蚤灶袁取上清曰上清在 源 益下 员愿 园园园 早离心 猿园 皂蚤灶袁沉
淀为植原体细胞粗提物遥 沉淀物采用 蕴蚤灶等咱员远暂的实
验方法提取蛋白袁以提取的蛋白质作为抗原进行免
远怨源
第 源 期 耿显胜等院泡桐丛枝植原体 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 编码蛋白的抗体制备和表达分析
疫印迹试验袁免疫印迹试验的方法同 员郾 圆郾 缘郾 员 节遥
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 责圆韵砸云源 的生物信息学分析
责圆韵砸云源 由 源远圆 个核苷酸组成袁编码 员缘猿 个氨基
酸袁孕则燥贼孕葬则葬皂 贼燥燥造预测的分子量为 员苑郾 缘 噪阅葬袁等电点
为 责陨 怨郾 缘怨遥 杂韵杂哉陨软件预测其 晕端和 悦端各具有 员
个 圆猿 个氨基酸的跨膜结构域遥 使用 阅晕粤酝粤晕 软件
对 责圆韵砸云源 和 责员韵砸云缘 的编码蛋白氨基酸序列进行
比对袁发现二者的同源性为 愿猿援 园员豫 遥 二者在 晕鄄端
的 愿愿 个氨基酸残基中只有 员 个差异袁在 悦鄄端的 员远
个氨基酸残基完全一致遥 中部的氨基酸差异较大袁
责圆韵砸云源 的编码蛋白比 责员韵砸云缘 的多出 怨 个氨基酸
残基遥 以 酝耘郧粤源援 员 软件的邻位相连法构建系统发
育树 渊图 员冤袁从系统发育树可以看出院 责悦宰月云择鄄
韵砸云缘 与所有参比的序列具有较远的亲缘关系袁而
责员韵砸云缘 和 责圆韵砸云源 间具有最近的亲缘关系袁并且它
们与 员远 杂则陨 组的 粤再宰月 责陨园源 和 韵再酝鄄孕粤酝源缘怨 在一
个进化支上遥
摇 摇 供分析的植原体虫传相关基因包括院泡桐丛枝植原体 责孕葬宰月鄄
晕赠鄄圆鄄韵砸云源渊耘云源圆远源苑源冤尧责孕葬宰月晕赠鄄员鄄韵砸云缘渊耘云源圆远源苑圆冤尧翠菊黄化
丛枝植原体 粤再宰月 责陨园源 渊 悦孕园园园园远圆 冤尧洋葱黄化植原体 韵再鄄宰
耘糟韵再宰员鄄韵砸云缘渊粤月源苑怨缘员猿冤尧责韵再宰鄄韵砸云源渊粤月园缘远愿缘怨冤尧洋葱黄化
植 原 体 韵再鄄酝耘糟韵再酝鄄韵砸云猿 渊 粤月园苑远圆远猿 冤尧 韵再酝鄄孕粤酝源缘怨
渊粤孕园园远远圆愿冤尧责韵再酝鄄韵砸云猿渊粤月源苑怨缘员源冤尧洋葱黄化植原体 韵再鄄晕陨酝
耘糟韵再晕陨酝鄄韵砸云猿 渊 粤月园怨苑员缘园 冤尧苦楝丛枝植原体 责悦宰月云择鄄韵砸云缘
渊允云愿圆苑圆怨愿冤尧长春花黄叶植原体 责园怨孕蕴再鄄员鄄韵砸云源 渊 匀匝猿猿圆缘猿园 冤尧
责园怨孕蕴再鄄圆鄄韵砸云源渊匀匝猿猿圆缘猿员冤尧小麦蓝矮病植原体 责宰月阅员鄄韵砸云源
渊允载远远愿怨愿苑冤尧责宰月阅圆鄄韵砸云源渊允载远远愿怨愿愿冤尧悦葬灶凿蚤凿葬贼怎泽 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬 葬泽鄄
贼藻则蚤泽侵染油菜的株系 责孕粤月晕员鄄韵砸云源渊匀匝远猿苑猿愿圆冤尧长春花小叶植
原体 责孕蕴蕴匀灶鄄员鄄韵砸云源渊允晕愿猿缘员愿苑冤遥
图 员摇 基于植原体虫传相关基因构建的系统进化树
圆援 圆摇 责圆韵砸云源 片段的 孕悦砸扩增和原核表达载体的
构建
使用引物 责圆韵砸云源云鄄月葬皂匀 陨 辕 责圆韵砸云源砸鄄杂葬造 陨袁
以感病泡桐组培苗提取的总 阅晕粤为模板袁进行 孕悦砸
扩增和电泳检测遥 结果获得大小约 猿园园 遭责 的条带
渊图 圆冤袁与预期的 猿园猿 遭责大小一致遥 纯化的 孕悦砸产
物和 责郧耘载鄄源栽鄄猿 质粒分别使用 月葬皂匀 陨和 杂葬造 陨双酶
切袁双酶切产物纯化后进行连接并转化大肠杆菌
阅匀缘琢遥 菌液 孕悦砸筛选到 员源 个阳性克隆袁测序发现
员 个克隆 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 的序列与 郧藻灶遭葬灶噪 中
责圆韵砸云源 序列渊登录号院耘云源圆远源苑猿冤一致袁并且在表达
载体中未发生移码袁证明 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 基因原
核表达载体构建成功遥
酝泳道院阅晕粤分子量标准曰员 泳道院感病泡桐组培苗
图 圆摇 孕悦砸扩增 责孕葬宰月晕赠鄄圆 韵砸云源 的 猿园猿 遭责序列
圆援 猿摇 融合蛋白的诱导表达
诱导表达后提取的细菌总蛋白进行 杂阅杂鄄
孕粤郧耘分析袁结果发现院含 责郧耘载鄄源栽鄄猿 空质粒的大
肠杆菌 砸燥泽泽藻贼葬渊阅耘猿冤菌株诱导后袁在 圆远 噪阅葬 处有
员 条很宽的条带袁该条带对应物是表达的 郧杂栽 标签
蛋白渊图 猿 泳道 远冤曰而含 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 重组质粒
菌株与含 责郧耘载鄄源栽鄄猿 空质粒菌株诱导物相比袁在
约 猿愿 噪阅葬处多出 员 条条带渊图 猿 泳道 员 源冤袁该条
带对应物的分子量大小与 郧杂栽鄄韵砸云源 融合蛋白预
期分子量一致袁证明目的蛋白得到表达遥 从电泳图
猿 看出院在摇菌 圆郾 园尧圆郾 缘尧猿郾 园尧猿郾 缘 澡 后诱导表达袁
目的蛋白的表达量没有显著差异渊图 猿 泳道 员
源冤遥 确定合适的目的蛋白表达条件是院猿苑 益条件
下 员愿园 则窑皂蚤灶 原 员摇菌 圆 澡袁添加终浓度为 员 皂皂燥造窑
蕴 原员的 陨孕栽郧诱导 缘 澡遥
圆援 源摇 表达产物的纯化和抗体的制备
诱导表达后提取的细菌蛋白 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳袁
切胶回收分子量约 猿愿 噪阅葬的蛋白条带袁研磨并纯化
目的蛋白遥 纯化的融合蛋白免疫大白兔制备抗血
清袁一次性颈动脉采血得到约 圆园 皂蕴 的血液遥 血液
经离心处理得到抗血清袁抗血清超低温冷冻干燥后袁
苑怨源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
摇 摇 员 源 泳道院含 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 重组质粒摇菌 猿郾 缘尧猿郾 园尧圆郾 缘尧圆郾 园
澡后添加 陨孕栽郧诱导曰缘 泳道院含重组质粒 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 菌液未添
加 陨孕栽郧诱导曰酝 泳道院蛋白质分子量标准曰远 泳道院含质粒 责郧耘载鄄
源栽鄄猿 菌液摇菌 圆援 缘 澡之后添加 陨孕栽郧诱导遥
图 猿摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析 责圆韵砸云源 在载体 责郧耘载鄄源栽鄄猿 中的表达
保存在 原圆园 益冰箱中遥
圆援 缘摇 多克隆抗体的鉴定
圆援 缘援 员摇 免疫印迹鉴定摇 使用制备的抗血清对原核
表达的蛋白进行免疫印迹分析袁发现含质粒 责郧耘载鄄
源栽鄄猿 菌液提取蛋白在约 圆远 噪阅葬处出现紫色条带渊图
源 泳道 员冤袁大小与 郧杂栽 蛋白标签一致遥 含重组质粒
责郧耘载鄄责圆韵砸云源 菌液提取蛋白在约 猿愿 噪阅葬 处出现紫
色条带渊图 源 泳道 猿冤袁大小与 杂阅杂鄄孕粤郧耘 观察到融
合蛋白一致袁表明制备的多克隆抗体与原核表达的
蛋白能够发生特异的免疫反应遥
以含重组质粒 责耘栽圆愿葬鄄韵砸云缘鄄缘 菌液诱导表达蛋
白作抗原进行免疫印迹分析袁在膜上的 员缘 噪阅葬处未
出现特异条带渊图 源 泳道 源冤袁表明制备的抗血清与
责员韵砸云缘 编码蛋白间无明显的交叉反应袁抗血清特异
性较好遥
摇 摇 员 泳道院含 责郧耘载鄄源栽鄄猿 质粒的菌液添加 陨孕栽郧 诱导后提取的蛋白曰
圆 泳道院切胶回收纯化的 韵砸云源 编码蛋白曰酝泳道院蛋白质分子量标准曰
猿 泳道院含 责郧耘载鄄责圆韵砸云源 质粒的菌液添加 陨孕栽郧 诱导后提取的蛋白曰源
泳道院含 责耘栽圆愿葬鄄韵砸云缘 质粒的菌液添加 陨孕栽郧诱导后提取的蛋白遥
图 源摇 使用融合蛋白进行 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼鉴定制备的抗血清
圆援 缘援 圆摇 抗体效价的测定摇 抗血清效价测定结果见
表 员遥 阳性血清行是不同稀释倍数抗血清的 猿 个平
行试验的 韵阅源园缘平均值袁阴性血清行是在不同稀释倍
数的免疫前兔子血清的 韵阅源园缘值遥 当样本吸光值 辕阴
性吸光值渊孕 辕 晕冤逸圆援 员 判定为阳性袁抗血清在稀释
达到 员颐 源 园怨远 倍时袁孕 辕 晕值为 圆郾 猿源怨 愿曰而抗血清稀释
到 员颐 愿 员怨圆 倍时袁孕 辕 晕值为 员郾 远怨园 愿遥 因此袁其效价是
员颐 源 园怨远遥
表 员摇 间接 耘蕴陨杂粤法测定抗血清的效价
项目 抗血清的浓度圆愿 圆怨 圆员园 圆员员 圆员圆 圆员猿 圆员源 圆员缘 圆员远 圆员苑
阳性血清 园援 源远远 员 园援 猿怨园 远 园援 猿园员 缘 园援 圆员园 苑 园援 员源猿 员 园援 员园缘 园 园援 园愿愿 猿 园援 园苑缘 员 园援 园远怨 员 园援 园远缘 远
阴性血清 园援 园远苑 员 园援 园远圆 远 园援 园远源 远 园援 园远圆 猿 园援 园远园 怨 园援 园远圆 员 园援 园远源 源 园援 园远员 缘 园援 园远园 愿 园援 园远圆 源
孕 辕 晕 远援 怨源远 猿 远援 圆猿怨 远 源援 远远苑 圆 猿援 猿愿圆 园 圆援 猿源怨 愿 员援 远怨园 愿 员援 猿苑员 员 员援 圆圆员 员 员援 员猿远 缘 员援 园缘员 猿
圆援 远摇 茶翅蝽和感病泡桐组培苗中 责圆韵砸云源 编码蛋
白的表达分析
以饲毒茶翅蝽提取的蛋白质作为抗原袁免疫印
迹试验发现院在分子量约为 员愿 噪阅葬 处出现 员 条带
渊图 缘 泳道 员冤袁而在无菌的试虫样本中无该条带渊图
缘 泳道 圆冤袁证明 责圆韵砸云源 在饲毒的茶翅蝽中得到表
达遥 以感病的泡桐组培苗提取蛋白作为抗原和先富
集植原体再提取植原体蛋白作为抗原袁免疫印迹试
验都未能检测到特定的蛋白条带袁表明在感病的泡
桐组培苗中植原体 责圆韵砸云源 基因未表达遥
摇 摇 酝泳道院蛋白质分子量标准曰员 泳道院饲毒的茶翅蝽样本提取
的蛋白曰圆 泳道院无菌的茶翅蝽样本提取的蛋白曰猿 泳道院感病泡桐
直接提取的蛋白曰源 泳道院健康泡桐直接提取的蛋白曰缘 远 泳道院
感病泡桐富集植原体后提取的蛋白遥
图 缘摇 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 编码蛋白的表达分析
愿怨源
第 源 期 耿显胜等院泡桐丛枝植原体 责孕葬宰月晕赠鄄圆鄄韵砸云源 编码蛋白的抗体制备和表达分析
猿摇 结论与讨论
本研究从感病泡桐中 孕悦砸 扩增了质粒 责孕葬宰月鄄
晕赠鄄圆 的 韵砸云源 基因袁并首次制备了其编码蛋白的多
克隆抗体袁多克隆抗体的鉴定发现其具有较高的效
价袁并与 责员韵砸云缘 编码蛋白无明显的交叉反应袁故本
研究制备的抗血清可以用于植原体质粒基因功能分
析尧病菌检测和用于 责圆韵砸云源 编码蛋白与介体昆虫
茶翅蝽的互作研究遥
在已测定的 猿园 多个完整的植原体质粒中袁已注
释或验证了 砸藻责尧凿灶葬郧尧泽泽遭 基因参与质粒的自我复
制袁而 糟燥责 基因控制质粒的拷贝数遥 除此之外袁植原
体质粒编码的绝大部分蛋白是膜蛋白或分泌蛋白袁
它们可能在植原体和寄主的互作及植原体的介体传
播中发挥重要作用遥 本研究对感病泡桐组培苗差速
离心富集植原体袁利用富集植原体的初提纯物提取
蛋白质袁再使用该提取蛋白作为抗原袁也不能检测到
杂交信号袁证明 责圆韵砸云源 在感病泡桐中未表达或表
达水平很低遥 本研究还发现袁责圆韵砸云源 与之前研究报
道的 责员韵砸云缘 的编码蛋白都在昆虫体内有很高的表
达量袁而在感病泡桐中没有检测到明显的表达袁这与
陨泽澡蚤蚤等咱员怨暂发现的日本洋葱黄化植原体质粒编码的
韵砸云猿 在介体昆虫细胞中表达水平也高于寄主植物
相一致遥 据此推测袁责圆韵砸云源 可能在潜育期中与介体
昆虫茶翅蝽互作袁进而为植原体在介体昆虫体内存
活或在介体传播中发挥重要功能遥
介体传播病菌分为获毒尧潜育期和传毒 猿 个阶
段咱圆园暂 遥 在潜育期袁介体昆虫虽不能够传播植原体袁
但植原体与介体昆虫在不同的位点上发生互作袁可
能是介体昆虫传播植原体的一个重要环节遥 郧葬造藻贼贼燥
等咱圆员暂通过研究 耘怎泽糟藻造蚤凿蚤怎泽 增葬则蚤藻早葬贼藻泽 运蚤则泽糟澡遭葬怎皂对菊
花黄化植原体渊 糟澡则赠泽葬灶贼澡藻皂怎皂 赠藻造造燥憎泽 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬袁
悦再孕冤的传播特性袁认为介体昆虫传毒能力的变化依
赖菊花黄化植原体在 耘援 增葬则蚤藻早葬贼怎泽 中的分布遥 允蚤葬
等咱圆圆暂认为袁传毒介体的特异性和介体的传毒能力决
定于病毒在介体昆虫的不同组织中引起的传播屏
障遥 悦葬灶凿蚤凿葬贼怎泽 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬 葬泽贼藻则蚤泽 的 韵再 菌系的细
胞膜蛋白 粤皂责能够与 猿 种介体昆虫 酝葬糟则燥泽贼藻造藻泽 泽贼则蚤蚤鄄
枣则燥灶泽尧凹缘菱纹叶蝉渊匀蚤泽澡蚤皂燥灶怎泽 泽藻造造葬贼怎泽 哉澡造藻则冤和拟
菱纹叶蝉渊匀蚤泽澡蚤皂燥灶燥蚤凿藻泽 泽藻造造葬贼蚤枣燥则皂蚤泽 陨泽澡蚤澡葬则葬冤的微丝
结合袁但不能与试验中的 圆 种非介体的微丝结合袁表
明植原体被介体昆虫特异性传播与 粤皂责鄄微丝复合
体的形成有关咱员愿暂 遥 郧葬造藻贼贼燥 等咱圆猿暂也发现袁悦再孕 的细
胞膜蛋白 粤皂责能够与介体昆虫的肌动蛋白互作袁这
种互作涉及植原体的内化和在介体昆虫中的运动曰
同时也发现袁粤皂责 能够与分布在昆虫细胞膜上 粤栽孕
酶的 琢 和 茁 亚基互作袁推测中肠和唾液腺上分布的
粤栽孕酶可能是 粤皂责 的受体遥 洋葱黄化植原体株系
韵再鄄晕陨酝的质粒 责韵再晕陨酝 与 韵再鄄酝 的质粒 责韵再酝 相
比缺乏 圆 个阅读框 韵砸云猿 和 韵砸云源渊编码单链 阅晕粤
结合蛋白冤袁试验表明 韵砸云猿 编码的膜蛋白在细胞膜
的界面上与介体昆虫互作咱员怨袁员缘暂 遥 为了进一步验证
泡桐丛枝植原体的 责圆韵砸云源 和 责员韵砸云缘 在茶翅蝽传
播植原体过程中的作用袁需要明确与其互作的分子
和互作机制遥 在茶翅蝽体内是否存在着与 责圆韵砸云源
和 责员韵砸云缘 互作的类似于与其他植原体或螺原体上
发现的昆虫微丝尧糖蛋白等互作蛋白袁将可通过免疫
亲和层析尧云葬则鄄憎藻泽贼藻则灶等方法加以验证遥
植物病害的流行需要易感植物尧病原体和传播
途径袁只有三者同时存在袁病害才会流行遥 目前还没
有鉴定到高度抗病的泡桐品种袁也没有鉴定到抵抗
植原体的基因遥 加上全球变暖和气候的变化袁促进
冷敏感的介体昆虫的活动袁使植原体病害呈现上升
的趋势咱员暂 曰所以袁控制植原体的介体昆虫是控制植原
体病害流行的一种有效的方法遥 本研究制备的抗血
清可用于植原体与介体昆虫茶翅蝽的互作研究袁而
对植原体与介体昆虫的互作尧介体昆虫的种群动态
和取食行为等方面的研究袁将会促进发展更有效的
控制植原体病害流行的策略遥
参考文献院
咱员暂 晕葬皂遭葬 杂援 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬泽院粤 糟藻灶贼怎则赠 燥枣 责蚤燥灶藻藻则蚤灶早 则藻泽藻葬则糟澡咱允暂 援 允燥怎则鄄
灶葬造 燥枣 郧藻灶藻则葬造 孕造葬灶贼 孕葬澡贼燥造燥早赠袁 圆园员员袁 苑苑院猿源缘 原 猿源怨
咱圆暂 金开璇援泡桐丛枝病对泡桐立木生长影响的研究咱 允暂 援林业实用
技术袁员怨愿园渊缘冤院 圆缘 原 圆远
咱猿暂 陈育民援丛枝病对泡桐叶片解剖构造生理生化及材性的影响
咱允暂 援西北林学院学报袁员怨怨圆袁苑渊源冤院 缘园 原 缘苑
咱源暂 匀燥早藻灶澡燥怎贼 杂袁 韵泽澡蚤皂葬 运袁 粤皂皂葬则 耘 阅袁藻贼 葬造援 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬泽院遭葬糟贼藻则蚤葬
贼澡葬贼 皂葬灶蚤责怎造葬贼藻 责造葬灶贼泽 葬灶凿 蚤灶泽藻糟贼泽 咱 允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁
圆园园愿袁 怨渊源冤院源园猿 原 源圆猿
咱缘暂 云则燥泽贼 运 耘袁 宰蚤造造蚤泽 阅 运袁 郧则燥增藻泽 砸 蕴援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 增葬则蚤葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 葬泽鄄
贼藻则 赠藻造造燥憎泽 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 贼蚤贼藻则 蚤灶 蚤贼泽 蚤灶泽藻糟贼 增藻糟贼燥则袁 酝葬糟则燥泽贼藻造藻泽 择怎葬凿则蚤鄄
造蚤灶藻葬贼怎泽 渊匀藻皂蚤责贼藻则葬院 悦蚤糟葬凿藻造造蚤凿葬藻冤咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 耘糟燥灶燥皂蚤糟 耘灶贼燥鄄
皂燥造燥早赠袁 圆园员员袁 员园源渊远冤院 员愿园园 原 员愿员缘
咱远暂 宰藻蚤灶贼则葬怎遭 孕 郧袁 月藻葬灶造葬灶凿 蕴援 陨灶泽藻糟贼 增藻糟贼燥则泽 燥枣 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬泽咱 允暂 援
粤灶灶怎葬造 砸藻增蚤藻憎 燥枣 耘灶贼燥皂燥造燥早赠袁 圆园园远袁 缘员院怨员 原 员员员
咱苑暂 杂澡蚤燥扎葬憎葬 匀援 栽则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶 燥枣 孕葬怎造燥憎灶蚤葬 宰蚤贼糟澡藻泽爷 月则燥燥皂 遭赠 杂贼蚤灶早
月怎早泽 匀葬造赠燥皂燥则责澡葬 皂蚤泽贼葬 哉匀蕴耘砸 咱 允 暂援 允葬责葬灶 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁
员怨愿远袁 源院源缘 原 缘园
怨怨源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
咱愿暂 邵平绪袁洪瑞芬袁仝德全袁等援泡桐丛枝病传病昆虫研究渊 陨冤 茶翅
蝽传病试验及电镜观察咱允暂 援山东林业科技袁员怨愿员渊圆冤院 源圆 原 源猿
咱怨暂 金开璇袁梁成杰袁邓丹荔援泡桐丛枝病传毒昆虫研究渊 陨冤 咱 允暂 援 林
业科技通讯袁 员怨愿员渊员圆冤院 圆猿 原 圆源
咱员园暂 郑文锋袁宋晓斌袁任锁堂袁等援泡桐丛枝病病原及传毒途径的研
究咱允暂 援陕西林业科技袁员怨怨园渊员冤院 圆猿 原 圆缘
咱员员暂 罗摇 飞袁朱水芳袁张成良袁等援泡桐丛枝病媒介昆虫体内植原体
的检测和鉴定 咱酝暂援 北京院中国农业科技出版社袁员怨怨愿院圆愿园
原 圆愿猿
咱员圆暂 灾蚤增蚤葬灶 粤袁 酝怎则蚤造造燥 允袁 允葬糟噪泽燥灶 砸 宰援 栽澡藻 则燥造藻泽 燥枣 责造葬泽皂蚤凿泽 蚤灶 责澡赠贼燥鄄
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咱员源暂 酝葬糟蕴藻葬灶 粤 酝袁 杂怎早蚤燥 粤袁 酝葬噪葬则燥增葬 韵 灾袁 藻贼 葬造援 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬 藻枣枣藻糟鄄
贼燥则 杂粤孕缘源 蚤灶凿怎糟藻泽 蚤灶凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼藻 造藻葬枣鄄造蚤噪藻 枣造燥憎藻则 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 蚤灶
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 责造葬灶贼泽咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园员员袁 员缘苑院 愿猿员 原 愿源员
咱员缘暂援 晕蚤泽澡蚤早葬憎葬 匀袁 韵泽澡蚤皂葬 运袁 运葬噪蚤扎葬憎葬 杂袁 藻贼 葬造援 粤 责造葬泽皂蚤凿 枣则燥皂 葬
灶燥灶鄄蚤灶泽藻糟贼鄄贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤遭造藻 造蚤灶藻 燥枣 葬 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 造葬糟噪泽 贼憎燥 燥责藻灶 则藻葬凿鄄
蚤灶早 枣则葬皂藻泽 贼澡葬贼 藻曾蚤泽贼 蚤灶 贼澡藻 责造葬泽皂蚤凿 枣则燥皂 贼澡藻 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 造蚤灶藻 咱 允暂 援
郧藻灶藻袁 圆园园圆袁 圆怨愿院 员怨缘 原 圆园员
咱员远暂 蕴蚤灶 悦 蕴袁 在澡燥怎 栽袁 蕴蚤 匀 云袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽葬贼蚤燥灶 燥枣 贼憎燥
责造葬泽皂蚤凿泽 枣则燥皂 责葬怎造燥憎灶蚤葬 憎蚤贼糟澡藻泽忆鄄遭则燥燥皂 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 葬灶凿 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶
燥枣 葬 责造葬泽皂蚤凿 藻灶糟燥凿藻凿 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 蚤灶枣藻糟贼藻凿 责造葬灶贼泽咱允暂 援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则鄄
灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 员圆猿院猿圆员 原 猿猿园
咱员苑暂 林彩丽援泡桐丛枝病植原体质粒分子特征及其编码蛋白功能研
究咱阅暂援北京院中国农业大学袁 圆园园愿
咱员愿暂 杂怎扎怎噪蚤 杂袁 韵泽澡蚤皂葬 运袁 运葬噪蚤扎葬憎葬 杂袁 藻贼 葬造援 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻
皂藻皂遭则葬灶藻 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 葬 责葬贼澡燥早藻灶 葬灶凿 蚤灶泽藻糟贼 皂蚤糟则燥枣蚤造葬皂藻灶贼 糟燥皂责造藻曾
凿藻贼藻则皂蚤灶藻泽 蚤灶泽藻糟贼鄄增藻糟贼燥则 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠咱允暂 援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻 晕葬贼蚤燥灶葬造
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咱员怨暂 陨泽澡蚤蚤 再袁 运葬噪蚤扎葬憎葬 杂袁 匀燥泽澡蚤 粤袁 藻贼 葬造援 陨灶 贼澡藻 灶燥灶鄄蚤灶泽藻糟贼鄄贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤鄄
遭造藻 造蚤灶藻 燥枣 燥灶蚤燥灶 赠藻造造燥憎泽 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 渊韵再鄄晕陨酝冤袁 贼澡藻 责造葬泽皂蚤凿鄄藻灶鄄
糟燥凿藻凿 贼则葬灶泽皂藻皂遭则葬灶藻 责则燥贼藻蚤灶 韵砸云猿 造葬糟噪泽 贼澡藻 皂葬躁燥则 责则燥皂燥贼藻则 则藻早蚤燥灶
咱允暂 援 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 员缘缘院圆园缘愿 原 圆园远苑
咱圆园暂 孕怎则糟藻造造 粤 匀援 陨灶泽藻糟贼 增藻糟贼燥则 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责泽 憎蚤贼澡 责则燥糟葬则赠燥贼蚤糟 责造葬灶贼
责葬贼澡燥早藻灶泽咱允暂 援 粤灶灶怎葬造 砸藻增蚤藻憎 燥枣 孕澡赠贼燥责葬贼澡燥造燥早赠袁 员怨愿圆袁 圆园院猿怨苑 原
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贼藻灶糟赠 凿藻责藻灶凿泽 燥灶 糟澡则赠泽葬灶贼澡藻皂怎皂 赠藻造造燥憎泽 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 凿蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶
憎蚤贼澡蚤灶 耘怎泽糟藻造蚤凿蚤怎泽 增葬则蚤藻早葬贼怎泽 咱 允暂 援 耘灶贼燥皂燥造燥早蚤葬 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造蚤泽 藻贼
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贼蚤燥灶 枣则燥皂 贼澡藻 皂蚤凿早怎贼 凿藻贼藻则皂蚤灶藻泽 蚤灶糟燥皂责藻贼藻灶糟藻 燥枣 泽皂葬造造 遭则燥憎灶 责造葬灶鄄
贼澡燥责责藻则 葬泽 葬 增藻糟贼燥则 燥枣 杂燥怎贼澡藻则灶 则蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽咱允暂 援
灾蚤则怎泽 砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园员圆袁 员远苑院源园源 原 源园愿
咱圆猿暂 郧葬造藻贼贼燥 蕴袁 月燥泽糟燥 阅袁 月葬造藻泽贼则蚤灶蚤 砸袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 皂葬躁燥则 葬灶贼蚤早藻灶蚤糟 皂藻皂鄄
遭则葬灶藻 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 野悦葬灶凿蚤凿葬贼怎泽 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬 葬泽贼藻则蚤泽冶 泽藻造藻糟贼蚤增藻造赠 蚤灶贼藻则鄄
葬糟贼泽 憎蚤贼澡 粤栽孕 泽赠灶贼澡葬泽藻 葬灶凿 葬糟贼蚤灶 燥枣 造藻葬枣澡燥责责藻则 增藻糟贼燥则泽咱 允暂 援 孕蕴燥杂
韵晕耘袁 圆园员员袁 远渊苑冤院 藻圆圆缘苑员
园园缘