全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 4) : 574 鶫 580
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 04-0574-07
灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定
尹立伟, 池玉杰, 王雪童
( 东北林业大学林学院 , 黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要: 对灰树花菌株迁西二号进行了 ITS 序列扩增与测序 ( GenBank 登录号为 GU584099) , 并对灰树花及相关白腐
菌进行了基于 ITS 序列的系统发育分析, 结果表明灰树花与 Grifola sordulenta ( Mont. ) Singer 等白腐菌的亲缘关系
较近。采用 LNAS( 低氮天冬酰胺-琥珀酸) 培养基添加 4 种不同底物, 对菌株迁西二号在 25 ℃恒温下静置培养, 得
到了不同时间内的培养液, 用紫外可见分光光度计分别检测了在 470 、420 、310 nm处对于 2, 6-二甲氧基苯酚 ( 2, 6-
DMP) 、2, 2’-连氮-双( 3-乙基苯并?唑-6-磺酸) ( ABTS) 、3, 4-二甲氧基苯甲醇 /藜芦醇( VA) 的氧化作用后光密度值
的变化情况, 作为锰过氧化物酶( MnP) 、漆酶( Laccase) 和木质素过氧化物酶( LiP) 产生和活性大小的依据, 从而获
得了灰树花木质素降解酶系统的主要酶系及其与培养基的成分和酶作用底物的基本关系。结果表明, 灰树花可产
生 MnP和漆酶, 但不产生 LiP; 对比 4 种成分不同的培养液酶活力测定结果, 未添加底物的培养液 MnP 最大酶活仅
为 2.96 U·L - 1 , 漆酶最大酶活仅为 4.49 U·L - 1。添加底物木屑和 2, 6-DMP后 MnP 最大酶活为 8. 06 U·L - 1 , 漆
酶最大酶活为 9. 85 U·L - 1 , 表明在培养液内添加酶的底物木屑后能轻微地提高两种酶的分泌量。
关键词: 灰树花; ITS 序列; 木质素降解酶系统; 锰过氧化物酶; 漆酶
中图分类号: S718.81 文献标识码: A
收稿日期 : 2010-02-09
基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( 30671700 ) 。
作者简介 : 尹立伟 ( 1981— ) , 女 , 黑龙江双鸭山人 , 硕士 , 主要研究方向真菌生物学。E-mail: kaixinliwei@ 163. com
通讯作者 : 池玉杰 , 女 , 辽宁葫芦岛人 , 教授 , 主要研究方向林木病理学。E-mail: chiyujienefu@ 126. com
Phylogenetic Analysis and Detection on the Major Ligninolytic
Enzymes System of Grifola frondosa
YIN Li-wei, CHI Yu-jie, WANG Xue-tong
( School of Forestry , Northeast Forestry University , Harbin 150040, Heilongjiang, China)
Abstract: ITS sequence of Grifola frondosa strain qx2 was amplified and sequenced ( GenBank accession number:
GU584099) , a phylogenetic analysis was performed on G. frondosa qx2 and its related white-rot fungi. The results
showed that G. frondosa and G. sordulenta had the closest genetic relationship, and G. frondosa was closer to other
several white-rot fungi. The strain was stilly cultured at 25 ℃ under 4 different kinds of LNAS ( Low Nitrogen
Asparagine Succinic acid) culture solution, the extracellular enzyme solutions were sampled at different interval,
OD values of the solutions, representing manganese peroxidase ( MnP) , Laccase and lignin peroxidase ( LiP)
activities, were measured spectrophotometrically by monitoring the oxidation of 2, 6-DMP at 470 nm, ABTS at 420
nm and veratryl alcohol( VA) at 310 nm, the lignin-degrading enzymes of the fungus and the relationships between
enzyme activities and medium composition and substrates were gained. Results indicated that G. frondosa could
produce MnP and Laccase simultaneously, but no Lip. Substrates wood sawdust could slightly enhanced MnP and
Laccase activities. The biggest MnP and Laccase activity were 2. 96 U·L - 1 and 4. 49 U·L - 1 when no substrates
were added, and 8. 06 U·L - 1 and 9. 85 U·L - 1 when substrates added.
Key words: Grifola frondosa; ITS sequences; ligninolytic enzymes; manganese peroxidase; Laccase
第 4 期 尹立伟等: 灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定
国内外的白腐菌研究者已对一些白腐菌的木质
素降解酶系统及其分子生物学进行了研究, 包括酶
活性与降解能力、产酶条件的优化、酶的纯化与蛋白
结构和功能研究、基因的克隆及表达等方面, 所研究
的白腐菌主要包括金孢展齿革菌 Phanerochaete chry-
sosporium Burds、虫拟蜡菌 Ceriporiopsis subvermispora
( Pilát) Gilb. & Ryvarden、糙皮侧耳 Pleurotus ostrea-
tus( Jacq. ) P. Kumm. 、云芝栓菌 Trametes versicolor
( L. : Fr. ) Quél. 、射脉菌 Phlebia radiata Fr. 、粗毛栓
菌 Trametes gallica Fr. 、好食脉孢菌 Neurospora sito-
phila Shear & B. O. Dodge、偏肿栓菌 Trametes gibbosa
( Pers. ) Fr. 等菌种 [ 1 - 8 ] 。白腐真菌漆酶基因的克
隆、表达研究较为深入, 目前已有金针菇 Flammulina
velutipes( Curtis) Singer、粗糙脉孢菌 N. crassa Shear
& B. O. Dodge 等几种白腐菌的漆酶基因得到了克
隆 [ 9 - 10 ] , 而多种其它白腐菌 MnP 的酶学和分子生物
学研究也正在进行中。
灰树花 G. frondosa( Dicks. ) Gray既是一种营养
丰富的珍稀食药用菌, 又是一种白腐菌, 生长在多种
阔叶树基部。已在日本和我国河北、浙江等省有较
大规模的人工栽培。目前已对该菌种的栽培技术、
多糖的纯化和结构、保健功能和抗肿瘤效应以及相
关基因等有了较深入的研究 [ 11 - 15 ] 。对于其系统发
育分析, Shen 等 [ 16 ] 曾对绝大多数来源于北美东部、
亚洲的 51 个灰树花菌株进行基于 ITS 序列和 β-微
管蛋白基因的系统发育分析, 结果表明这些菌株可
以明确地分为北美和亚洲 2 大类群; 张美彦等 [ 17 ] 也
利用 ITS-RFLP 及 SRAP 标记对不同来源的 25 个灰
树花菌株进行了种质评价。本文中所用的灰树花菌
株迁西二号购自河北省迁西县食用菌研究所, 该所
拥有 3 个灰树花菌株: 迁西一号、迁西二号、迁西三
号。其中迁西二号朵型中等, 菌盖灰黑色, 子实体分
化好, 柄短, 菇型好, 适宜保鲜, 也比较适合北方低温
地区栽培。目前还没有包括迁西二号菌株在内的多
个灰树花菌株的 ITS 序列分析及与其他相关白腐菌
的系统发育分析, 对灰树花降解木质素的酶学和分
子生物学也没有具体研究。由于灰树花既有食药用
价值, 又有潜在的可降解木质素及多环芳烃类物质
的能力, 因此, 研究其分子系统发育及降解木质素的
酶和基因具有意义, 例如国外已有对既是食药用菌
又是白腐菌的扁芝 Elfvingia applanata ( Pers. ) P.
Karst. 、双孢蘑菇 Agaricus bisporus ( J. E. Lange) Im-
bach、香菇 Lentinula edodes ( Berk. ) Pegler 等的锰过
氧化物酶及其基因进行了研究 [ 18 - 20] 。在真菌酶活
性研究中, 不同的真菌菌种和同种真菌不同菌株之
间存在着酶活性的差异; 对于同一真菌菌株, 培养基
的成分、不同的培养条件也会影响到酶的产生和活
性的大小。本文对灰树花菌株迁西二号进行了 ITS
序列扩增和测序, 并对灰树花及相关白腐菌进行了
基于 ITS 序列的系统发育分析; 在以 LNAS( 低氮天
冬酰胺-琥珀酸) 培养基为基础培养基并分别添加 4
种不同的酶作用底物条件下, 对其锰过氧化物酶、漆
酶和木质素过氧化物酶的活性进行了测定, 目的是
搞清灰树花与其它白腐菌的亲缘关系, 及木质素降
解酶系统的主要酶系与培养基的成分和酶作用的底
物等条件的关系, 为深入研究灰树花分解木质素的
酶系统作用机理, 以及分解木质素的酶基因表达调
控等分子生物学机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 菌种来源
灰树花菌株迁西二号 [ G. frondosa ( Dicks. )
Gray] qx2 于 2002 年从河北省迁西县购入, 保存在
东北林业大学森林保护学科森林病虫病理实验室。
1.2 培养基
PDA 培养基: 马铃薯 200 g, 琼脂 20 g, 葡萄糖 20
g, 加水定容至 1 000 mL, pH 值自然。
马铃薯加富培养基: 马铃薯 200 g, 琼脂粉 20 g,
葡萄糖 20 g, MgSO4 1. 5 g, KH2PO4 3. 0 g, VB1 0. 04
g, 酵母膏 2. 5 g, 加水定容至 1 000 mL, pH 值自然。
产酶基础培养基: 低氮天冬酰胺-琥珀酸培养基
( LNAS, Low Nitrogen Asparagine Succinic acid)
[ 21 - 2 2]
,
是一种营养成分有限的基础产酶培养基。
1.3 ITS序列扩增与系统发育分析
将在 PDA 培养基上保存的灰树花斜面菌种切
取 5 mm2 的小块, 接种在马铃薯加富平板培养基的
中心, 在 25 ℃下静置培养 12 天, 此时菌种接近生长
到平板边缘, 刮取菌落边缘的新鲜菌丝用于基因组
DNA 的提取。使用 TIANGEN 公司的 DNAquick_快
捷型植物基因组 DNA 提取系统及相关方法提取真
菌基因组 DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯
度和大小, 然后将 DNA 稀释到终浓度为 10 鶫 100
ng·μL - 1 用于 PCR 反应。应用真菌通用引物对
ITS1 ( 5 ’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’) 和 ITS4
( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 扩增含有 ITS1
和 2 及 5. 8s rRNA 基因片段的核 rDNA 序列。 ITS-
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
PCR 扩增体系如下: 10 ×PCR Buffer 5 μL, dNTP
( 2. 5 mmol·L - 1 ) 4 μL, ITS1 和 ITS4 引物( 10 μmol
·L- 1 ) 各 1 μL, Taq DNA 聚合酶 ( 5 U·μL) 0. 25
μL, 模板 DNA 1 μL , 用 ddH2 O 补足至 50 μL。PCR
扩增参数如下: 94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 S,
55 ℃退火 45 S, 72 ℃延伸 2 min, 共 30 个循环, 最后
72 ℃延伸 10 min, 终止温度在 4 ℃。PCR 产物经
1. 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。将 PCR 产物直接测序
获得 ITS 区序列, 将获得的灰树花菌株迁西二号的
ITS 区序列提交到 NCBI 的 GenBank 中去, 与其中已
有的序列进行 BLAST 比对, 从比对结果中选取相关
性的菌种并下载其 ITS 序列, 采用 ClustalX 1. 83 对
这些基因序列进行比对, 运用分析软件 MEGA 4. 1
中的 UPGMA 聚类法构建系统发育树。
1. 4 产酶培养方式
在 250 mL 三角瓶中加入 70 mL LNAS 培养基,
分别添加 4 种不同底物进行菌种培养: A. LNAS 培
养基不含 Mn2 + , 即矿物元素溶液中不添加 MnSO4·
H2 O; B. LNAS 培养基含 Mn2 + ( 2. 67 ×10 - 3 mmol·
L- 1 ) , 即矿物元素 溶液中添加 MnSO4 · H2 O; C.
LNAS 培养基含 Mn2 + ( 2. 67 ×10 - 3 mmol·L - 1 ) , 并
加入 2 g青杨( Populus ussuriensis Kom. ) 木屑为产酶
底物; D. LNAS 培养基含 Mn2 + ( 2. 67 ×10 - 3 mmol·
L
- 1
) , 并加入 10 mmol·L - 1 2, 6-二甲氧基苯酚 ( 2,
6-DMP) 0. 1 mL为产酶底物。
所有的培养液高压灭菌 15 min, 接菌前向每个
灭菌的三角瓶中加入 5 mL 除菌的 15% 葡萄糖溶
液。将保藏在马铃薯 加富培养基上的灰树花菌
种 [ 15] 先接种至 PDA 平板培养基 ( 9 cm) 上, 25 ℃培
养 10 天, 8 mm打孔器于培养皿菌丝边缘打孔, 将菌
饼转接至灭菌后的三角瓶中, 每个三角瓶加入 5 块
菌饼, 25 ℃静止培养, 每项试验设 3 个重复。培养
至 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 天提取培养液即胞
外酶液, 每个三角瓶中每次提取酶液 1. 3 mL, 将提
取的粗酶液离心 ( 13 200 r·min - 1, 室温 ) 5 min, 取
上清液进行酶活测定后冷藏于 - 20 ℃冰箱。
1. 5 酶活测定方法
利用紫外可见分光光度计 ( Ultrospec 4 300pro,
Amersham) 检测一定光波下光密度值的变化情况作
为酶活性大小的依据。漆酶以 2, 2’-连氮-双 ( 3-乙
基苯并?唑-6-磺酸) ( ABTS) 法 [ 23] , 测定体系 1 mL,
其中丙二酸钠缓冲液 ( 50 mmol·L - 1 ) 850 μL, 酶液
样品 100 μL, ABTS( 20 mmol·L - 1 ) 50 μL, 于 420
nm处测定吸光度在 3 min 内的变化值。MnP 以 2,
6-二甲氧基苯酚 ( 2, 6-DMP) 法 [ 24 ] , 测定体系 1 mL,
其中丙二酸钠缓冲液( 50 mmol·L- 1 ) 840 μL, Mn-
SO4 ( 10 mmol· L - 1 ) 50 μL, 2, 6-DMP( 10 mmol·
L
- 1
) 50 μL, 酶液样品 50 μL, H2O2 ( 10 mmol·L - 1 )
10 μL启动反应, 于 470 nm 处测定吸光度在 1 min
内的变化值。Lip 以藜芦醇 ( VA) 法 [ 2 5] , 测定体系
1 mL, 其中酒石酸钠缓冲液 ( 100 mmol·L - 1 , pH 值
3. 0) 340 μL, 藜芦醇 ( 20 mmol·L - 1 ) 100 μL, 酶液
样品 550 μL, H2 O2 ( 54 mmol·L
- 1
) 10 μL 启动反
应, 于 310 nm处测定吸光度在 1 min 内的变化值。
空白对照不加酶液以 1 mL 的去离子水在相同条件
下进行。所有测量均设 3 组重复取平均值。酶活单
位( U·L - 1 ) : 上述条件下, 每分钟催化 1 μmol 2,
6-DMP、ABTS或 VA 所需的酶量。计算中的 ε420 =
36 000 mol·L- 1· cm- 1、ε47 0 = 49 600 mol·L- 1 ·
cm
- 1、ε31 0 = 9 300 000 mol·L
- 1· cm- 1。计算酶活
值后绘制出产酶活时间曲线图, 并利用 PASW 软件
数据处理系统对 4 种不同的培养液产生 MnP 的活
性进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 灰树花菌株迁西二号的 ITS 序列与系统发育
分析
灰树花菌株迁西二号( G. frondosa qx2) ITS 区域
的 PCR 产物测序得到了 508 bp 的核苷酸序列, 将该
序 列 提 交 到 GenBank ( NCBI accession number:
GU584099) 中后的鉴定结果表明, 1 鶫 189 bp 为
ITS1 序列, 190 鶫 346 bp 为 5. 8S rDNA 序列, 347 鶫
508 bp 为 ITS2 序列。在 GenBank中, G. frondosa qx2
与 100 个菌株的 BLAST 比对结果表明, 该 100 个菌
株中有 61 个 G. frondosa 不同菌株, G. frondosa qx2
与其中的 26 个菌株同源性达 99% , 与 32 个菌株同
源性达 98% , 与 3 个菌株同源性达 97% 。在另外 39
个非同种的不同菌株中, G. frondosa qx2 与 G. sordu-
lenta( Mont. ) Singer G01 同源性达 89% , 与 G. sor-
dulenta PDD: 86931 的同源性达 88% ; 与密孔菌属
Pycnoporus Karst. 、栓菌属 Trametes Fr. 、革孔菌属 Co-
riolopsis Murr. 、多孔菌属 Polyporus Mich. ex Fr. 、革
裥菌属 Lenzites Fr. 、迷孔菌属 Daedalea Pers. ex Fr. 、
小薄孔菌属 Antrodieila Ryv. & Johan. 等木腐菌的 37
个菌株的同源性均为 86% 。另外, 在上述 100 个菌
株之外, G. frondosa qx2 与猪苓( G. umbellata ( Pers.
675
第 4 期 尹立伟等: 灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定
ex Fr. ) Pilát) 的两个菌株 GUB 和 GUF 同源性为
85% 。从 100 个菌株中选取 35 个相关性菌株, 再加
上猪苓的两个菌株 GUB 和 GUF, 与 G. frondosa qx2
按照 UPGMA 聚类法进行菌株间遗传距离分析, 构
建的系统发育树见图 1。从图 1 可以看出, 图中的
38 个菌株分为 2 大类群, 36 个菌株聚成 1 个大类群
Ⅰ, 2 个猪苓菌株聚成类群Ⅱ。大类群Ⅰ下又聚成 2
个较大的亚类群。亚类群Ⅰ包括密孔菌属、栓菌属、
革孔菌属、多孔菌属、迷孔菌属、革裥菌属、小薄孔菌
属、奇果菌属 Grifola Mich. ex S. F. Gray 的 20 个菌
株。亚类群Ⅱ中来自于不同地区的 G. frondosa 的
16 个菌株聚为 2 个小类, 其中来自挪威 G. frondosa
isolate WC493 菌株聚为小类( 1) , 其他的 15 个菌株
聚为小类 ( 2) 。G. frondosa qx2 与我国台湾的 G.
frondosa isolate M021 关系最密切, 与其他 13 个菌株
的关 系 也 很 近, 包 括 我 国 的 G. frondosa isolate
M035、G. frondosa isolate M036、G. frondosa isolate
M037、G. frondosa isolate M038、G. frondosa isolate
M039; 巴勒斯坦 G. frondosa isolate WC248; 马里兰州
G. frondosa isolate WC483; 洛杉矶 G. frondosa isolate
M009; 韩国 G. frondosa isolate WC557; 日本 G. fron-
dosa isolate WC835; 纽约州 G. frondosa isolate M008;
丹麦 G. frondosa isolate M003 和来源不详的 G. fron-
dosa strain HMY, 它们之间的 ITS 序列同源性均达
到 99% , 遗传距离很接近, 可以认为是同一菌种分
布于不同地区的菌株。
图 1 基于 ITS 序列的灰树花及相关白腐菌 UPGMA 聚类法系统发育树
( 树枝上的数字表示 Bootstrap 验证中该树枝的可信度 )
2.2 灰树花 4种培养液中 LiP 的酶活测定
在 4 种不同的培养液中分别对 LiP 的酶活进行
检测, 但在 310 nm 处均未检测到吸光值的变化, 表
明灰树花不产生 LiP。
2.3 灰树花在 4 种不同的培养液中 MnP 酶活性
变化
在 21 天的培养过程中 , 灰树花在不含 Mn2 + 的
775
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
LNAS培养基不加底物条件下 , 提取的酶液未检测
到 MnP的活性 ; 在含 Mn2 + 的 LNAS 培养基中不加
底物条件下 , 提取的酶液可以检测到 MnP 的活性
变化, 但活性很低, 15 天达到分泌高峰, 最大酶活
力仅为 2. 96 U·L - 1。对比 A、B 两种培养液的检
测结果表明 , Mn2 + 是灰树花产生 MnP的必要因子,
在诱导产生 MnP 的过程中起着关键作用。在含
Mn2 + 的 LNAS培养基中加入木屑为底物条件下, 提
取的酶液检测到 MnP 的活性变化 , MnP 在 15 天达
到最大分泌量 , 酶活力为 8. 06 U·L - 1 ; 在含 Mn2 +
的 LNAS 培养基中加入 2, 6-DMP 为底物的条件
下, 提取的酶液也检测到 MnP 的活性变化 , MnP 在
13 天达到最大分泌量, 酶活力为 3. 89 U·L - 1。对
比 C、D 两种培养过程中 MnP 的产生结果 , 表明在
培养过程中添加木屑和 2, 6-DMP 为底物都可以提
高 MnP的产生量 , 底物对于灰树花木质素降解酶
系统可产生诱导作用。在以 2, 6-DMP 为底物时
MnP达到最大分泌量的时间也有缩短。以木屑为
底物 MnP的产量要高于以 2, 6-DMP 为底物的 MnP
产生量, 其吸收峰在 470 nm处有明显的峰值变化,
而其它 3 种培养方式的 MnP吸光度和吸收峰表现
为不明显的变化。21 天 内灰树花在 4 种培养液中
产生 MnP 的情况见图 2。3 组重复数据的误差线
标注其上。
图 2 4 种培养液中 MnP 活性随时间的变化
方差分析结果表明, 培养液与培养时间的 Sig.
值都小于 0. 05, 表明培养液之间、不同培养时间之
间的 MnP活性差异都显著( 见表 1) 。4 种不同的培
养液 MnP的活性差异显著, 其中培养液 C 与 A 均值
差值最大; 培养液 C 随着时间的变化 MnP 在 15 天
的均值与 3 天的均值差值最大。
2. 4 灰树花在 4种不同的培养液中漆酶酶活性变化
在21天的培养过程中 , 灰树花在不含Mn2 + 的
表 1 MnP 方差分析
来源 平方和 df 均方 F Sig.
( P = 0 . 05)
校正模型 291. 916a 39 7. 485 14. 624 0 . 000
截距 223. 891 1 223. 891 437. 438 0 . 000
培养液 105. 612 C 35. 204 68. 782 0 . 000
时间 80. 591 9 8. 955 17. 495 0 . 000
培养液 * 时间 105. 712 27 3. 915 7. 650 0 . 000
误差 40. 946 80 0. 512
总计 556. 752 120
校正的总计 332. 861 119
LNAS培养基不加底物条件下, 提取的酶液可以检测
到的漆酶的活性, 在 9 天达到最大分泌量, 酶活力仅
为 2. 99 U·L - 1; 在含 Mn2 + 的 LNAS 培养基中不加
底物条件下, 提取的酶液可以检测到漆酶的活性, 也
在 9 天时达最大分泌量, 酶活力达 4. 49 U·L- 1。对
比 A、B 两种培养液的检测结果表明, 漆酶的产生不
受 Mn2 + 的制约, 但在含 Mn2 + 的 LNAS 培养基中漆
酶的活性略有提高。在含 Mn2 + 的 LNAS 培养基中
加入木屑为底物条件下, 提取的酶液检测到漆酶的
活性变化, 漆酶在第 11 天达到最大分泌量, 酶活力
为 9. 85 U·L - 1; 在含 Mn2 + 的 LNAS 培养基中加入
2, 6-DMP为底物的条件下, 提取的酶液也检测到漆
酶的活性变化, 在 9 天达到最大分泌量, 酶活力为
6. 38 U·L - 1。对比 C、D 两种培养过程中漆酶的产
生结果, 表明在培养过程中添加木屑和 2, 6-DMP为
底物都可以提高漆酶的产生量, 底物对于灰树花木
质素降解酶系统可产生诱导作用。在以 2, 6-DMP
为底物时漆酶达到最大分泌量的时间也有缩短。以
木屑为底物漆酶的产量要高于以 2, 6-DMP 为底物
的漆酶产生量, 其吸收峰在 420 nm处有明显的峰值
变化, 而其它 3 种培养方式的漆酶吸光度和吸收峰
表现为不明显的变化。21 天内灰树花在 4 种培养
液中产生漆酶的情况见图 3。3 组重复数据的误差
线标注其上。
图 3 4 种培养液中漆酶活性随时间的变化
875
第 4 期 尹立伟等: 灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定
方差分析的结果表明, 培养液、培养液与时间的
Sig. 值都大于 0. 05, 表明培养液之间的漆酶活性差
异不显著; 而培养时间的 Sig. 值小于 0. 05, 表明差
异显著( 见表 2) 。4 种培养液随着时间的变化漆酶
在 9 天的均值与 3 天的均值差值最大。
表 2 漆酶方差分析
来源 平方和 df 均方 F
Sig.
( P = 0 . 05)
校正模型 419. 403 39 10. 754 2. 096 0 . 003
截距 526. 378 1 526. 378 102. 618 0 . 000
培养液 10. 210 C 3. 403 0. 663 0 . 577
时间 233. 634 9 25. 959 5. 061 0 . 000
培养液 ×时间 175. 559 27 6. 502 1. 268 0 . 207
误差 410. 360 80 5. 129
总计 1 356. 140 120
校正的总计 829. 763 119
3 讨论
本文对灰树花菌株迁西二号进行了 ITS 序列扩
增, 并对灰树花及相关白腐菌进行了基于 ITS 序列
的系统发育分析, 结果表明灰树花与奇果菌属、小薄
孔菌属等白腐菌聚类成群, 其 中与 G. sordulenta
( Mont. ) Singer 白腐菌的亲缘关系最近, 与 A. au-
rantilaeta( Corner) T. Hatt. & Ryvarden、D. microstic-
ta Cooke、L. warnieri Durieu & Mont. 等白腐菌的亲
缘关系较近。聚类分析结果也表明迁西二号与来自
我国台湾和我国大陆等地的 16 个灰树花菌株的遗
传距离很接近, 它们之间的 ITS 序列同源性均达到
99% 。由于亲缘关系相近、分类地位相同的生物种
的生物学特性也相似, 那么对于灰树花及相关白腐
菌进行系统发育分析, 可以推测它们至少某些生物
学特性也可能相似, 这还有待进一步的试验去证明。
今后可进行这些系统发育相近种分解木质素能力的
测定, 以鉴别它们在分解木质素能力方面是否有相
似性。
本文采用 LNAS培养基在 4 种不同培养液中对
白腐菌灰树花木质素降解酶系统的主要酶系锰过氧
化物酶( MnP) 、漆酶和木质素过氧化物酶( LiP) 的活
性进行了检测, 为研究灰树花产生的木质素降解酶
系统作用机制提供了基础酶学依据。结果表明, 灰
树花可同时产生 MnP 和漆酶。但不产生 LiP, 两种
酶的活性变化是有规律的。漆酶都是在 3 天之后产
生, 随之迅速地升高, 在第 9 鶫 11 天达到最高, 以后
迅速下降, 11 天之后就变得较低, 15 天之后趋向消
失。MnP也是在 3 天之后产生, 只是活性很低, 随之
逐渐升高, 在第 13 鶫 15 天达到最高, 以后又逐渐下
降, 17 天之后接近为 0。通过两种酶活性的检测, 也
获得了酶与培养基的成分和酶作用的底物等条件的
关系。对比 4 种成分不同的培养液酶活力测定结果
可以看出, Mn2 + 也是灰树花产生 MnP 的必要因子,
而漆酶的产生则不受该条件的制约。在培养液内添
加酶作用的底物木屑和 2, 6-DMP 后, 可以轻微地提
高 MnP和漆酶的分泌量, 表明底物对于灰树花木质
素降解酶系统产生的诱导作用。底物不同对于培养
过程中酶的产生影响也不同, 添加木屑为底物比添
加 2, 6-DMP 为底物的菌丝生长速度快、生物量高,
MnP和漆酶的产量也稍高, 原因可能是 2, 6-DMP本
身对灰树花菌丝的生长具有一定的抑制作用, 从而
阻碍了酶的分泌。以上两种酶的活性规律与其他白
腐菌的研究结果相似 [ 26] 。在 4 种培养过程中均未
观察到培养液颜色的变化。
从酶活性的检测结果还可以看出, 尽管灰树花
能够产生分解木质素结构的酶系统, 但是对比以往
的白腐菌分解木质素酶系统的酶活力, 灰树花的
MnP和漆酶的活性都较低, 表明不同白腐菌之间酶
的活性差异很大, 而灰树花是一种产生分解木质素
酶系统活性较低的白腐菌。首先, 在限制营养型
LNAS基础培养基的培养条件下, 灰树花表现出较低
的 MnP 和漆酶活性, 如灰树花在含 Mn2 + 但未添加
底物的培养液 MnP 最大酶活仅为 2. 96 U·L - 1 , 漆
酶最大酶活仅为 4. 49 U·L - 1 ; 而在相同培养条件
下, 红平菇的 MnP最大酶活为 5 U·L- 1, 漆酶最大
酶活仅为 36 U·L - 1 ; 偏肿栓菌的 MnP 最大酶活为
13 U· L - 1 , 漆酶最大酶活仅为 38 U·L - 1。在含
Mn2 + 的 LNAS 培养基中加入木屑为底物条件下, 灰
树花 MnP最大酶活为 8. 06 U·L- 1 , 漆酶最大酶活
为 9. 85 U· L - 1 ; 而在相同培养条件下, 红平菇的
MnP最大酶活为 69 U·L - 1 , 漆酶最大酶活为 205 U
·L - 1 ; 偏肿栓菌的 MnP最大酶活为 165 U·L - 1 , 漆
酶最大酶活为 445 U·L- 1 [ 8 , 27] 。其次, 在添加两种
底物后, 两种酶的活性增加都不高。再者, 两种酶活
性在最大值前后都表现出波动起伏的现象, 也体现
了酶活力较弱和不稳定的特征。
本文对 MnP、漆酶和 LiP 的酶活检测, 采用了
LNAS液体培养基, 这是一种营养成分有限的基础产
酶培养基, 虽然可以检测菌种是否能够产生 MnP、漆
酶和 LiP, 但是酶活力并不是很高。如需提高酶活
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
力、缩短产酶时间, 还需进一步选择加富营养型培养
基并对产酶条件进行优化。
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