全 文 ：林业科学研究 2009, 22( 2): 207~ 212
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2009) 02020706
北方地区黑杨派栽培品种的 AFLP指纹分析
李金花1, 宋红竹 2, 周春江 3, 牛正田 1, 张绮纹 1, 王 斌3
( 1.中国林业科学研究院林业研究所,国家林业局林木培育重点实验室,北京 100091;
2.国家林业局科技发展中心,北京 100714; 3.中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京 100101)
摘要: 以我国北方地区杨树人工林广泛种植的 10个黑杨派品种 ( 36杨、50杨、107杨、108杨、111杨、加杨、沙兰杨、
I214杨、109杨和 110杨 )为实验材料,先进行了苗期形态特征分析,并利用 AFLP标记技术,选用 ETA /MCAG和
ETC /MCAG两对选择性扩增引物组合, 获得了 12条特异性条带, 建立了这 10个杨树品种的 DNA指纹图谱, 每个
品种的扩增带型互不相同,可为杨树品种或无性系鉴定提供独特的特征。结果表明: 利用 AFLP DNA指纹图谱可以
灵敏地鉴别相近无性系并与形态学鉴别分类结论相吻合,表明 DNA指纹鉴定配合形态学鉴定方法具有较高的准确
性和有效性。
关键词: 杨属;黑杨派; 形态分类; AFLP; DNA指纹; 品种鉴定
中图分类号: S722. 3 文献标识码: A
收稿日期: 20081219
基金项目: 国家林业局标准制定项目 杨树新品种分子指纹图谱 ( [ 2001]林科标 002号 )
作者简介: 李金花 ( 1970! ) ,女,新疆石河子人,副研究员,林木遗传育种学博士.
AFLP Fingerprinting for 10 Cultivars of Section Aigeiros
W idely Planted in North China
LI J inhua1, SONG Hongzhu2, ZHOU Chunjiang 3, N I U Zhengtian1, ZHANG Qiw en1, WANG Bin3
( 1. Research Ins titu te ofForestry, CAF, Key Laboratory ofT ree B reed ing and Cu lt ivat ion, S tate Forestry A dm in is tration, B eijing 100091, Ch ina;
2. Cen tre of Science and T echnology, S tate Forestry A dm in is tration, B eijing 100714, Ch ina; 3. S tate K ey Laboratory of Plan tGenom ics,
Inst itu te of Genet ics and Developm en talB iology, Ch inese Academ y of Sciences, Bei jing 100101, Ch ina)
Abstract: Ten cultivars of the sect ion Aigeiros w idely p lanted in North Ch ina for poplar cu lture and intensive forest
planta tions w ere selected forAFLP fingerprinting, includingP. delto ides Bartr. c l ∀2KEN8# , P. d eltoid esMarsh.
c.l ∀D rava# ( 55 /65 ) , P. ∃ euramericana Moench c.l ∀N eva# ( 74 /76 ) , P. ∃ euramericana Moench cl
∀Guariento # , P. ∃ euramericana M oench cl ∀Bellotto# , P. ∃ euramericana Moench c.l ∀ Jiayang # , P. ∃
euramericana Moench c l ∀ Sacrau79# , P. ∃ euram ericana M oench c l ∀ I214# , P. delto ides ∃ P. alba c.l
∀M inc io# , P. deltoides Marsh. ∃ P. max imow iczii Henry c.l ∀E ridano# . Oneyearo ld p lantlets o f these ten
cu ltivars w ere used for morpho log ica l analysis in nursery. A s the results o f AFLP f ingerprinting for these ten
cu ltivars, 12 po lymorphic bands w ere amplified w ith tw o primer comb inations ETA /M CAG and ETC /M CAG
respective ly. B ased on the 12 re liable AFLP po lymo rph ic bands, the DNA fingerprint w as constructed to identify
these 10 cu lt ivars. In th is DNA fingerprin,t each genotype had its unique finger pattern and could be easily
dist inguished from the o thers. DNA fingerprinting analysis prov ides a good method for cultivars identification and
can overcom e the lim itations assoc iated w ith morpho log ical and o rig in data.
Key words: Populus; section Aigeiros; morpho logy; AFLP ( Amplif ied Fragmen t Leng th Po lymorph ism ); DNA
fingerprint ing; cultivar ident ification
林 业 科 学 研 究 第 22卷
杨树是我国重要造林树种之一, 我国杨树种质
资源十分丰富,世界上天然杨树约 100多种,而我国
就有 53种之多, 由于杨树多数种类亲和力很强, 种
间杂交和无性繁殖容易, 种间、组 (派 )间极易反复
杂交,使一些分类稳定的性状常常被打破, 有些形态
特征在种间交互存在,往往同一种的叶片形态在长、
短枝和萌枝上有显著差异, 而不同种或品种间的形
态特征却极为相似 [ 1]。传统的品种描述依赖于宏观
生物学特性和形态指标,难以区分形态极为相似或
亲缘关系极为相近的种或品种, 生产中易造成混种、
混系、混株, 出现了以次充好、以假乱真的现象,影响
了良种的增产效益,有时造成重大损失。因此,杨树
品种和无性系的准确鉴别对于杨树育种、种质资源
收集和保存、新品种注册登记等具有重要意义 [ 2]。
分子标记技术不受组织、发育时期、季节环境限
制,且信息数量极多、多态性高,适合分析杨树这样具
有大量种的群体,在无完整苗木和大树的情况下, 利
用一片嫩叶从 DNA水平上检测基因组的遗传变异,
获得高质量的 DNA指纹图谱,从而在较短时间内精
确、有效地对大量品种进行鉴定,是杨树品种和无性
系 (包括杂交亲本和自交系 )鉴别的有力工具,为保护
育种者的权益、新品种权申报、鉴定品种、仲裁苗木纠
纷和规范苗木市场提供客观、科学和准确的技术保
障 [ 2- 5]。目前,在现有十多种分子标记技术中, SSR
具有多态性好、共显性和重复性好的优点, 被认为是
非常理想的一种分子标记并已被用于杨树品种鉴
定 [ 2- 3, 6- 8] ,但其缺点是开发引物需要较长时间且费
用高,目前为止, 在杨树中已开发成功的 SSR引物还
不到 30对,并且这些引物是否通用于各种杨树还未
见报道 [ 9 ]。 AFLP 在植物中具有高水平的多态
性 [ 9- 11] ,还具有很好的重复性和准确性, 国内已将
AFLP成功用于主要作物和果树品种的指纹图谱及品
种鉴定, 如大白菜 (B rassica campestris L. ) [ 12]、萝卜
(Raphanus sativu L. )
[ 13]、苹 果 (Malus domestica
Borkh. )
[ 14]、桑树 (Morus alba L. ) [ 15 ]、罗汉果 ( Siraitia
grosvenorii ( Sw ing le ) C. Jefrey ex Lu et Z. Y.
Zhang )
[ 16]、梅花 (P runusmume L. ) [ 17 - 18]、甘蔗 ( Sac
charum off icinarum L. )
[ 19]等。目前,尹佟明等 [ 20]利用
AFLP进行了美洲黑杨 (Pupulus delto ides Bartr. )无性
系的遗传多样性和指纹分析, Zhou等 [ 21]利用 AFLP
对杨属 (Populus L. ) 5大派 44个种进行了遗传多样性
和指纹分析, 高建明等 [ 10] 对我国青杨派 ( Section
Tacamahaca )和黑杨派 ( Section Aigeiros)的一些栽培
品种进行了 AFLP指纹分析,胡晓丽等 [ 22]开展了三倍
体毛白杨 (P. tomentosa Carr. )无性系的 AFLP分子标
记鉴定研究,但北方地区杨树人工林大面积栽培的黑
杨派品种包括欧美杨 107杨、108杨等品种的形态特
征和 AFLP指纹图谱分析的研究,尚未见报道。
本文收集了经国家科技攻关项目成果鉴定或国
家 (省 )林木良种审认定的北方地区适宜种植的 10
个黑杨派杨树新品种, 并对其进行苗期叶片、叶芽、1
年生枝条等表型形态特征的观测,利用 AFLP对其
进行 DNA指纹图谱分析和品种鉴定研究,为杨树优
良品种的鉴定和选择提供可靠保障。
1 材料和方法
1. 1 材料
收集我国北方地区杨树人工林中广泛种植的
10个品种, 在中国林业科学研究院苗圃进行扦插育
苗,春季采集新萌发的幼叶, 用于植物基因组 DNA
提取;依照国际杨树委员会执行委员会文件 %关于杨
树品种登记的报告 &中形态特征及观测方法 [ 23- 24] ,
秋季 8月时观察叶片、叶芽、1年生枝条等表型形态
特征,并在北京地区调查这些品种的大树树皮特征,
一起归档。这 10个杨树品种均经过国家科技成果
鉴定或国家 (省 )林木良种审认定,详见表 1[ 25]。
表 1 用于构建 AFLP指纹图谱的 10个杨树品种
编号 品种名称 种名 雌雄 来源 /原产地
1 36杨 美洲黑杨 (P. del toid s Bartr. cl∀2KEN8# ) ∋ 北京 /意大利
2 50杨 美洲黑杨 (P. del toid sM arsh. c.l ∀D rava# ( 55 /65) ) ( 北京 /南斯拉夫
3 107杨 欧美杨 (P. ∃ euram ericana Moench c.l ∀N eva# ( 74 /76) ) ( 北京 /意大利
4 108杨 欧美杨 (P. ∃ euram ericana Moench cl ∀Guariento# ) ( 北京 /意大利
5 111杨 欧美杨 (P. ∃ euram ericana Moench cl ∀Bellotto# ) ( 北京 /意大利
6 加杨 欧美杨 (P. ∃ euram ericana Moench c.l ∀ Jiayang# ) ∋ 北京 /法国
7 沙兰杨 欧美杨 (P. ∃ euram ericana Moench cl ∀Sacrau79# ) ( 北京 /德国
8 I- 214杨 欧美杨 (P. ∃ eu ram ericanaM oench cl∀ I214# ) ( 北京 /意大利
9 109杨 美洲黑杨 ∃银白杨 (P. d eltoid s ∃P. a lba c.l ∀M in cio# ) ∋ 北京 /意大利
10 110杨 美洲黑杨 ∃马氏杨 (P. d eltoid sM arsh. ∃P. m axim ow iczii H enry c.l ∀E ridano# ) ∋ 北京 /意大利
208
第 2期 李金花等:北方地区黑杨派栽培品种的 AFLP指纹分析
1. 2 DNA提取
采用 CTAB法 [ 26]从幼叶中提取 DNA, 经纯化
后,以标准 DNA为对照,在 0. 8%琼脂糖凝胶电泳
上测定样品 DNA的浓度, 根据测定结果, 将所有样
品 DNA浓度稀释至 200 ng) L- 1。
1. 3 AFLP分析
按照 Vos等 [ 9 ]的方法,采用 Inv itrogen公司试剂
盒 AFLP Analysis System K it进行 AFLP分析, 并稍加
改进 [ 27]。 300 ng的基因组 DNA用于 E coR I和 M se
I酶切和连接反应, 反应产物被稀释 10倍后用作预
扩增反应的模板,预扩增选用 EcoR I+ A和 M se I+
C (EcoR I+ 0 /M se I+ C )引物组合, PCR反应程序
为: 90 ∗ 变性 30 s、56 ∗ 复性 60 s、72 ∗ 延伸 60 s,
共 20个循环。预扩增反应产物稀释 40倍后用作选
择性扩增反应的模板, 选择性扩增选用 E coR I+ 2 /
M se I+ 3引物组合 M CAG /ETA和 M CAG /ETC,
PCR反应程序为: 90 ∗ 30 s, 65 ∗ 30 s, 72 ∗ 60 s,
1个循环; 再进行递降温度梯度的 12个循环, 每个
循环中,复性温度逐级降低 0. 7 ∗ ,变性和延伸条件
同上; 90 ∗ 30 s, 56 ∗ 30 s, 72 ∗ 60 s, 23个循环。
选择性扩增反应产物加入等体积 ( 10 L)甲酰胺染
料 ( 98% 去离子甲酰胺, 10 mmo l EDTA pH 8. 0,
0. 15% 溴酚蓝, 0. 15%二甲苯氰 ), 混匀后于 94 ∗
变性 3m in,然后迅速置于冰上冷却。 6%聚丙烯酰
胺凝胶预电泳 30 m in,取 4 L变性后的样品上样,
100W横功率电泳 2. 5 h。采用许绍斌等 [ 28]的方法
进行银染,并适当优化。
接头和引物序列如下:
( 1)E coR I接头:
Adapter I( E ad1): 5+CTCGTAGACTGCGTACC3+
Adapter II( E ad2): 5+AATTGGTACGCAGTC3+
( 2)M se I接头:
Adapter I(M ad1) : 5+GACGATGAGTCCTGAG3+
Adapter II(M ad2) : 5+TACTCAGGACTCAT3+
预扩增引物 (E coR I+ 0 /M se I+ C ):
( 3)E coR I + 0( E000) :
5+GACTGCGTACCAATTC3+
( 4)M se I + C(M C00) :
5+GATGAGTCCTGAGTAAC3+
选择性扩增引物 (E coR I+ 2 /M se I+ 3) :
( 5) ETA: 5+GACTGCGTACCAATTCTA3+
( 6) ETC: 5+GACTGCGTACCAATTCTC3+
( 7)M CAG: 5+GATGAGTCCTGAGTAACAG3+
1. 4 AFLP分析和数据的转化
选取电泳图上清晰、易于辨认的 AFLP分析多
态性条带进行统计,根据 DNA分子量标准计算出各
扩增条带相应的片段大小 (近似值 ) ,以选择性引物
组合和分子量大小对条带进行命名, 并分别用 1
和 0 代表条带的 有 和 无 ,将 10个品种的每个
多态性条带转换为计算机语言, 利用计算机软件
STATIST ICA /w5. 0( StatSoft so ftw are Inc. , USA )模拟
出 AFLP分析图谱。
2 结果与分析
2. 1 品种苗期表型形态的鉴别
杨树无性繁殖主要是采用大树枝条、苗木根茎
或整株苗进行繁殖,我国杨树人工林栽培目前多数
使用 1年生带根苗或 2年根 1年干苗为造林苗, 而
不同种或品种间的苗木形态特征却极为相似, 在林
业生产上容易造成混种、混系、混株, 影响了良种的
增产效益,有时造成重大损失。因此,利用苗木表型
形态进行初步的形态识别和品种鉴定, 对于苗木利
用和人工林栽培具有重要意义 [ 1, 25]。
对参试的 10个杨树品种苗扦插繁殖生长 5个
月时,根据国际杨树委员会品种登记相关文件中的
方法 [ 23- 24] ,对其叶片、叶芽、1年生枝条等表型形态
特征进行了观测, 结果见表 2。在 10个参试品种中,
36杨和 50杨为美洲黑杨无性系, 叶基为心形; 107
杨、108杨、111杨、加杨、沙兰杨和 I214杨为 5个欧
美杨无性系, 加杨和沙兰杨的叶片尖端窄而渐尖,
109杨和 110杨分别为美洲黑杨与银白杨和马氏杨
的派间杂种, 110杨的典型特征为叶片长三角形。
在苗木的形态特征上, 107杨、108杨、111杨和 I214
杨相似性高, 加杨和沙兰杨相似,采用二岐分类法不
易将其一一区分开。例如, 108杨的苗期特征与 107
杨和其它欧美杨无性系非常相似, 在表型上进行品
种鉴别非常困难。
2. 2 AFLP分析结果与指纹图谱的构建
利用 M CAG /ETA和 M CAG /ETC两对选择
性引物组合, 对 10个杨树品种进行选择性扩增反
应,根据 AFLP分析的电泳图谱结果, 选取了清晰、
易于辨认的 12条多态性条带进行统计, 以 DNA分
子量标准为对应, 找出各条带相应的分子量大小, 从
而得到了 10个品种的指纹图谱 (表 3)。
209
林 业 科 学 研 究 第 22卷210
第 2期 李金花等:北方地区黑杨派栽培品种的 AFLP指纹分析
表 3 利用计算机语言统计出的杨属 10个品种指纹图谱
品种
MCAG
/ETA
245 bp
MCAG
/ETA
235 bp
MCAG
/ETA
230 bp
MCAG
/ETA
210 bp
MCAG
/ETA
120 bp
MCAG
/ETA
110 bp
M CAG
/ETC
500 bp
MCAG
/ETC
400 bp
MCAG
/ETC
350 bp
MCAG
/ETC
270 bp
MCAG
/ETC
190 bp
MCAG /
ETC
180 bp
36杨 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1
50杨 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0
107杨 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1
108杨 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1
111杨 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0
加杨 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
I214杨 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0
沙兰杨 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0
109杨 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1
110杨 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1
注: 1 为有特征带, 0 为缺失特征带。
根据 M CAG /ETA和 M CAG /ETC两对引物
组合的 AFLP分析结果的统计数据, 根据 12条特异
性条带的 有 或 无 , 建立了 10个参试品种的计
算机模拟 AFLP分析图谱, 直观地表现了每个品种
的特征条带 (图 1)。
10个供试杨树品种的 AFLP分析结果表现出了丰
富的多态性,每个品种都有自身独特的特异带,可以把
10个品种全部分开,而且每对引物组合在不同的品种
间也出现了共同的带,这表明 10个品种遗传背景的复
杂性,另一方面也表现出 10个品种的共同性。
图 1 利用计算机语言统计模拟出的 10个品种 AFLP分析的特异条带
2. 3 品种特征带与分子鉴定
传统的植物分类学其理论基础是建立在表型性
状分析上,而这些性状是来自形态学等与环境紧密
相关的表现型。从分子遗传学角度看, 表型的差异
归根到底还是基因型的差异,即在 DNA序列上的差
异。对这些基因组序列差异的比较研究为植物系统
与植物进化提供了最直接的依据 [ 11- 21]。
从 AFLP分析的指纹图谱 (图 1)上可以看出, 10
个供试杨树品种的扩增带型互不相同, 并且每个品
种都拥有自己的特征带,这些条带组合对于特定的
品种和引物组合是稳定的, 实验具有重演性。通过
这些多态性位点的不同条带组合 (表 2) , 可以采用
二岐分类法将供试的 10个杨树品种一一区分开, 并
以此作为杨树品种分子鉴定的重要依据。此外, 可
以通过这些供试杨树品种的特征条带加以快速鉴
定,例如,欧美杨 107杨拥有 1条特征带 M CAG /E
TC190 b p,而欧美杨 108杨拥有 3条特征带 M CAG /E
TA235 bp、M CAG /ETC270 bp、M CAG /ETC400 bp, 从而
可以将其从供试品种中识别,提高了品种鉴别效率。
3 结论与讨论
利用 AFLP分析建立的品种指纹图谱, 具有丰
富的多态性、较好的稳定性和较高的个体特异性 [ 9] ,
非常适合于品种鉴定等方面的应用 [ 10 - 11 ]。特别是
对于无性繁殖的杨树来说, 同物异名、同名异物现象
很严重,利用 AFLP得到的指纹图谱能够高效、准确
地建立指纹图谱、鉴别品种,也能鉴定杨树品种的真
实性和纯度, 确定品种的亲缘关系,以及用于新品种
211
林 业 科 学 研 究 第 22卷
登记和品种知识产权保护等。因此, 杨树品种指纹
图谱的构建具有重要应用价值 [ 21 ]。
本研究根据收集了我国北方地区杨树人工林和
城市绿化中广泛种植的杨树品种, 包括 36杨、50
杨、107杨、108杨、111杨、加杨、I214杨、沙兰杨、
109杨和 110杨等 10个品种, 其中, 107杨和 108杨
的推广总面积超过了 10万 hm 2 (截至 2006年底 ) ,
但这些品种在苗木形态特征上如叶片、叶芽和 1年
生枝条非常相似,很难一一区分开, 给林业生产也带
来了一些不便 [ 25]。
本研究利用 AFLP建立了上述 10个杨树品种
的 DNA指纹图谱,采用 M CAG /ETA和 M CAG /E
TC两对选择性引物组合, 对上述 10个杨树品种进
行了 AFLP分析, 证实了该方法能够产生较为丰富
的多态性以及稳定的 AFLP标记,建立了 10个杨树
品种的 DNA指纹图谱, 10个品种的扩增带型互不
相同,并且每个品种都拥有自己的特征带, 采用二岐
分类法可以将供试的 10个品种一一区分开,可以作
为 10个杨树品种鉴定的依据,为杨树品种和无性系
的鉴定提供了新的手段。
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