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Genetic Diversity of Toona ciliata from Different Provenances Based on Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers

不同种源红椿SRAP标记的遗传多样性分析



全 文 :第 52 卷 第 1 期
2 0 1 6 年 1 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52,No. 1
Jan.,2 0 1 6
doi:10.11707 / j.1001-7488.20160108
收稿日期: 2015 - 02 - 02; 修回日期: 2015 - 04 - 29。
基金项目: 国家林业局林业公益性行业科研专项(201004020)。
* 陈晓阳为通讯作者。
不同种源红椿 SRAP标记的遗传多样性分析*
李 培1,2 阙青敏2 欧阳昆唏2 李俊成2 湛 欣2 朱 芹3
张俊杰2 邓小梅2 陈晓阳2
(1. 北京林业大学生物科学与技术学院 北京 100083; 2. 华南农业大学林学与风景园林学院 广东省森林植物
种质创新与利用重点实验室 广州 510642; 3. 嘉应学院 梅州 514015)
摘 要: 【目的】由于过度采伐和天然更新能力较差等原因,红椿天然林分和林木的数量日益减少。深入研究红
椿不同种源的遗传多样性,揭示其群体结构分布,可为其种质资源保护和选择育种提供理论依据。【方法】利用相
关序列多态性分子标记(SRAP)对来自中国的 29 个种源及 1 个澳大利亚种源进行遗传多样性分析。各种源地选
取母树 30 株,株距 50 m 以上。澳大利亚种源取自华南农业大学红椿资源收集圃。利用 POPGENE1. 32,NTSYS-
pc2. 1,GenAIEx 6. 5 和 STRUCTRUE 2. 3 进行遗传参数估计、聚类图构建、主坐标分析、地理隔离模式构建及遗传结
构分析。【结果】24 对 SRAP 引物组合共扩增出 505 条多态性条带,引物的多态信息含量(PIC)均值为 0. 41; 30 个
红椿种源间的 Nei’s 基因多样性指数平均为 0. 377 0; 种源内 Shannon’s 信息指数( I)变动幅度为 0. 157 5 ~
0. 467 5,种源间均值为 0. 556 9。分子方差分析(AMOVA)得出,在总的遗传变异中,79. 26%的遗传分化存在于种
源间,种源内分化仅占 20. 74%,表明红椿的遗传分化主要来源于种源间,红椿良种选育应首先开展种源选择。
STRUCTURE 分析将 30 个红椿种源分成 2 大组群,趋势呈现为华东与华中种源为一组,西南、华南与澳大利亚的种
源为另一组; Mantel 检测显示,中国红椿种源存在地理隔离模式( IBD)。非加权平均法(UPGMA)聚类分析将红椿
30 个种源划分为 4 大类:第Ⅰ类包括 14 个种源,主要是来自华中和华东地区的种源; 广东乐昌种源独立成为一
类,形成第Ⅱ类; 第Ⅲ类包括 13 个种源,主要是来自西南和华南的种源; 广东云浮种源和澳大利亚多瑞格的种源
组成第Ⅳ类。主坐标分析(PCoA)得到的结果与聚类分析结果相似。【结论】红椿分布地区生境片段化,使各群体
在空间上相对隔离、基因交换频率低、流动程度小,从而导致地理变异。聚类分析与主坐标分析的结果与地理分布
格局基本吻合。在红椿保护和管理的过程中,在对原有生境进行保护的同时,要加强人工繁育技术研究,并注意最
大限度地保护红椿的遗传多样性。
关键词: 红椿; SRAP 标记; 遗传多样性; 遗传结构
中图分类号:S718. 46 文献标识码:A 文章编号:1001 - 7488(2016)01 - 0062 - 09
Genetic Diversity of Toona ciliata from Different Provenances Based on
Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers
Li Pei1,2 Que Qingmin2 Ouyang Kunxi2 Li Juncheng2 Zhan Xin2 Zhu Qin3
Zhang Junjie2 Deng Xiaomei2 Chen Xiaoyang2
(1 . College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University Beijing 100083;
2 . Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm
College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University Guangzhou 510642;
3 . Jiaying University Meizhou 514015)
Abstract: 【Objective】Poor natural regeneration and over-exploitation have resulted in the continual decline of natural
forests and trees of Toona ciliata. In depth studies of genetic diversity and structure of T. ciliata of different provenances
are particularly important for conservation,utilization of genetic resources,and the development of future breeding
programs for the species.【Method】Sequence-related amplified polymorphism ( SRAP) markers were used to investigate
genetic diversity of 29 provenances from China and one provenance from Australia of T. ciliata to define the level of
genetic diversity and the relationships among different provenances. Samples from China were collected from natural
第 1 期 李 培等: 不同种源红椿 SRAP 标记的遗传多样性分析
stands. Each provenance was represented by 30 sample trees with a distance of at least 50 m among the sample trees. The
Australian provenance was taken from the resources collection nursery of the South China Agricultural University. The
POPGENE1. 32 software was used for genetic diversity parameters calculation. The NTSYS-pc2. 1 software was used for
cluster analysis based on the matrix of Nei’s genetic distances and the degree of genetic relatedness among provenances
was assessed by principal coordinates analysis (PCoA) and MANTEL analysis with GenAIEx 6. 5. STRUCTRUE 2. 3 was
used to analysis the genetic structure. 【Result】A total of 505 polymorphic bands were amplified by 24 pairs of primers.
The average value of polymorphism information content (PIC) was 0. 41. The average value of Nei’s gene diversity index
(H) was 0. 377 0. Shannon’s information index ( I) within provenances ranged from 0. 157 5 to 0. 467 5,the average
value was 0. 556 9 among provenances. The AMOVA indicated that 79. 24% of the total variation was among provenances
and 20. 76% was within provenances,revealing that provenance selection is important for the breeding of T. ciliata. In
STRUCTURE analysis,30 provenances were divided into two groups. Group Ⅰ included the provenances from central and
eastern China. The provenances of southwest and south China and the provenance of Australia formed Group Ⅱ . Isolation-
by-distance ( IBD) patterns were revealed in the provenances of China by Mantel test. The unweighted pair group method
of arithmetic averages (UPGMA) cluster showed that the 30 provenances could be classified into four clusters. Cluster Ⅰ
consisted of the 14 provenances from Central China and East China. Cluster Ⅱ consisted of only Lechang provenance.
Cluster Ⅲ was composed of provenances mainly from South China and Southwest China,but the two provenances from
Guangdong province were not classified into the same cluster. GroupⅣ was composed of provenances from Guangdong
(YF) and the provenance of Australia. The result was consistent with biplot of PCoA analysis. 【Conclusion】Habitat
fragmentation of the natural distribution has led to spatial isolation among populations,low rate of gene exchange and
limited gene flow,resulting in geographic variation among provenances. The UPGMA cluster analysis and PCoA analysis
demonstrated a clear variation pattern consistent with the geographical trend of T. ciliata. Studies of artificial reproduction
should be reinforced while carrying out protection of the original habitat,and collect all current genetic resources and
expand the range of collection as far as possible.
Key words: Toona ciliata; SRAP markers; genetic diversity; genetic structure
红椿(Toona ciliata)是楝科(Meliaceae)香椿属
(Toona)树种,属落叶或半落叶乔木。该树种主干
通直,树姿挺秀,木材纹理优美,材质呈红色,有“中
国桃花心木”之称,是我国珍贵用材树种之一(程冬
生等,2010),在我国南方地区已成为重点开发利用
的速生、优质用材树种 (邹高顺,1994; Liu et al.,
2014; 黄红兰等,2012)。红椿在我国主要分布在
华南、华中、华东及西南地区,天然居群具有零星分
布特点(汪洋等,2014; 邹高顺,1994)。除中国外,
其天然分布范围也涉及喜马拉雅西北坡,包括印度、
老挝、缅甸、巴基斯坦至澳大利亚 (孔超,2012; 汪
洋等,2014)。由于环境的变化、天然更新能力较差
及过度采伐破坏等原因,目前红椿已成为濒危树种,
被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物,并列入《中国
主要栽培珍贵树种参考名录》(文卫华等,2012; 陈
丽文等,2014; Liu et al.,2012)。目前国内外对红
椿的研究主要集中在生态学、生理生化、引种和繁育
方面(邹高顺,1994; 吴际友等,2011; Malairajan et
al.,2007; Duan et al.,2015),对遗传多样性研究尚
未系统展开,研究材料也仅局限在个别省份。作为
珍稀濒危物种,研究其遗传多样性对种质资源保护
和遗传育种等方面具有重要的理论和实践意义。本
文利用相关序列多态性分子标记( SRAP)的对来自
我国 29 个种源及 1 个澳大利亚种源的红椿种质从
DNA 水平上进行系统的遗传多样性分析,旨在明确
不同种源红椿的遗传多样性水平及其遗传分化程
度,为红椿种质资源保护和良种选育提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
从我国自然地理分布区收集 29 个种源,采种范
围覆盖云南、四川、贵州、广西、广东、江西、浙江、福
建、湖南、湖北及安徽 11 个省区,基本涵盖了红椿在
我国的全分布区。在各采种林分随机选取无病虫
害、生长良好的植株 30 株左右,作为采集叶片的母
树,母树间相距 50 m 以上。从树冠上部采集新鲜幼
嫩叶片,用硅胶迅速干燥,硅胶与叶片的比例为
10 ∶ 1,后置于 - 80 ℃ 低温冰箱保存,用于 DNA 提
取。澳大利亚种源的试验材料采自华南农业大学红
椿资源收集圃。供试材料信息见表 1。
36
林 业 科 学 52 卷
表 1 30 个种源红椿地理位置分布
Tab. 1 Location of 30 provenances of T. ciliata used in this study
编号 种源 纬度 经度 海拔
No. Provenance Latitude Longitude Elevation /m
P1 广东云浮 Yunfu,Guangdong 22°46N 111°34E 340
P2 广东乐昌 Lechang,Guangdong 25°07N 113°20E 359
P3 安徽泾县 Jingxian,Anhui 30°41N 118°24E 366
P4 安徽黄山 Huangshan,Anhui 30°16N 118°08E 499
P5 贵州册亨 Ceheng,Guizhou 24°59N 105°48E 730
P6 贵州望谟 Wangmo,Guizhou 25°10N 106°05E 500
P7 贵州罗甸 Luodian,Guizhou 25°25N 106°44E 814
P8 贵州兴义 Xingyi,Guizhou 25°06N 104°54E 1 160
P9 云南蒲缥 Pupiao,Yunnan 25°04N 99°06E 1 513
P10 云南普洱 Pu’er,Yunnan 22°46N 100°58E 1 317
P11 云南普文 Puwen,Yunnan 22°23N 101°04E 890
P12 云南永仁 Yongren,Yunnan 25°01N 101°32E 1 539
P13 江西宜丰 Yifeng,Jiangxi 27°19N 115°26E 337
P14 江西龙南 Longnan,Jiangxi 24°54N 114°47E 610
P15 江西莲花 Lianhua,Jiangxi 26°44N 114°17E 400
P16 江西铅山 Qianshan,Jiangxi 28°18N 117°42E 1 200
P17 江西资溪 Zixi,Jiangxi 27°41N 117°03E 1 000
P18 湖南石门 Shimen,Hunan 29°01N 111°41E 436
P19 湖南城步 Chengbu,Hunan 27°14N 111°28E 737
P20 湖南新宁 Xingning,Hunan 28°18N 109°44E 650
P21 广西田林 Tianlin,Guangxi 24°17N 106°13E 792
P22 广西隆林 Longlin,Guangxi 24°46N 105°20E 624
P23 广西西林 Xilin,Guangxi 24°29N 105°05E 899
P24 浙江仙居 Xianju,Zhejiang 28°45N 119°92E 600
P25 浙江遂昌 Suichang,Zhejiang 28°59N 119°25E 510
P26 福建南平 Nanping,Fujian 26°38N 118°10E 800
P27 湖北宣恩 Xuan’en,Hubei 30°17N 109°28E 632
P28 四川会东 Huidong,Sichuan 27°23N 102°09E 1 862
P29 四川德昌 Dechang,Sichuan 26°40N 102°32E 1 325
P30 澳大利亚多瑞格 Dorrigo,Australia 30°15S 152°40E 750
1. 2 DNA 提取
采用 EZNA High-Performance DNA Mini Ki 试
剂盒,取 100 mg 干燥叶片做样品,提取红椿基因组
DNA。使用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳及超微量紫外分
光光度计(Thermo NanoDrop 1000)进行检测。稀释
至 50 ng·μL - 1,样品 - 20 ℃下保存备用。
1. 3 SRAP 扩增体系及程序
根据 SRAP 分子标记在各物种研究中所发表的
引物序列,筛选引物(黄勇,2013; 赵秀娟等,2013;
Feng et al.,2009; Youssef et al.,2011; Ren et al.,
2012; Jing et al.,2013; Huang et al.,2014; Alghamdi
et al.,2012; Aneja et al.,2012; Mokhtari et al.,
2013)。先用 8 个种源的材料进行引物初筛,后选用
16 个样本进行复筛,最终从 1 505 对引物组合中选
定 24 对扩增条带清晰稳定、多态性丰富、重复性好
的引物组合,包括 14 个正向引物和 15 个反向引物
(表 2)。SRAP 引物由深圳华大公司合成。试验采用
25 μL 扩增体系,10 × Buffer 2. 5 μL(100 mmol·L - 1
Tris-HCl,pH 8. 3,500 mmol·L - 1 KCl),模板 DNA
50 ng,10 μmol·L - 1上下游引物浓度各 0. 75 μL,Taq
DNA 聚合酶 ( TaKaRa) 2 U,2. 5 μL 25 mmol·L - 1
MgCl2,2 μL 2. 5 mmol·L
- 1 dNTP。反应程序为94 ℃
5 min; 94 ℃ 1 min,35 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,5 个循
环; 94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35 个循
环; 72 ℃延伸 10 min; 4 ℃保存。产物在 6%变性
聚丙烯酰胺凝胶上进行分离,并通过银染染色检测。
保鲜膜封胶,照相或制干胶保存。
1. 4 数据分析
在 100 ~ 1 500 bp 之间,将具有相同迁移率的扩
增片段按照 0 /1 系统记录,即有带记为 1,无带记为
0,组成 0 /1 矩阵。将 SRAP 谱带统计结果转换为
POPGENE1. 32 软件适用文件,计算遗传多样性参数
(Yu et al.,2014; Shen et al.,2010; 张富民等,
2002),包 括 多 态 位 点 百 分 率 ( percentage of
46
第 1 期 李 培等: 不同种源红椿 SRAP 标记的遗传多样性分析
polymorphic bands,PPB )、Shannon’s 信 息 指 数
(Shannon’s information index,I)、Nei’s 基因多样性
指数(Nei’s gene diversity,H)、种群间的 Nei’s 遗传
距离 ( genetic distance,D ) 和遗传一致度 ( genetic
identity,I)。
表 2 红椿 SRAP 分子标记引物序列
Tab. 2 Primer sequences used in SRAP analysis of T. ciliata
正向引物
Forward primer
引物序列
Primer sequences(5—3)
反向引物
Reverse Primer
引物序列
Primer sequences(5—3)
Me17 TGAGTACAAACCGGTAG Em7 GACTGCGTACGAATTGAG
Me19 TGAGTACAAACCGGTTG Em13 GACTGCGTACGAATTCAG
Me22 TGAGTACAAACCGGGTC Em14 GACTGCGTACGAATTCAG
Me23 TGAGTACAAACCGGAGT Em15 GACTGCGTACGAATTCTT
Me27 TGAGTACAAACCGGGAT Em17 GACTGCGTACGAATTCAG
Me28 GACCAGTAAACCGGTGG Em18 GACTGCGTACGAATTAGC
Me31 TGAGTACAAACCGGATG Em19 GACTGCGTACGAATTACG
Me32 GTACATAGAACCGGGAA Em21 GACTGCGTACGAATTATT
Me34 GTACATAGAACCGGTAT Em22 GACTGCGTACGAATTGTC
Me35 CACAGTCATGCCGGATG Em24 GACTGCGTACGAATTATT
Me38 ATCAGTCGGACCGGAGT Em26 GACTGCGTACGAATTCAG
Me39 GTACATAGAACCGGACT Em27 GACTGCGTACGAATTCCA
Me40 CACAGTCATGCCGGACT Em28 GACTGCGTACGAATTTGA
Me43 CACAGTCATGCCGGATT Em31 GACTGCGTACGAATTCTCA
Em32 GACTGCGTACGAATTATT
采用遗传多样性信息含量(PIC)评价试验所选
用的 24 对引物组合在评价红椿遗传多样性中的能
力。PIC i = 2 fi(1 - fi),式中:PIC i为标记 i 的遗传多
样性信息含量,fi为标记 i 出现条带的频率,1 - fi是
缺失条带的频率。1 对引物的 PIC 为各个条带的平
均值(Shen et al.,2010)。
运用 NTSYS-pc2. 1 软件按照 UPGMA 法根据遗
传一致度( I)进行种源聚类分析 (Rohlf,2000);利
用 GenAIEx 6. 5 进行种群间遗传相关性的主坐标分
析(PCoA)(Peakall et al.,2012)。
利用 STRUCTURE 2. 3 分析红椿遗传结构
(Pritchard et al.,2000)。假设群体数目( K)值为
1 ~ 15,20 次独立运行软件,利用估算值 (ΔK)确定
最终群体个数; 软件运算得出似然值 L (K),通过
下列公式计算出 ΔK,根据 ΔK 最大的原则,选择合
适的 K 值为最佳的群体数:
ΔK =
m | L K +( )1 - 2L( )K + L K -( )1[ ]|
S L( )[ ]K

式中:m 表示取平均值(mean);S[L (K)]为 L (K)
的标准差(Evanno et al.,2005)。
利 用 GenAIEx 6. 5 进 行 分 子 方 差 分 析
(AMOVA),分析种源间遗传分化。
计算中国红椿 29 个种源采样点的地理距离,并
针对中国地区种源间的遗传距离和地理距离进行
Mantel 检验(Mantel,1967),分析其是否存在地理距
离隔离模式( IBD)。
2 结果与分析
2. 1 红椿 SRAP 扩增片段多态性分析
通过初筛和复筛,从 1 505 对引物组合中选取
电泳条带清晰、稳定性高、多态性高的引物组合 24
对,对全部样品进行扩增分析。共扩增出 656 条
带,其中 505 条为多态性条带,占总条带数的
77. 10%。每条引物扩增出 19 ~ 36 条 DNA 片段,
平均 27 条; 多态性片段 14 ~ 29 条,平均 21 条。
各引物组合所扩增出的条带、多态性条带、多态位
点百分率和每对引物的 PIC 值见表 3。由表 3 可
以看出,多态性最好的为引物组合 Me39Em32,多
态位点百分率达到 94. 74% ; 多态性最差的为
Me35Em32 组合,多态位点百分率仅 51. 85%。引
物组合 Me35Em32 的 PIC 值最高,达到 0. 45,其次
是 Me23Em22 及 Me27Em7,为 0. 44; Me31Em24,
Me32Em17,Me39Em32 和 Me43Em19 组合的 PIC
值也分别达到 0. 43。由此看出,以上引物组合可
作为红椿 SRAP 分子标记的骨干引物,能有效揭示
红椿的遗传多样性。
2. 2 红椿种源内遗传多样性分析
Nei’s 基因多样性指数(H)及 Shannon’s 信息
指数( I)可以有效反映各种源的遗传多样性(黄
勇,2013)。基于 SRAP 结果分析,红椿 30 个种源
的各参数存在差异。如表 4 所示,P2 种源 Nei’s
基因多样性指数(H)及 Shannon’s 信息指数( I)分
别为 0. 313 5 和 0. 467 5,在 30 个种源中为最大
56
林 业 科 学 52 卷
值,遗传多样性最高;而 P19 种源的 2 个参数均最
小,分别为 0. 098 6 及 0. 157 5,遗传多样性最低。
表 3 24 对 SRAP 引物的总条带数、多态
性条带数、多态位点百分率及 PIC 值
Tab. 3 Total number of bands,polymorphic bands,
percentage of polymorphic bands and polymorphic information
content (PIC) obtained from 24 SRAP primer combinations
引物组合
Primer
combinations
总条带数
Total
number
of bands
多态性
条带
Polymorphic
bands
多态位点
百分率
Percentage of
polymorphic
bands(% )
PIC
Me17Em21 27 21 77. 78 0. 38
Me19Em13 25 21 84. 00 0. 42
Me19Em15 26 23 88. 46 0. 42
Me19Em27 25 21 84. 00 0. 41
Me22Em21 26 21 80. 77 0. 41
Me22Em27 28 20 71. 43 0. 41
Me23Em22 30 26 86. 67 0. 44
Me23Em31 28 21 75. 00 0. 41
Me27Em28 25 21 84. 00 0. 39
Me27Em7 25 21 84. 00 0. 44
Me28Em18 36 27 75. 00 0. 40
Me31Em24 36 29 80. 56 0. 43
Me32Em17 28 20 71. 43 0. 43
Me32Em26 32 28 87. 50 0. 42
Me34Em13 25 19 76. 00 0. 39
Me35Em13 27 15 55. 56 0. 42
Me35Em14 26 15 57. 69 0. 40
Me35Em32 27 14 51. 85 0. 45
Me38Em21 24 19 79. 17 0. 39
Me38Em24 29 21 72. 41 0. 42
Me39Em32 19 18 94. 74 0. 43
Me40Em13 28 23 82. 14 0. 42
Me40Em22 21 15 71. 43 0. 33
Me43Em19 33 26 78. 79 0. 43
合计 Total 656 505
平均值 Mean 27. 33 21. 04 77. 10 0. 41
2. 3 红椿种源间遗传多样性分析
红椿 SRAP 分子标记的多态位点百分率平均为
77. 10% (表 3)。种源间 Nei’s 基因多样性指数为
0. 377 0,Shannon’s 信息指数( I)为 0. 556 9,这表明
红椿种源具较丰富的遗传多样性。
根据红椿的遗传距离,利用 UPGMA 法对种源
进行聚类(图 1)。结果表明,在阈值为 0. 72 时,30
个种源可以分成 4 大类:第Ⅰ类包括 14 个种源,分
别是湖北、湖南、江西、福建、浙江和安徽 6 省的全部
种源,为华东、华中区; 第Ⅱ类仅有广东乐昌 1 个种
源; 第Ⅲ类包括云南、贵州、四川和广西 4 省的种
源,为华南、西南区; 第Ⅳ类包括广东云浮、澳大利
亚多瑞格种源。4 大类遗传距离见表 5。各类 Nei’s
基因多样性指数与 Shannon’s 信息指数的排列都呈
现为第Ⅰ类 > 第Ⅲ类 > 第Ⅳ类 > 第Ⅱ类。利用
GenAIEx 6. 5 进行种群间遗传相关性的主坐标分析
(PCoA) (图 2 ),结果与种源聚类结果基本保持
一致。
表 4 红椿 30 个种源遗传多样性参数
Tab. 4 Genetic diversity parameters of 30
T. ciliata provenances
编号
No.
多态位点
百分率
Percentage of
polymorphic
bands(% )
Nei’s 基因
多样性指数
Nei’s gene
diversity(H)
Shannon’s
信息指数
Shannon’s
information index( I)
P1 50. 80 0. 143 9 ± 0. 152 3 0. 230 2 ± 0. 236 8
P2 83. 33 0. 313 5 ± 0. 156 9 0. 467 5 ± 0. 222 7
P3 42. 04 0. 132 4 ± 0. 161 5 0. 206 9 ± 0. 248 2
P4 36. 68 0. 121 6 ± 0. 162 0 0. 188 1 ± 0. 249 1
P5 70. 78 0. 190 8 ± 0. 136 5 0. 309 4 ± 0. 212 2
P6 55. 77 0. 155 8 ± 0. 158 2 0. 248 5 ± 0. 239 5
P7 61. 16 0. 179 7 ± 0. 159 8 0. 284 1 ± 0. 242 2
P8 71. 29 0. 190 1 ± 0. 153 6 0. 304 6 ± 0. 228 1
P9 72. 35 0. 148 5 ± 0. 102 8 0. 258 0 ± 0. 170 2
P10 64. 71 0. 182 2 ± 0. 147 8 0. 292 2 ± 0. 227 7
P11 45. 49 0. 113 9 ± 0. 137 8 0. 187 3 ± 0. 217 2
P12 90. 04 0. 254 6 ± 0. 120 4 0. 404 6 ± 0. 169 1
P13 67. 01 0. 195 0 ± 0. 159 9 0. 308 4 ± 0. 237 6
P14 40. 09 0. 118 2 ± 0. 149 6 0. 187 9 ± 0. 234 6
P15 74. 87 0. 211 6 ± 0. 152 9 0. 336 4 ± 0. 223 6
P16 74. 00 0. 217 5 ± 0. 145 6 0. 344 7 ± 0. 220 6
P17 43. 69 0. 140 5 ± 0. 175 2 0. 216 5 ± 0. 260 0
P18 36. 89 0. 128 1 ± 0. 172 5 0. 195 3 ± 0. 259 7
P19 38. 52 0. 098 6 ± 0. 152 7 0. 157 5 ± 0. 227 3
P20 84. 91 0. 246 5 ± 0. 128 6 0. 391 6 ± 0. 188 6
P21 66. 32 0. 166 2 ± 0. 137 7 0. 273 4 ± 0. 212 4
P22 76. 82 0. 238 4 ± 0. 153 8 0. 371 8 ± 0. 225 9
P23 81. 52 0. 192 1 ± 0. 121 3 0. 319 7 ± 0. 182 9
P24 50. 00 0. 197 0 ± 0. 205 4 0. 290 2 ± 0. 297 2
P25 66. 82 0. 223 5 ± 0. 171 8 0. 342 9 ± 0. 245 7
P26 61. 88 0. 165 4 ± 0. 148 2 0. 267 4 ± 0. 227 6
P27 50. 57 0. 145 8 ± 0. 163 1 0. 230 7 ± 0. 245 5
P28 84. 91 0. 202 6 ± 0. 116 3 0. 336 5 ± 0. 174 2
P29 82. 38 0. 221 1 ± 0. 137 4 0. 355 5 ± 0. 201 0
P30 46. 54 0. 181 1 ± 0. 202 2 0. 267 6 ± 0. 293 6
2. 4 红椿遗传结构分析
基于模型 STRUCTURE 运算的结果分析红椿的
遗传结构,待定群体数 K 与估算值 ΔK 的关系如图
3 所示。由图 3 可以看出,当 K = 2 时,ΔK 出现峰
值,因此,30 个红椿种源可以分为 2 组,即中国华
东、华中地区及乐昌种源为一组,西南、华南、广东云
浮和澳大利亚种源为一组(图 4)。
66
第 1 期 李 培等: 不同种源红椿 SRAP 标记的遗传多样性分析
图 1 基于遗传距离的红椿种源 UPGMA 聚类
Fig. 1 Phylogenetic dendrogram based on the genetic distance by the UPGMA cluster in the 30 provenances
P1 - P30 为种源编号,具体见表 1。下同。P1 to P30 are the codes of provenances of T. ciliata listed in Tab. 1. The same below.
表 5 红椿 4 类区组的遗传距离①
Tab. 5 The genetic distances among the four
clusters of T. ciliata
区组
Cluster Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅱ 0. 324 2
Ⅲ 0. 246 5 0. 544 9
Ⅳ 0. 257 2 0. 617 0 0. 185 2
①区组Ⅰ包括华东及华中地区的 14 个种源; 区组Ⅱ包括广东
乐昌 1 个种源; 区组Ⅲ包括西南及华南地区的 13 个种源; 区组Ⅳ包
括广东云浮及澳大利亚多瑞格的 1 个种源。Cluster Ⅰ includes 14
provenances from central China and east China; The provenance from
Lechang in Guangdong forms its own cluster (Cluster Ⅱ) separately; The
provenances of southwest and south China are grouped in Cluster Ⅲ;
Cluster Ⅳ is composed of provenances from Yunfu in Guangdong and
Dorrigo in Australia.
图 2 30 个种源基于主坐标分析的聚类
Fig. 2 Biplot of the principal coordinate analysis of
30 T. ciliata provenances
图 3 待定群体数 K 与估算值 ΔK 的关系
Fig. 3 Relations between the number of determined group
K and estimated value ΔK
2. 5 红椿种源的遗传分化
利用 GenAIEx 6. 5 对红椿种源进行 AMOVA 变
异分析,结果表明:在红椿总的遗传变异中,79. 26%
的遗传分化存在于种源间,而红椿种源内的遗传变
异远远小于种源间,仅占总遗传变异的 20. 74% (表
6)。由此可以说明,红椿的遗传变异主要来自种源
间。经 Mantel 检测,中国地区种源呈显著地理隔离
模式( IBD)( r = 0. 36,P < 0. 05)。
3 结论与讨论
3. 1 结论
24 对 SRAP 引物共扩增出 656 条带,其中 505
条为多态性条带。多态性最好的为引物组合
76
林 业 科 学 52 卷
Me39Em32,多态位点百分率达到 94. 74%,引物组
合多态位点百分率平均值为 77. 10%。30 个红椿种
源的 Shannon’s 信息指数( I)变动幅度为 0. 157 5 ~
0. 467 5,种源间的 Shannon’s 信息指数 ( I ) 为
0. 556 9,红椿不同种源林分内遗传多样性水平高低
不同,种源间的遗传多样性较高,遗传变异主要存在
于种源间。30 个红椿种源遗传结构可分为华东与
华中区、西南与华南区,东西部地理趋势明显。
图 4 利用 STRUCTURE 软件获得的 30 个种源红椿遗传结构
Fig. 4 Structure analysis of 30 T. ciliata provenances by STRUCTURE software
表 6 红椿 30 个种源的 AMOVA 分析①
Tab. 6 Analysis of molecular variance (AMOVA) of 30 T. ciliata provenances
来源
Source
自由度
df
离差平方和
Sum of
squares
均方
Mean
squares
方差分量
Variance
component
方差分量比率
Percentage of
variance(% )
Φ st P
种源间
Among provenances
29 39 736. 809 1 370. 235 81. 899 79. 26 0. 793 0. 001
种源内
Within provenances
469 10 051. 632 21. 432 21. 432 20. 74
合计
Total
498 49 788. 441 103. 331 100
①Φ st:基于 AMOVA 的遗传分化值 The genetic differentiation value based on AMOVA.
3. 2 讨论
多态位点百分率(PPB)是衡量遗传多样性参数
水平的一个重要指标。一般来说,种源 PPB 高,遗
传多样性高,适应环境能力强;反之,遗传多样性低,
适应环境能力弱,在长期进化过程中有被淘汰的可
能(何小勇,2007 )。红椿种源 PPB 较高,平均为
77. 10%。红椿种源内存在一定的遗传变异。在进
行引物能力评估时,当 PIC > 0. 5 时,引物贡献率较
高,多态性最好,选取的引物可以最大程度地反映遗
传多样性;当 0. 25 < PIC < 0. 5 或者 PIC < 0. 25
时,则分别说明多态位点处于中等或较低水平
(Wang et al.,2014; Xie et al.,2010)。本研究中 24
对 SRAP 引物组合的 PIC 平均值为 0. 41,说明 SRAP
分子标记的引物组合可以很好地反映引物的区分能
力,能有效准确地揭示红椿不同种源的遗传多样性。
本研究利用不同分析方法对 30 个红椿种源进
行遗传结构的分析,Nei’s 基因多样性 指数、
Shannon’s 信息指数及分子方差分析 (AMOVA)的
分析结果相似。79. 26%的遗传分化存在于种源间,
种源内分化仅占 20. 74%,表明红椿的遗传变异主
要来源于种源间。因此,在红椿的育种工作中需要
侧重于种源的选择,个体选择和改良同时兼顾。群
体分化的主要动力来源于自然选择 (李康琴,
2013),红椿的种源间分化程度高,原因可能是红椿
自然分布范围较广,经纬度跨度大(孔超,2012),经
过长期的自然选择,形成了对局部环境高度适应的
生存能力,并为不断积累和保存遗传多样性奠定基
础。花期不同就是其中一个重要的适应能力表现。
由于气温、雨水及光照的影响,靠近中国西南地区的
红椿种源一般花期在 3—4 月,而其他地区的花期一
般在 5—6 月,从而使花粉的扩散受到了阻碍和限
制,加之地理隔离阻碍了种群间基因交流,因此遗传
分化明显。此外,由于过度采伐,红椿野生资源已处
于濒危状态,造成红椿分布地区生境的片段化,使各
群体在空间上相对隔离,从而加剧了种群间的遗传
分化。
利用 STRUCTURE 模型进行遗传结构分析时,
将 30 个红椿种源分成 2 大部分,基本上华东、华中
地区与乐昌种源为一组,西南地区、广东云浮种源
与澳大利亚种源为一组,P1,P2,P14 和 P30 为过渡
种源。通过 UPGMA 法根据红椿的遗传距离进行聚
类,本研究中红椿的 30 个种源被分为 4 大类:第Ⅰ
大类主要包括来自华中和华东地区的红椿种源,第
Ⅱ类仅包括广东乐昌种源,第Ⅲ类包括的是西南和
华南的种源,广东云浮种源和澳大利亚多瑞格种源
组成了第Ⅳ类。在采种调查过程中得知,广东云浮
86
第 1 期 李 培等: 不同种源红椿 SRAP 标记的遗传多样性分析
的红椿是由旅居南洋的华人在 19 世纪带进的,根据
SRAP 分子标记聚类分析,云浮的种源与澳大利亚
的种源聚为一类,由此推测,广东云浮红椿的原产地
可能是澳大利亚或与澳大利亚红椿的来源相同。广
东乐昌种源在以上 2 种分析中,处于遗传结构分析
中的过渡种源,根据遗传距离聚类单独成为一类,并
且乐昌在 30 个种源内遗传多样性最高,这可能是由
于该种源地处广东省最北端,多丘陵、山地,处于华
南与华中种源分界线处,靠近江西省的龙南,气候过
渡明显,自然生存环境复杂,人为干扰较少,基因流
动受多方面影响造成的。对比遗传距离(表 5),乐
昌种源与西南地区的大类相比,与华东及华中的种
源较近,进一步证明了其地理位置效应的影响。遗
传距离聚类与 STRUCTURE 分析属于 2 种不同的运
算模式,前者在聚类中由于是根据遗传距离及遗传
相似性进行划分,所以通常会受到一定程度的人为
操作影响,而后者可将划分不明的群体划分到相应
的群体中,表现形式更加明确 (赖恭梯等,2014)。
在本研究中,2 种分析方法在聚类结果上基本可以
保持一致。分析 4 大类内部的 Nei’s 基因多样性指
数与 Shannon’s 信息指数,第Ⅰ类都为最大,其次为
第Ⅲ类,最小的为第Ⅱ类。第Ⅰ类所包含的种源来
自华东和华中地区,这个区域的试验材料来自保护
区或国有林场,遭到人为破坏的程度较低,保持了原
有的遗传多样性。乐昌种源在聚类时没有被分到大
类群中,单独划分成为一类,由于种源独特,应在杂
交育种中注意考虑作为亲本。当然还要根据其他参
考性状,如木材质量、抗逆性等性状来考虑是否用于
杂交育种的亲本材料。
遗传距离与地理距离的相关性分析表明,二者
具有相关性,表明相距较近的种源间遗传相似性较
高。由此可以推测,地理隔离是红椿种源间产生遗
传分化的另一个很重要的原因。细分各亚类,存在
交叉分类。地理相距较近的种源并没有完全被分在
同一亚类,如云南的 P9 与 P11、浙江的 P24 与 P25,
这表明红椿在大尺度上存在地理趋势,而在小分区
存在随机性。
目前,部分红椿的天然分布区域内已经建立了
自然保护区,为红椿的就地保护提供了条件;但是,
由于红椿自身的天然更新能力较弱,加之过度采伐,
使其天然分布和单株数量越来越少。为了使其能够
可持续利用,必须加强对红椿的保护和管理。根据
本研究的结果,红椿在中国呈现零星分布,地理隔离
造成基因很难交流,种群内遗传多样性较低,现存的
天然林中很多数量红椿都是以古树的形式存在的,
所以应尽量保存现有的所有种群并维持其原有生存
环境,减轻生境片段化的加剧。红椿种子活力维持
时间短、成苗率低、天然更新能力较差,因此在对原
有生境进行保护的同时,要加强人工繁殖技术研究,
并注意最大限度地保护红椿的遗传多样性,特别是
遗传多样性较低的种群,如本研究中的 P19(湖南城
步),要尽可能地将遗传资源收集完整,并通过建立
母树林、基因库和种子园形式进行异地保存。
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(责任编辑 徐 红)
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