全 文 ：第3 卷 第4 期
1 9 9 0 年 8 月
林业 科 学研 究
FO R E S T R E S E A R C H
V o l
.
3 , N o
。
4
A u g
. ,
1 9 9 0
泡桐基因文库的构建及ac ti n基因
同 源顺序 的亚 克 隆 *
孙 威 孔繁瑞 林友刚 李继耕
(中国科学院遗传研究所 )
摘要 以扛系列E M B L 3 D N A 为载体 , LE 39 2 为宿主菌, 建立 了木本植物毛泡
祠(P a u lo招n ia 公伽e , to sa (T hun b ) Ste u d e l) 丛枝病杭病品 系 Ci 6 1 基目文库 , 命名
为〔久E s / PT S (B a m ·Sa u )〕。 其包装效价达到1 . 1 x 1 0 , Pfu , 重组率为 9 8 % 。 用动物
肌动蛋白 (ac tin )基因为探针 , 从这一基因库中筛选出3 。 9 K b 的泡桐 D N A 同 源顺序
进行亚克隆 。所得结果表明 : 动物ac ti n 基 因在木本植物基因组中存在一定的同源性。
关扭饲 泡桐 , 基因文序, 入E MB L : 载体 , 肌动蛋 白基因
肌动蛋白 (ac tin) 是 真 核 生 物中广泛存在的蛋白质 , 又是高度保守的多基因族。 有关
a ct in 基因的研究开始于80 年代初期。 人们主要侧重于对 ac ti n 基 因 家族的组成、 序列保守
性以及不同 ac t in 基因之间的分化速度等方面的研究 , 这一研究对于追 寻真核基因的功能和
调控 的进化途径是很有意义的。
选用泡桐抗丛枝病品系为材料, 建立基因文库 , 并从中分离出 与 ac t in 基因具有同源住
的片段。 其意义 , 一是由于泡桐属于木本植物玄参科 , 在进化树上分枝较晚 , 对 研 究 ac ti n
基因的结构、 功能及调节的进化不失为一个好材料, 其二是为从此基因库中筛选抗病基因,
为在林业中开展抗病育种工作奠定基础 。
一 、 材 料与方 法
(一 ) 材料
z
。 泡桐品种 : 毛泡桐(Pa u lo 留n ia t诩 e”ro sa (T hu nb ) S teu d e l)抗丛枝病品系C 1 6 1 。
2
。 噬菌体和菌种 :
(1) 入E MB L : 噬菌体 h肠 ba m 1 O b 1 8 9 〔in t (lin ke r ) n in n in L 4 4么 (sH in d 皿 3-
sH ind 皿 5 ) 艺tr P E〕 in t (lin ke r ) △ (in t一e 皿 ) K H 5 4 5 R l 4 0 n in 5 5 R 1 5 。 。
(2 ) 宿主大肠杆菌
LE 3 9 2 : F
一
hsd R 5 24 丫k 一m k 一 , Su P E 4 4
,
Su P Fss
,
lec r
, o r (lac IZY )6
, 邵 l
本文于1 9 8 8年1 1月2 6 日收到 .
今泡桐品种由协作单位中国林业科学研究院林业研究所泡桐组提供 。
3 4 G 林 业 科 学 研 究 3 卷
K Z
, 卯1 T 2 2 , m e t B l , tr P R 5 5 , 入一 。
L 9 5 : Su p E
,
S u p F
, tr p R
一 ,
m e t B
, 丫k 一 m k 一 , PZ 。
(3 ) 溶源菌株大肠杆菌
BH B 2 6 8 8
:
N 2 0 5 r e eA
一
(Yim m 4 3 4
,
C l ts8 5 7
,
b
Z , red
一 ,
Ea m
,
Sa m / 丫)
。
B H B 2 6 9 0
:
N 2 0 5 rec A
一
(丫im m 4 3 4 , Cl ts8 5 7 , b Z , red 一 , D a m , Sa m / 丫)
。
3
. 探今!· : 动物肌动蛋白基因0 . 9 K b e D N A 重组于 PB R 3 2 2 的 Ps t l 位点。
4
. 质拉载体 p U C1 9 , 限制性内切酶及 T ; D N A 连接酶均购自华美公司 。
(二) 方法
1
. 用 入E M BL 。 构建泡桐基因文库的基本步骤按照Ma n iat is 等人的方法 I’J。
2
. 泡桐核 D N A 的制备及 目的片一段回收 : 泡桐核 D N A 的制备在 S to ut 等人方法的基础
上进行 [ 2 ] 。 5 0 9 新鲜泡桐叶片于液氮内迅速研磨 , 加 2 0 0 m l缓冲液 A (魂0 0 m M 蔗糖, 2 0 m M
T r is一H CI (p H 7
.
6 )
,
2 m M Ca C1
2 , 2 %阿拉伯胶 , 4 n M 正辛醇 , Zm g / m l P V P一4 0 0 ) ,
匀浆、 过滤 。 滤液于 4 5 0 x g 离心 15 m in 。 沉淀用缓 冲液 A 洗一次 , 缓冲液 B (4 0 0 m M蔗塘 ,
2 0 m M T r is
一H C I (p H 7
.
6 )
, 2 m M CaC 1
2 , 2 % 阿拉伯胶 , 4 n M 正辛醇 , o一 5 % T r ito n
X 一1 0 0 )和缓冲液C (2 0 0 m M 蔗糖 , 1 0 m M T r is一H C I(p H 7 . 4 ) , 2 m M Ca C12 )各洗 两 次
后 , 悬浮于 s m l缓冲液 C , 并加 s m lN aC I、i o m l缓冲液 D (z o m M T r is一H C I (p H S . s ) ,
0
。
5 % SD S
,
1 0 m M E D T A
一N a Z , 1 0 m M N a CI
,
2 0 0 p g / m l p r o te in a s e K )
,
3 7 ℃ 保 温
Z h
, 继续在 37 ℃ 对 D 液透析过夜 。 透析后离心除沉淀 。 上清液用苯酚和氯仿抽 提 后 , 于
一 20 ℃乙醇沉淀过夜。 此 D N A 粗制 品经过 Se p har o se 4B 层析柱除去R N A 及其它小分子 ,
即得到纯化的高分子量核 D N A 样品。
纯化的泡桐 D N A 样品经过限制性内切酶 Sa u3 A 酶解 , 回收 15 ~ 20 K b之间的目的片
段 。
3
. 制备 人E M BL 3D N A 和包装蛋白抽提物参照M a ni at is等人 的方法 〔“J , 并按照E n q ui st
的方法 [’] 对载体 co 刻匝序完整性进行鉴定 。
4
.
D N A 的连接 、 体外包装和重组体鉴定: 限制性内 切 酶 B a m H I和E co R I双 酶 解 的
认E M B L 3D N A 与脱磷酸化的 15 ~ 20 K b 目的D N A 片段以不同的比例混合连接 。 方法 参 照
Fr isc ha u f[ 句
。 连接混合物用包装提取 物 直接包装 [el , 测定包装效价 。 用 LE 39 2 作 为 宿 主
侵染后 , 分别接种一定量的噬菌斑置 L 95 宿 主菌的 LB 培养皿上鉴定重组子 。 达到一定重
组率的包装产物 , 经过扩增 川 成为永久 基 因文库。
5
. 与 act in 基因同源顺序的筛选和亚克隆 : 标记的 ac ti n 墓因质粒作为放射性探针 , 同
重组噬菌斑进行原位杂交 [一 ’l。 杂交获得的阳性重组子经不同的限制性内切酶完全酶解后 ,
用同一探针再次杂交 。 发现内切酶 Pst l 酶解后有一强阳性带 , 大小为3 . g K b。 选择这一特
定D N A 片段 , 以 p U C1 9为载体 , 直接转化感受态大肠杆菌 JM83 , 进行次级克隆 。 感受 态
JM 8 3 的制备参照 M e n d e l的方法 I‘。l。
克隆菌落用 H ol 如es 等人的方法 [‘’l提取重组质粒 D N A , Pst 工酶解后 So ut 五er n 转移到
硝酸纤维素膜 , 用 a 一 a : p 二d C T P 标记的 ac tin 基因探针杂交鉴定。
4 期 ’ 孙威等 : 泡桐基因文库的构建及ac tin 基因同源顺序的亚克隆 3 4 7
二 、 结 果
(一 ) 泡桐大分子核 D N A 的制备
采用条件比较温和的方法提取叶片中的大分子核 D N A , 其纯度 、 产率及酶解效果都达
到了建库要求 。 粗制品的产率约为 20 ~ 3 0 协9/ 9 叶片。 粗制品中含有大量R N A小分子污染及
部分蛋白质 , 这给 以后内切酶消化及连接带来一定困难 。 经 Sep har os e 4B 纯化的D N A , 纯
度有所提高 , 内切酶消化时所用酶量减少 , 酶解效果也更佳 。 纯 化 D N A 分子的紫外吸收曲
线呈明显的核酸吸收特性 , A Z 。。/ A : : 。 = 1 . 8 7 。 纯化后的泡桐 D N A 经不同量 的 Sa u 3A 酶解 ,
可以选择出获得 20 K b 片段的最佳条件(图 1 ) 。
图 1 池桐D N A 经不 同盆的
S a u 3A 醉解 后 , 0 . 4 %
a g a r o s e 电泳
挑取50 0个噬菌斑置L95
中有98 %的重组子。
(二) 泡桐基因文库的构建及鉴定
包装蛋 白与重组 D N A 体外混合包装 , 侵染宿主菌LE 39 2 后 ,
产生噬菌斑数为l 。 1 X lo . p fu/ 昭D N A 。如果按照一般高等植物基
因组平均大小为2 . s p g /细胞 (2 . 3 x l沪K b )计算 ￡‘2〕, 根据公式 :
N = I”(i 一 p )/ In (1 一 了/ g )
插入片段 f 为 20 K b , g 为基因组大小 (K b) , 要使基因库以 ”%
的概率〔P) 覆盖整个基因组 , 理论上需要重组子数 N 为 5 . 3 X I O.
p fu / 协g , 本试验所得基因库的重组数大大超过了理 论 值 , 此 基
因库经扩增后命名为以E 3 / PT S (B am 一Sa u )〕。
为了进一步证明此基因库的有效性 , 除了计算理论值外 , 还
用宿主菌L95 进行了筛选 。 L 95 是溶源菌 , 只有插入外源片段的
虑MBL 3 , 才能侵染 L 95 。 从 LE 392 为宿 主的培养皿 中, 随机
的培养皿中 , 过夜培养后 , 有 98 %产生噬菌斑 , 这就证明此基因库
(三 ) a ct 加 签因同源顺序的亚克隆
以比放射值为10 ’c p m / 。g 的 p B R 3 2 2 一ac 比n D N A 为探针 , 从泡 桐基因库筛选出一个阳
性斑点 , 扩增后第二次杂交 , 出现多个与 ac tin 基因有同源性的 阳性斑点。 由于它们来源于
同一重组子 , 将这一克隆命名为 入E 3p A 。 图 2 显示两次原位杂交结果 。
阳 2 2 一人 泡桐甚 因库与 a ct in 基因原位杂交 , 2 一 B 阳性斑点扩增后再次杂交
3 4 8 林 业 科 学 研 究 3 卷
用单斑分离的方法将此克隆扩增后 , 提取重组 D N A , 经几种不同的限制性内切酶酶解 ,
0
。
8 %琼脂糖凝胶电泳后 , 以 ac tin 基因为探针进一步杂交。 结果表明 , 在杂交 阳 性带中 ,
几t1 酶解片段有一强 阳性带 , 大小为3 . 9 K b 。 选它作为外源片段进行亚克隆 , 所得结果 如
图 3 。
簿谭巍蘸
兹摊 石 奋仁在协 奎梦二 少 h 厂
图 3 3 一 A 入E , p A D N A酶解产物 , 3 一 B 酶解产物与 a ct in 墓因杂交
a
. 对照 , b . B a m H I , e s a u 3 A 、 d . 未醉 解, e . S a l l ,
f
.
P s t l
, g
.
H in d l
, h
.
E e o R I , i
.
M a r k e r
从转化培养皿中挑选重组亚克隆 , 分别提取质粒 , 并与对照 p U C19 同 时 电泳 , 从中挑
选出不同大小的重组质粒 , 用 Pst 工 酶解后 , 与分离 的ac tin 基因(不 含质粒 )杂交 。 结果表
明 , 其中一个重组克隆的插入片段与 aC ti n 基因具有同源性(图 4 ) 。 从而证明 我们确实得到
了泡桐基因组中 ac ti n 基因同源顺序的亚克隆。
图 4 重组克隆酶解后与 么ct in 基因杂交
a 和b M a r k e r ; e PU C 19 , d 和e重组克隆
三 、 讨 论
(一 ) 关于大分子核 D N A 的制备
泡桐是多年生乔木 , 同许多高等植物一样 , 其
细胞中有大量 的多搪 、色素及多酚类物质 , 同时还有
细胞壁不易破碎的特点。 泡桐又不同于单子叶植物
或一些双子叶经济作物 , 它只能取材于叶片 , 且多
糖物质含量更高。 这些特性给泡桐 D N A 的纯化带
来很多困难。 为使用比较简单的方法 , 制备出纯度
高 、 分子量大 、 产率 高的 D N A , 选 用 了 S to ut 等
人的方法 , 并给予必要的修改。 通过低速离心分离
获得核沉淀 , 其 D N A 制品经电泳检验为单一条带 , 酶解后呈弥散状 。 朱祯等人曾用高熔点
胶 电泳分析及离心后染色分析均未检出质体 D N A 的污染1) 。 因此用这一方法纯化核 D N A ,
尽管比较繁琐 , 但效果很稳定。 用这一方法制备的揪树 、 杨树及榆树 D N A , 其分子量 、 产
率及纯度均获得了满意结果 。
实验中还发现 , 泡桐 D N A 粗制品中加入 CT A B (十六烷基三甲基澳化钱)反复沉淀, 可
1) 此结果发表在 中国科学院遗传研究所年报 , 1 9 85 年 , 1 3 3 。
4 期 孙威等 : 泡桐基因文库的构建及a Ctin 基因同源顺序的亚克隆 3 4 9
以除去一部分多糖 , 达到进一步纯化的目的。 从紫外吸收光谱的变化 , 可以看到这一结果。
这对于多糖物质含量较高的木本植物 D N A 的纯化是有必要的。
(二) 关于泡桐甚因文库的构建
本文所采用的 入E M BL : 载体 , 是从 久1 0 5 9衍生来的。 除了可以通过 Sp i十 表型的变化有
效筛选重组子的优点外 , 还消除了用 co lE I质粒型探针而造成的高本底误差 。此外 , 扭MB L :
载体的置换位点是15 个核普酸的多切点区 , 经过双酶解 , 可产生不同的粘性末端。 这样 , 在
不回收双臂直接连接的情况下 , 减少了中间片段与外源D N A 片段的竞争机会。
重组噬菌体由于缺失了 red ga m 基因 , 成为 Sp i一 表型 , 可以侵染 P : 溶 源菌 , 非重组
噬菌体便会被淘汰。 这种不用分离双臂的技术操作简单 , 而且重组后 , 如果重组位点消失 , 邻
近的位点将会切出插入的外源 D N A 片段 。
一个基因库构建的成功与否 , 不仅在于噬菌斑的多少和重组值的大小 , 更在于能否从这
个基因库中获得所需要的基因。 为此 , 我们以 ac ti n 基因为探针 , 对泡桐基因 组的同源顺序
进行了分离 , 并获得了可信赖的结果。 这一实验不仅验证了基因库的有效性 , 而且证明动物
ac tin 基因在木本植物基因组中具有一定的同源性。
参 考 文 献
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3 5 0 林 业 科 学 研 究 3 卷
CO NST R UCT !ON OF PAULOW N !A G E NOME L !B R AR Y
AND SUB CLONING O F TH E SPE C !AL D NA FR AG ME NT
H OMOLOG OU S T O ACT IN G E NE
S u n W e i K o n g Fa
n r u i L in Y o u g a n g L i Jig e n g
(I 。 : tf诊u re o f C 。 , e ti‘ , , 月。。d e 二fa s ‘。f。a )
A b s tr a e t T h is w o r k 13 e o nc e r n e d in the e ons tr u e t io n o f g e n om e libra r y o f
a r es is ta n t s tr a in o f P a u lo留n ia t o m e n t o sa to m 卯 o Pla s m a lik e o r妞n ism s (MLO ) 。
L a r g e r and
o m D N A fr a g m e n ts a r e jo in e d to p ha g e la m bd a E M B L
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its Po lylin ke r
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T h e r e e o m b ina n t m o lec u les a r e 阳eka g e d in to E . e o li L E 3 9 2 in
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T h e e ffie ienc y o f 1
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U sin g
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B y res tr ie tio n e nd
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K e y w o r d s Pa u lo w n ia ; g e n o m e lib ra r y ; Ph a g e lam bd a E MB L
: v e e to r ; a e tin
g e l e
赴土耳其考察造林及水土保持工程简介
根据中土两国政府签署的科技交流协议 , 国家科委批准并资助由林业部中国林业科学研
究院副研究员马文元 、助理研究员兰再平组团 , 赴土耳其进行造林及水土保持工程学术考察 。
自1 9 9。年 5 月24 日至 6 月 7 日 , 从土耳其的安那托力亚高原中部干早区向南到托鲁斯山脉 ,
经地中海沿岸 向西到爱琴海沿岸和安那托力亚高原西端的群山区 , 先后对安卡拉(A n kar a) ,
阿弗昂 (A fyo n )、 康雅 (K o n ya )、 布桑弟 (Po z a n 七i)、 塔苏斯 (Ta r s u s ) 、 阿达那 (A d a n a ) 、
阿那木尔 (A n am u r )、 阿拉尼亚 (A la n y a ) 、 安塔利亚 (A n ta ly a ) 、 布尔顿 (B u r du r ) 、 丹尼
斯利 (D eni zl i) 、 伊斯米尔 (Iz m ir ) 12 个省的树种组成及分布、 苗圃 、 造林项 目、 水土保持
工程、 沿海治沙及防护林工程及部分天然林进行了广泛的实地考察和学术交流 , 考察团所到之
处 , 都有土方林业技术人员的陪同 , 并受到土耳其林业总局下属的各级单位的热情招待 。圆满
地完成了预定的计划 。 通过这次考察 , 对土耳其内陆干早地汉的树种选择、 育苗造林技术 ,
对山区以工程措施和生物措施相结合的水土流失治理方法 , 对地中海沿岸沙地和流动沙丘的
固定方法 、 防护林营造技术、 树种结构等内容都有了比较详细的了解 , 从中学习到很多成功
的技术和经验 。 (冉)