全 文 ：林 业科学 研究


,






一













泡桐组培苗丛枝病原体


检测 ’
王克 日 庞 辉
关键词 泡桐 、 类菌原体 、

 检测
泡桐







’




是优 良的速生用材树种 , 在我国总栽植量达
亿株 。 泡桐丛枝病
是泡桐最重要的病害 , 在我国泡桐主栽 区 , 平均 发病率约

, 造成严重的危害
 , 已成为泡
桐发展的主要障碍 。 病原类菌原体严格寄生于寄主植物韧皮部 , 不能进行体外培养 , 无法用柯
赫氏法则进行检测 。 多年来 , 我国一直沿用传统的电镜检测和组织化学检测〔’」, 这些方法检测
灵敏度较低 , 不能满足植物检疫的要求 。 血清学方法 由于难以获得高纯度的

 抗原 , 很难
制备高效价的抗血清〔, 一 日〕。 分子克隆在泡桐丛枝病病原检测方面虽已取得一定进展 , 但尚不能
应用于实践 。 因此泡桐丛枝病类菌原体的检测成为泡桐丛枝病研究的关键环节 。
近年发展起来的








 !












技术为病害诊断提供了高灵敏度的检
测方法 。 它是在

合成聚合酶


 聚合酶
作用下 , 模拟

 体 内复制过程的体外



扩增技术 。 理论上 ,

 可以检测到一个

 分子 。



和



川研究表明 ,

 检测植
物类菌原体的灵敏度是用克隆

探针进行点杂交检测的






倍 。 本文首次报道
用

 扩增






 特殊片段检测泡桐丛枝病类菌原体研究结果 。

材料和方法





提取
从 田间采取具有泡桐丛枝病典型症状 的嫩病枝 , 通过室内组织培养获得泡桐丛枝病组培
苗 〔’
 。 泡桐健康组培苗是经过培养泡桐无病种子 , 再进行脱毒培养而得
 ’〕。 取病株样本
个 ,
健株样本
个 , 每个样本
一

。 将各样本在液氮 中研磨 , 加
 寸
提取液



 ·
一 ‘




一






,





·
一 ‘



,




·
一 ’


及适量的蛋 白酶
, 十二烷基
硫酸钠



 和十二烷基肌胺酸钠 , 在
℃水浴 中保温提取

, 离心




取上清液加

 乙醇沉淀
 。


离心后 , 用
 缓冲液溶解 , 加入少量的


及蛋 白酶
, 在


 水浴 中保温消解

。 然后加


一


拌




·
一 ’


和





,

℃保温




 。 离心取上清液 , 先用苯酚
氯仿
异戊醇





 提取 , 再用氯仿
异戊醇




提取 , 然后加入
 乙醇沉淀 。 离心后用

“
 缓冲液溶解 , 即得较纯的


。



 ! 浓度测定
将提取的

稀释
 倍 , 用紫外分光光度计分别在



和



处测定其吸光
值 ,


和




的比值应大于


。


一
一

收稿。
王克 日助理研究员 , 庞辉
林业部泡桐研究开发中心 郑州




 。
, 本文为中国林业科学研究院


 年科学基金课题和 “八 五 ”攻关课题 “泡桐丛枝病防治技术研究”中的部分内容。 研
究工作得 到泡桐中心李宗然副研究员和中国林业科学研究院林业研究所生物技术室的大力支持
谨此致谢 。
林 业科学 研究


,






一













泡桐组培苗丛枝病原体


检测 ’
王克 日 庞 辉
关键词 泡桐 、 类菌原体 、

 检测
泡桐







’




是优 良的速生用材树种 , 在我国总栽植量达
亿株 。 泡桐丛枝病
是泡桐最重要的病害 , 在我国泡桐主栽 区 , 平均 发病率约

, 造成严重的危害
 , 已成为泡
桐发展的主要障碍 。 病原类菌原体严格寄生于寄主植物韧皮部 , 不能进行体外培养 , 无法用柯
赫氏法则进行检测 。 多年来 , 我国一直沿用传统的电镜检测和组织化学检测〔’」, 这些方法检测
灵敏度较低 , 不能满足植物检疫的要求 。 血清学方法 由于难以获得高纯度的

 抗原 , 很难
制备高效价的抗血清〔, 一 日〕。 分子克隆在泡桐丛枝病病原检测方面虽已取得一定进展 , 但尚不能
应用于实践 。 因此泡桐丛枝病类菌原体的检测成为泡桐丛枝病研究的关键环节 。
近年发展起来的








 !












技术为病害诊断提供了高灵敏度的检
测方法 。 它是在

合成聚合酶


 聚合酶
作用下 , 模拟

 体 内复制过程的体外



扩增技术 。 理论上 ,

 可以检测到一个

 分子 。



和



川研究表明 ,

 检测植
物类菌原体的灵敏度是用克隆

探针进行点杂交检测的






倍 。 本文首次报道
用

 扩增






 特殊片段检测泡桐丛枝病类菌原体研究结果 。

材料和方法





提取
从 田间采取具有泡桐丛枝病典型症状 的嫩病枝 , 通过室内组织培养获得泡桐丛枝病组培
苗 〔’
 。 泡桐健康组培苗是经过培养泡桐无病种子 , 再进行脱毒培养而得
 ’〕。 取病株样本
个 ,
健株样本
个 , 每个样本
一

。 将各样本在液氮 中研磨 , 加
 寸
提取液



 ·
一 ‘




一






,





·
一 ‘



,




·
一 ’


及适量的蛋 白酶
, 十二烷基
硫酸钠



 和十二烷基肌胺酸钠 , 在
℃水浴 中保温提取

, 离心




取上清液加

 乙醇沉淀
 。


离心后 , 用
 缓冲液溶解 , 加入少量的


及蛋 白酶
, 在


 水浴 中保温消解

。 然后加


一


拌




·
一 ’


和





,

℃保温




 。 离心取上清液 , 先用苯酚
氯仿
异戊醇





 提取 , 再用氯仿
异戊醇




提取 , 然后加入
 乙醇沉淀 。 离心后用

“
 缓冲液溶解 , 即得较纯的


。



 ! 浓度测定
将提取的
 稀释 50 倍 , 用紫外分光光度计分别在 26 0 n m 和 280 n m 处测定其吸光
值 , O D 2 6 o 和 O D 280 的比值应大于 1.8 。
1 9 9 4 一12一05 收稿。
王克 日助理研究员 , 庞辉(林业部泡桐研究开发中心 郑州 45 000 3) 。
, 本文为中国林业科学研究院 1995 年科学基金课题和 “八 五 ”攻关课题 “泡桐丛枝病防治技术研究”中的部分内容。 研
究工作得 到泡桐中心李宗然副研究员和中国林业科学研究院林业研究所生物技术室的大力支持 .谨此致谢 。
林 业科学 研究 1995 , 8 ( 2 ) : 2 1 5 一218F ore st R esearc h
泡桐组培苗丛枝病原体 P C R 检测 ’
王克 日 庞 辉
关键词 泡桐 、 类菌原体 、 P C R 检测
泡桐 (P au l0w n’a spp . )是优 良的速生用材树种 , 在我国总栽植量达 n 亿株 。 泡桐丛枝病
是泡桐最重要的病害 , 在我国泡桐主栽 区 , 平均 发病率约 50 % , 造成严重的危害[l] , 已成为泡
桐发展的主要障碍 。 病原类菌原体严格寄生于寄主植物韧皮部 , 不能进行体外培养 , 无法用柯
赫氏法则进行检测 。 多年来 , 我国一直沿用传统的电镜检测和组织化学检测〔’」, 这些方法检测
灵敏度较低 , 不能满足植物检疫的要求 。 血清学方法 由于难以获得高纯度的 M L o 抗原 , 很难
制备高效价的抗血清〔, 一 日〕。 分子克隆在泡桐丛枝病病原检测方面虽已取得一定进展 , 但尚不能
应用于实践 。 因此泡桐丛枝病类菌原体的检测成为泡桐丛枝病研究的关键环节 。
近年发展起来的P CR (Poly m erase C h ain R eaetio n )技术为病害诊断提供了高灵敏度的检
测方法 。 它是在 D N A 合成聚合酶(T aq 聚合酶)作用下 , 模拟 D N A 体 内复制过程的体外 D N A
扩增技术 。 理论上 , P c R 可以检测到一个 ON A 分子 。 Hi r uk i 和 D eng川研究表明 , P c R 检测植
物类菌原体的灵敏度是用克隆 D N A 探针进行点杂交检测的 10 ~ 10 00 倍 。 本文首次报道
用 Pc R 扩增 M LO 16 5 :D N A 特殊片段检测泡桐丛枝病类菌原体研究结果 。
1 材料和方法
1.1 DN A 提取
从 田间采取具有泡桐丛枝病典型症状 的嫩病枝 , 通过室内组织培养获得泡桐丛枝病组培
苗 〔’0] 。 泡桐健康组培苗是经过培养泡桐无病种子 , 再进行脱毒培养而得 [l ’〕。 取病株样本 3 个 ,
健株样本 1 个 , 每个样本 3一 5 9 。 将各样本在液氮 中研磨 , 加 DI 寸A 提取液 10 m m ol · L 一 ‘
T r i s 一 H e l p H s
.
o
,
2 5 0 m m
o
l
·
L
一 ‘ N a e l
,
1 0 0 m m
o
l
·
L
一 ’E D T A ) 及适量的蛋 白酶 K , 十二烷基
硫酸钠(SD S) 和十二烷基肌胺酸钠 , 在 5 ℃水浴 中保温提取 l h , 离心 (3 00 9 )取上清液加
95 % 乙醇沉淀 D N A 。 1 6 0 9 离心后 , 用 T E 缓冲液溶解 , 加入少量的 SD S 及蛋 白酶 K , 在 37
oC 水浴 中保温消解 l h 。 然后加 100一2 00 拌L S m o l · L 一 ’ N a C I 和 10 % C T A B , 6 5 ℃保温 10
m in 。 离心取上清液 , 先用苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (2 5 : 24 : 1) 提取 , 再用氯仿 :异戊醇 (2 4 : 1)
提取 , 然后加入 95 % 乙醇沉淀 。 离心后用 10 “L T E 缓冲液溶解 , 即得较纯的 D N A 。
1
.
2 D N A 浓度测定
将提取的 D N A 稀释 50 倍 , 用紫外分光光度计分别在 26 0 n m 和 280 n m 处测定其吸光
值 , O D 2 6 o 和 O D 280 的比值应大于 1.8 。
1 9 9 4 一12一05 收稿。
王克 日助理研究员 , 庞辉(林业部泡桐研究开发中心 郑州 45 000 3) 。
, 本文为中国林业科学研究院 1995 年科学基金课题和 “八 五 ”攻关课题 “泡桐丛枝病防治技术研究”中的部分内容。 研
究工作得 到泡桐中心李宗然副研究员和中国林业科学研究院林业研究所生物技术室的大力支持 .谨此致谢 。
林 业 科 学 研 究 8 卷
0.1,曰1,
1 3
l 4
S 让山a R C , C h i y
ko
w
s 址 L N . P u rific a tio n a n d se ro lo g iea l d e tee tio n o f m y eo p la s ma lik e o rg an is m s f ro m p la n ts a ffe eted
b y p e aeh e a ster n X d is e ase .山。. J . P la n t P a tho l. , 1 9 8 4 , 6 ( 2 ) : 2 0 0 一205.
氏ng S J, H ir u k i C . Ge ne ti e r e l a t e d n e s s b e t w e e n t w o n o n e u l t u r a b l e m y e o p l a s ma l i k e o r g a n i s m s r e v e a l e d b y n u e l e i e
a e
i d h y b
r
id 画tion and po lym erase eha in reaetion.Phytopathology , 1 9 9 1 , 8 1 ( 1 2 ) : 1 4 7 5 一14 7 9 .
王克日.植物病毒病、类菌原体病害药物防治研究新方法 .河南农业科学 , 19 94 , (3 ) : 40 .
孙福生 , 张锡津 , 田国忠.泡桐丛枝病脱毒组培苗电子显微镜检测.林业科学研究 , 19 93 , 6 ( 4) : 4 70 ~ 4 7 2.
De
n g S J
,
H i
r u
k i C
.
E
n
h
a n e e
d d
e t e e t
io
n o
f
a p l
a n t p a t h
o g e n i
e
m y
e o p l
a s
m
a
l i k
e o r g a n i
s
m
s
b y p
o
l y m
e r a s e e
h
a
i
n r e a e -
t
io
n
.
P
r
oc
.
J
a p a n A
e a
d
. ,
1 9 9 0
,
6 6 B ( 7 )
:
1 4 0 ~ 1
4 4
.
L
e e
l
一
M
,
H
a
m
mo
n
d R W
,
D
a v
i
s
R E
, e t a l
.
U
n
i
v e r s a
l
a
m p l i f i
e a t
i
o n a n
d
a n a
l y
s
i
s o
f p
a t
h
o g e n 1 6 5
r
D N A fo
r e
l
a s s
i f i
e a -
t
io
n a n
d i d
e n t
i f i
e a t
i
o n o
f m y
e o p l
a s
m
a
l i k
e o r g a 苗s m s. P h y to pa th o lo g y , 1 9 9 3 , 8 3 ( 8 ) : 5 5 4 ~ 8 4 2 .
K ir k p
a t
ri
e
k B C
.
M
o
l
e e u
l
a r a n
d g
e n e t
i
e p e r s
Pe
c t i
v e s
.
Vo
l
.
3
.
e
d
s :
K
o s u g e T
,
N
e s t e r
E
W
,玩:P lant一M i e r o b e I n t e r a e -
t i o n s
.
N e w Y o r k : M e G r a w
一
H i l l
,
1 9 8 9
.
2 4 1 ~ 2 9 3
.
D
e
t
e c
t i
o n o
f
M
y
c o
P l
a s
m
a
l i k
e
O
r
g
a n
i
s
m A
s s o e
i
a
t
e
d
w i t h P
a u
l
o w n i
a
T i
s s u e
C
u
l t
u r e
W
i t
e
h
e s
‘一 B r o o m
b y P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ( P C R )
W a n g K e ri P a n g H
u i
A b s t r a e t T h e p o l y m e r a s e e h a i n r e a e t io n ( P C R ) w a s s u e e e s s f u l l y e m p l o y e d t o d e v e l o p a
s p e e i f ic a s s a y f o r p l a n t p a t h o g e n ic m y e o p l a s m a l i k e o r g a n i s m a s s o e i a t e d w i t h p a u l o w n ia
w i t e h e s ‘
一
b r o o m ( P W B )
.
A 1
.
2 k b D N A f r a g m e n t w a s a m p l i f i e d f r o m D N A e x t r a e t e d f
r o m
P W B d i
s e a s e d P a u l o w n i a t i s s u e e u l t u r e b y P C R
.
N o a m P l i f i e d D N A w a s d e t e e t e d f r o m
h e a l t h y p a u l o w n i a s a m p l e
.
A m i n i m u m o f o n l y 2
.
5 p g t o t a l n u e l e i e a e i d s f r o m P W B M L O
一
i n
-
f e e t e d p a u l o w n i a t i s s u e c u l t u r e w e r e n e e d e d t o d e t e e t P W B M L O w h
e n a 1
.
2 k b D N A f r a g
-
m e n t w a s a m p l i f i e d b y P C R
.
R e s u l t s s h o w e d t h a t D N A a m p l i f i e a t i o n b y P C R w a s a h i g h
s e n s i t i v e m e t h o d i n de
t e e t i n g P W B M L O
.
K e y
wo
r d s P a u l
OW
n 伍 , m y e o p l a s m a l i k e o r g a n i s m , p o l y m e r a s e e h a i n r e a e t i o n d e t e e t i o n
w
a n g K
e r
i
,
A
s s
i
s t a n r
P
r o
f
e s s o
r ,
p
a n g H
u
i ( P
a u
l
o
w ni
a
R
e s e a r e
h C
e n t e r o
f C h i
n a
Z h
e i l g
z
h
o u
4 5 0 0 0 3 )
.